Name: a 5-mc dot blot assay quantifying the dna methylation level of chondrocyte dedifferentiation in vitro
Uploaded: 2017-05-17T13:00:00
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Questo lavoro è stato sostenuto dalle seguenti sovvenzioni: Science Foundation of China (No. 81572198, No. 81260161, No. 81000460); Fondazione della Scienza Naturale della provincia di Guangdong, Cina (No. 2015A030313772); Progetto finanziato dalla Fondazione della scienza postduttorica cinese (n. 2013M530385); La Fondazione di ricerca medica della provincia di Guangdong, Cina (n. A2016314); Shenzhen Science and Technology Projects (No. JCYJ20160301111338144; No. JSGG20151030140325149; No. JSGG20140519105550503; No.GJHZ20130412153906739; No. JCYJ20140414170821160; No.JCYJ20140414170821200).

Questo studio è stato approvato dal Comitato Etico Umano di Shenzhen Second People&#39;s Hospital. 1. Raccolta dei tessuti di cartilagine articolare umana e cultura condrocitica <ol><li> Preparazione dei materiali <ol><li> Preparare il mezzo modificato Dulbecco&#39;s medium di aquila (DMEM) integrato con 10% di siero fetale fetale e 1% di penicillina-streptomicina. Preparare 1 mg / mL collagenasi II, 0,25% trypsin-EDTA, salina fosfata-bufferata (PBS) e un filtro cellulare...

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	<li>Brittberg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+deep+cartilage+defects+in+the+knee+with+autologous+chondrocyte+transplantation.">Treatment of deep cartilage defects in the knee with autologous chondrocyte transplantation.</a> N Engl J Med. 331, 889-895 (1994).</li><li>Pareek, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-Term+Outcomes+After+Autologous+Chondrocyte+Implantation:+A+Systematic+Review+at+Mean+Follow-Up+of+11.4+Years.">Long-Term Outcomes After Autologous Chondrocyte Implantation: A Systematic Review at Mean Follow-Up of 11.4 Years.</a> Cartilage. 7 (4), 298-308 (2016).</li><li>Duan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokine+networking+of+chondrocyte+dedifferentiation+in+vitro+and+its+implications+for+cell-based+cartilage+therapy.">Cytokine networking of chondrocyte dedifferentiation in vitro and its implications for cell-based cartilage therapy.</a> Am J Transl Res. 7 (2), 194-208 (2015).</li><li>Ma, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+profiling+of+dedifferentiated+human+articular+chondrocytes+in+monolayer+culture.">Gene expression profiling of dedifferentiated human articular chondrocytes in monolayer culture.</a> Osteoarthritis Cartilage. 21 (4), 599-603 (2013).</li><li>Duