Name: measuring g-protein-coupled receptor signaling via radio-labeled gtp binding
Uploaded: 2017-06-09T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring G-protein-coupled Receptor Signaling via Radio-labeled GTP Binding at JoVE.com

Эта работа была поддержана Национальным институтом здравоохранения грантом DA-000266 и грантом программы T32 для медицинских ученых (CV, NWZ и PCS). Авторы также хотели бы признать somersault18: 24 (somersault1824.com) для Библиотеки наук и медицинских иллюстраций.

1. Экспрессия рекомбинантного HA-MOR1 в культивируемых клетках ПРИМЕЧАНИЕ. Следуйте всем протоколам клеточной культуры в стерильном ламинарном вытяжном шкафу. <ol><li> Стерилизуйте ламинарный вытяжной колпачок клеточной культуры с помощью 70% этанола и поддерживайте стерил?...

<ol>
	<li>Kobilka, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G+protein+coupled+receptor+structure+and+activation.">G protein coupled receptor structure and activation.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1768 (4), 794-807 (2007).</li><li>Neubig, R. R., Siderovski, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulators+of+G-protein+signalling+as+new+central+nervous+system+drug+targets.">Regulators of G-protein signalling as new central nervous system drug targets.</a> Nat. Rev. Drug Discov 1. (3), 187-197 (2002).</li><li>Overington, J. P., Al-Lazikani, B., Hopkins, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+many+drug+targets+are+there?.">How many drug targets are there?.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 5 (12), 993-996 (2006).</li><li>Buck, L., Axel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+multigene+family+may+encode+odorant+receptors:+a+molecular+basis+for+odor+recognition.">A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition.</a> Cell. 65 (1), 175-187 (1991).</li><li>Kobilka, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning,+sequencing,+and+expression+of+the+gene+coding+for+the+human+platelet+alpha+2-adrenergic+receptor.">Cloning, sequencing, and expression of the gene coding for the human platelet alpha 2-adrenergic receptor.</a> Science. 238 (4827), 650-656 (1987).</li><li>Palczewski, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+rhodopsin:+A+G+protein-coupled+receptor.">Crystal structure of rhodopsin: A G protein-coupled receptor.</a> Science. 289 (5480), 739-745 (2000).</li><li>Neer, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterotrimeric+c+proteins:+organizers+of+transmembrane+signals.">Heterotrimeric c proteins: organizers of transmembrane signals.</a> Cell. 80 (2), 249-257 (1995).</li><li>Londos, C., Salomon, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5'-Guanylylimidodiphosphate,+a+Potent+Activator+of+Adenylate+Cyclase+Systems+in+Eukaryotic+Cells.">5'-Guanylylimidodiphosphate, a Potent Activator of Adenylate Cyclase Systems in Eukaryotic Cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 71 (8), 3087-3090 (1974).</li><li>Ross, E. M., Gilman, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolution+of+Some+Components+of+Adenylate-Cyclase+Necessary+for+Catalytic+Activity.">Resolution of Some Components of Adenylate-Cyclase Necessary for Catalytic Activity.</a> J. Biol. Chem. 252 (20), 6966-6969 (1977).</li><li>Stadel, J. M., Nambi, P., Shorr, R., Sawyer, D. F., Caron, M. G., Lefkowitz, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catecholamine-Induced+Desensitization+of+Turkey+Erythrocyte+Adenylate-Cyclase+Is+Associated+with+Phosphorylation+of+the+Beta-Adrenergic-Receptor.">Catecholamine-Induced Desensitization of Turkey Erythrocyte Adenylate-Cyclase Is Associated with Phosphorylation of the Beta-Adrenergic-Receptor.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 80 (11), 3173-3177 (1983).</li><li>Wilden, U., Kuhn, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-Dependent+Phosphorylation+of+Rhodopsin+-+Number+of+Phosphorylation+Sites.">Light-Dependent Phosphorylation of Rhodopsin - Number of Phosphorylation Sites.</a> Biochemistry. 21 (12), 3014-3022 (1982).</li><li>Lohse, M., Benovic, J., Codina, J., Caron, M., Lefkowitz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=beta-Arrestin:+a+protein+that+regulates+beta-adrenergic+receptor+function.">beta-Arrestin: a protein that regulates beta-adrenergic receptor function.</a> Science. 248 (4962), 1547-1550 (1990).</li><li>Leftowitz, R. J., Shenoy, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transduction+of+receptor+signals+by+beta-arrestins.">Transduction of receptor signals by beta-arrestins.</a> Science. 308 (5721), 512-517 (2005).</li><li>Lefkowitz, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Historical+review:+a+brief+history+and+personal+retrospective+of+seven-transmembrane+receptors.">Historical review: a brief history and personal retrospective of seven-transmembrane receptors.</a> Trends Pharmacol. Sci. 25 (8), 413-422 (2004).</li><li>Salah-Uddin, H., Thomas, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+assessment+of+m1+muscarinic+acetylcholine+receptor-gq/11+protein+coupling+in+membranes+prepared+from+postmortem+human+brain+tissue.">Pharmacological assessment of m1 muscarinic acetylcholine receptor-gq/11 protein coupling in membranes prepared from postmortem human brain tissue.</a> J. Pharm. Exp. Ther. 325 (3), 869-874 (2008).</li><li>Yung-Chi, C., Prusoff, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+the+inhibition+constant+(K1)+and+the+concentration+of+inhibitor+which+causes+50+per+cent+inhibition+(I50)+of+an+enzymatic+reaction.">Relationship between the inhibition constant (K1) and the concentration of inhibitor which causes 50 per cent inhibition (I50) of an enzymatic reaction.</a> Biochem. Pharmacol. 22 (23), 3099-3108 (1973).</li><li>Lazareno, S., Birdsall, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimation+of+competitive+antagonist+affinity+from+functional+inhibition+curves+using+the+Gaddum,+Schild+and+Cheng-Pruso&#237;f+equations.">Estimation of competitive antagonist affinity from functional inhibition curves using the Gaddum, Schild and Cheng-Pruso&#237;f equations.</a> Br. J. Pharmacol. 109 (4), 1110-1119 (1993).</li><li>Mar&#233;chal, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+5,+Measuring+Bioactivity:+KI,+IC50+and+EC50.">Chapter 5, Measuring Bioactivity: KI, IC50 and EC50.</a> Chemogenomics and Chemical Genetics. , 55-65 (2011).</li><li>Salah-Uddin, H., Thomas, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+Assessment+of+M1+Muscarinic+Acetylcholine+Receptor-Gq/11+Protein+Coupling+in+Membranes+Prepared+from+Postmortem+Human+Brain+Tissue.">Pharmacological Assessment of M1 Muscarinic Acetylcholine Receptor-Gq/11 Protein Coupling in Membranes Prepared from Postmortem Human Brain Tissue.</a> J. Pharm. Exp. Ther. 325 (3), 869-874 (2008).</li><li>Milligan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles:+extending+the+utility+of+[35S]GTP+gamma+S+binding+assays.">Principles: extending the utility of [35S]GTP gamma S binding assays.</a> Trends. Pharmacol. Sci. 24 (2), 87-90 (2003).</li><li>Harrison, C., Traynor, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+[35S]GTPgammaS+binding+assay:+approaches+and+applications+in+pharmacology.">The [35S]GTPgammaS binding assay: approaches and applications in pharmacology.</a> Life Sci. 74 (4), 489-508 (2003).</li><li>Traynor, J. R., Nahorski, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+by+mu-opioid+agonists+of+guanosine-5'-O-(3-[35S]thio)triphosphate+binding+to+membranes+from+human+neuroblastoma+SH-SY5Y+cells.">Modulation by mu-opioid agonists of guanosine-5'-O-(3-[35S]thio)triphosphate binding to membranes from human neuroblastoma SH-SY5Y cells.</a> Mol. Pharmacol. 47 (4), 848-854 (1995).</li><li>Sittampalam, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GTP&#947;S+Binding+Assays.">GTP&#947;S Binding Assays.</a> Assay Guidance Manual. , (2004).</li><li>Strange, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+GTP&#947;S+([35S]GTP&#947;S+and+Eu-GTP&#947;S)+binding+assay+for+analysis+of+ligand+potency+and+efficacy+at+G+protein-coupled+receptors.">Use of the GTP&#947;S ([35S]GTP&#947;S and Eu-GTP&#947;S) binding assay for analysis of ligand potency and efficacy at G protein-coupled receptors.</a> Br. J. Pharmacol. 161 (6), 1238-1249 (2010).</li></ol>

В настоящем протоколе описаны два отдельных, но взаимодополняющих метода: простой подход к фракционированию клеток и тканей в широкие, но четкие отсеки и средство для исследования передачи сигналов GPCR путем измерения связывания [ 35 S] GTPγS. Эффективное клеточное фр?...

G-протеин-связанные рецепторы (GPCRs) представляют собой большое семейство рецепторов клеточной поверхности, ответственных за замечательный массив физиологических процессов, включая анальгезию, обоняние и поведение 1 . GPCR действуют путем определения специфических внешних сигналов и впоследствии стимулируют внутриклеточную сигнализацию. Поэтому они отмечают ключевое соединение между внешней и внутренней средами ячейки. Из-за важной роли GPCRs в биологии они стали основными целями как для фундаментальных исследований , так и для открытия лекарств 2 , 3 . В отличие от других семейств рецепторов, которые связывают дискретные лиганды, GPCR могут связывать очень разные типы молекул. В то время как один GPCR может взаимодействовать с пептидами, другой может воспринимать фотоны, малые молекулы или ионы 1 , 4 . Хотя их лиганды разнообразны, GPCRs объединены в своем общем архитектореUre и функции. Отдельные GPCR состоят из семи α-спиральных трансмембранных белков с внеклеточными аминоконцами и внутриклеточными карбоксильными терминалами 5 , 6 . GPCRs связаны с внутриклеточными G-белками-гетеротримерными белковыми комплексами, состоящими из α, β и γ-субъединиц, которые опосредуют различные сигнальные пути 7 . G-субъединица представляет собой гуанин-нуклеотидсвязывающий белок, который неактивен при связывании с гуанозиндифосфатом (ВВП) и активен при связывании с гуанозинтрифосфатом (ГТФ) 8,9 . Когда GPCR связывают свои лиганды, они подвергаются конформационному изменению, которое позволяет G α диссоциировать из G βγ , тем самым позволяя G α обменивать ВВП для GTP 7 . Сам рецептор фосфорилируется на своем карбоксильном конце различными серинами / треонамиIne kinases 10 , 11 и интернализуется для ослабления сигнализации 12 , 13 , 14 рецептора. Между тем активированный Gα-мономер и димер G βγ продолжают активировать различные сигнальные пути 7 . Существует несколько изоформ каждой субъединицы G-белка, и каждая изоформа нацелена на конкретные нисходящие пути и системы вторичных мессенджеров. Основные изоформы Gα включают G s , G q , G i / o и G 12-13 . Как правило, отдельные GPCR ассоциируются с конкретной изоформой G α , тем самым связывая внешний раздражитель с конкретным клеточным ответом 1 . Характеристика взаимодействия GPCR-лиганда имеет решающее значение для понимания биологии рецептора. Поскольку обмен ВВП / ГТФ является одним из первыхNts, который следует за связыванием лиганда, мониторинг связывания GTP может измерять активацию или ингибирование GPCR. Анализ большего количества событий в нисходящем потоке в сигнале GPCR часто не является количественным или стехиометрическим, не может отличить полных агонистов от частичных и может потребовать дорогостоящих реагентов. Более того, увеличение связывания GTP с G α- белками является почти универсальным событием после активации GPCR, что означает, что измерение связывания GTP является широко применимым анализом для мониторинга активности большинства GPCR. Измерение связывания GTP является простым и быстрым подходом к мониторингу передачи сигналов GPCR в клетках, сверхэкспрессирующих рецептор, представляющий интерес, или в нативной ткани. В настоящем протоколе подробно описывается анализ функционального GTP-связывания с использованием архетипического GPCR, μ-опиоидного рецептора (MOR1), чтобы количественно определить активность агониста и антагониста при передаче сигналов GPCR. В этом протоколе впервые описывается, как изолировать сырые мембраны от клеток, сверхэкспрессирующих MOR1. Обратите внимание, чтоЭтот протокол не ограничивается системами сверхэкспрессии и может быть применен ко многим источникам мембраны, включая нативную ткань или препараты, экспрессирующие множественные рецепторы и G-белки 15 . Затем в протоколе подробно описывается, как измерять связывание радиоактивного аналога GTP с этими мембранами в ответ на различные концентрации [D-Ala, N-MePhe, Gly-ol] -энкефалина (ДАМГО) или налоксона, агониста и антагониста MOR1, соответственно. Аналог GTP [ 35 S] гуанозин-5&#39;-O- (3-тио) трифосфат ([ 35 S] GTPγS) негидролизуется. Это свойство имеет решающее значение, так как G α- субъединицы проявляют внутреннюю активность GTPase 7 и устраняют меченый гамма-фосфат на гидролизуемом радиотеке GTP. Мембраны затем захватывают на стекловолоконные фильтры и промывают, после чего радиоактивно меченный ГТП определяют количественно с помощью жидкостного сцинтилляционного счета. Множественные фармакологические параметры могут быть получены для характеристикиE) взаимодействие рецептора с лигандом, включая полумаксимальный ответ (EC 50 ) и коэффициент Хилла (n H ) для агонистов и полумаксимальную ингибирующую концентрацию (IC 50 ) и константу равновесной диссоциации (K b ) для антагонистов 16 , 17 , 18 .

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1034">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:463px;">DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine</td>
			<td style="width:189px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">10313021</td>
			<td style="width:264px;">Warm in 37&#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:463px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:189px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">25030081</td>
			<td>Warm in 37&#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:463px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:189px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">15140122</td>
			<td>Warm in 37&#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:463px;">Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td style="width:189px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">31985070</td>
			<td>Warm in 37&#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:463px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:189px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">16000044</td>
			<td>Warm in 37&#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:463px;">Cell culture 10-cm plate</td>
			<td style="width:189px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">CLS430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:463px;">Lipofectamine 3000 reagent</td>
			<td style="width:189px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">L3000-008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:463px;">1.6 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:189px;">USA Scientific</td>
			<td style="width:119px;">1615-5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:463px;">4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)</td>
			<td style="width:189px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:463px;">Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Trizma base)</td>
			<td style="width:189px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP152-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:463px;">ethylene glycol-bis(&#946;-aminoethyl ether)-N,N,N&#39;,N&#39;-tetraacetic acid (EGTA)</td>
			<td style="width:189px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:463px;">Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td style="width:189px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:463px;">Sucrose</td>
			<td style="width:189px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S5016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:463px;">cOmplete ULTRA Tablets, Mini, EASYpack Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td style="width:189px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">2900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:463px;">DL-Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td style="width:189px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">DO632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:463px;">Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td style="width:189px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP358-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:463px;">Magnesium chloride (MgCl2)</td>
			<td style="width:189px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M1028-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:463px;">Pellet pestles motor</td>
			<td style="width:189px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Z359971</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:463px;">Pestles</td>
			<td style="width:189px;">Bel Art</td>
			<td style="width:119px;">F19923-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:463px;">Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td style="width:189px;">Affymetrix</td>
			<td align="right" style="width:119px;">10857</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">[35S]guanosine-5&#8217;-O-(3-thio)triphosphate ([35S]GTP&#947;S)&#160;</td>
			<td style="width:189px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:119px;">NEG030H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">non-radiolabeled guanosine-5&#8217;-O-(3-thio)triphosphate (GTP&#947;S)&#160;</td>
			<td style="width:189px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">89378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">guanosine diphosphate (GDP)</td>
			<td style="width:189px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">51060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:463px;">Bradford reagent</td>
			<td style="width:189px;">Bio-Rad</td>
			<td align="right" style="width:119px;">5000006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:463px;">UV/VIS spectrophotometer</td>
			<td style="width:189px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">DU640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:463px;">spectrophotometer cuvettes</td>
			<td style="width:189px;">USA Scientific</td>
			<td style="width:119px;">9090-0460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:463px;">orbital shaker</td>
			<td style="width:189px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">2314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:463px;">thermomixer</td>
			<td style="width:189px;">Eppendorf</td>
			<td align="right" style="width:119px;">535027903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">glass fiber filters&#160;</td>
			<td style="width:189px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">1821-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">vacuum filtration apparatus</td>
			<td style="width:189px;">Millipore Corporation</td>
			<td style="width:119px;">XX2702550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:463px;">desktop microcentrifuge</td>
			<td style="width:189px;">Eppendorf</td>
			<td align="right" style="width:119px;">65717</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:463px;">Scintillation counter</td>
			<td style="width:189px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">LS6500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">scintillation fluid&#160;</td>
			<td style="width:189px;">Ecoscint A</td>
			<td style="width:119px;">LS-273</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">scintillation counter vials</td>
			<td style="width:189px;">Beckman Coulter</td>
			<td align="right" style="width:119px;">592690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">scintillation vial lids</td>
			<td style="width:189px;">Beckman Coulter</td>
			<td align="right" style="width:119px;">592928</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:463px;">Prism 6</td>
			<td style="width:189px;">GraphPad Software</td>
			<td style="width:119px;">PRISM 6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:463px;">ATP1A1 antibody</td>
			<td style="width:189px;">Developmental Studies Hybridoma</td>
			<td style="width:119px;">a6F</td>
			<td>1:1000 in 3% BSA</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:463px;">GAPDH antibody</td>
			<td style="width:189px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:119px;">CB1001</td>
			<td>1:5000 in 3% BSA</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:463px;">H2B antibody</td>
			<td style="width:189px;">Cell Signaling</td>
			<td style="width:119px;">2934S</td>
			<td>1:2500 in 3% BSA</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:463px;">PDI antibody</td>
			<td style="width:189px;">Cell Signaling</td>
			<td style="width:119px;">3501S</td>
			<td>1:1000 in 3% BSA</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:463px;">HA antibody</td>
			<td style="width:189px;">Roche</td>
			<td align="right" style="width:119px;">11867423001</td>
			<td>1:2000 in 3% BSA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring g-protein-coupled receptor signaling via radio-labeled gtp binding

G-протеин-связанные рецепторы (GPCRs) представляют собой большое семейство трансмембранных рецепторов, которые играют критическую роль в нормальной клеточной физиологии и составляют основную фармакологическую цель для множественных показаний, включая аналгезию, регулирование артериального давления и лечение психических заболеваний. После связывания лиганда GPCR катализируют активацию внутриклеточных G-белков, стимулируя включение гуанозинтрифосфата (GTP). Активированные G-белки затем стимулируют сигнальные пути, которые вызывают клеточные реакции. Передача сигналов GPCR может контролироваться путем измерения включения радиоактивно меченной и негидролизуемой формы GTP, [ 35 S] гуанозин-5&#39;-O- (3-тио) трифосфата ([ 35 S] GTPγS) в G-белки. В отличие от других методов, которые оценивают более длительные процессы сигнализации, связывание [ 35 S] GTPγS измеряет проксимальное событие в передаче сигналов GPCR и, что важно, может различать агонидыTs, антагонисты и обратные агонисты. В настоящем протоколе описывается чувствительный и специфический метод изучения передачи сигналов GPCR с использованием сырых мембранных препаратов архетипического GPCR, μ-опиоидного рецептора (MOR1). Хотя существуют альтернативные подходы к фракционированию клеток и тканей, многие из них являются дорогостоящими, утомительными и / или требуют нестандартного лабораторного оборудования. Настоящий метод обеспечивает простую процедуру, которая обогащает функциональные сырые мембраны. После выделения MOR1 определяли различные фармакологические свойства его агониста [D-Ala, N-MePhe, Gly-ol] -энкефалина (DAMGO) и антагониста налоксона.

Фракционирование клеток можно использовать для выделения и обогащения мембранно-ассоциированных белков из цитозольных и ядерных белков. Рисунок 1 представляет собой вестерн-блоттинг, демонстрирующий содержание трех первичных фракций, которые могут...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring G-protein-coupled Receptor Signaling via Radio-labeled GTP Binding at JoVE.com

Measuring G-protein-coupled Receptor Signaling via Radio-labeled GTP Binding

Связывание гуанозинтрифосфата (GTP) является одним из самых ранних событий активации G-протеин-связанного рецептора (GPCR). Этот протокол описывает, как фармакологически характеризуют специфические взаимодействия GPCR-лиганда путем контроля связывания радиомеченного GTP-аналога, [ 35 S] гуанозин-5&#39;-O- (3-тио) трифосфата ([ 35 S] GTPγS), в Ответ на лиганд, представляющий интерес.

Измерение сигнальной связи рецептора с G-белком с помощью радиомаркированного связывания GTP

G-Protein-Coupled Receptors (GPCRs) are a large family of transmembrane receptors that play critical roles in normal cellular physiology and constitute a ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biochemistry

Cell Biology

Pharmacology

Unit 1

Pharmacodynamics

Signaling Networks of G Protein-coupled Receptors

SCIENTISTS IN ACTION

Quantification of Bacterial Histidine Kinase Autophosphorylation Using a Nitrocellulose Binding Assay

Количественное Бактериальный гистидинкиназа Автофосфорилирование Использование Nitrocellulose Анализ на связывание

We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their ...

Measuring Protein Binding to F-actin by Co-sedimentation

Измерение связывания белка с F-актином путем совместного осаждения

Filamentous actin (F-actin) organization within cells is regulated by a large number of actin-binding proteins that control actin nucleation, growth, ...

Measuring Biomolecular DSC Profiles with Thermolabile Ligands to Rapidly Characterize Folding and Binding Interactions

Измерения биомолекулярных DSC профили с термолабильных лигандами быстро характеризовать складывания и привязки взаимодействия

Differential scanning calorimetry (DSC) is a powerful technique for quantifying thermodynamic parameters governing biomolecular folding and binding ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Пробоподготовка для массы на основе спектрометрии идентификации RNA-связывая регионов

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Method for Efficient Refolding and Purification of Chemoreceptor Ligand Binding Domain

Метод эффективного складывая и очистки Хеморецепция лигандом привязки домена

Identification of natural ligands of chemoreceptors and structural studies aimed at elucidation of the molecular basis of the ligand specificity can be ...

Detection of Small GTPase Prenylation and GTP Binding Using Membrane Fractionation and  GTPase-linked Immunosorbent Assay

Обнаружение малых ГТФазы Prenylation и GTP привязки с помощью мембраны фракционирования и ГТФазы-Assay иммуносорбента

The Rho GTPase family belongs to the Ras superfamily and includes approximately 20 members in humans. Rho GTPases are important in the regulation of ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Диссипативных Microgravimetry для изучения динамики привязки фосфолипидного связывая протеин Annexin A2 в твердой поддержке липидов бислоев с помощью кварцевого резонатора

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

Внеклеточный протеин технология Microarray для высокой пропускной способности обнаружения низкого сродства рецептор лиганд взаимодействий

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

Production, Crystallization, and Structure Determination of the IKK-binding Domain of NEMO

Производство, кристаллизация и структурное определение мкножеского домена NEMO, имеющего обязательную силу IKK

NEMO is a scaffolding protein which plays an essential role in the NF-&#954;B pathway by assembling the IKK-complex with the kinases IKK&#945; and ...

Measuring Nucleotide Binding to Intact, Functional Membrane Proteins in Real Time

Измерение связывания нуклеотидов с интактными функциональными мембранными белками в режиме реального времени

We have developed a method to measure binding of adenine nucleotides to intact, functional transmembrane receptors in a cellular or membrane environment. ...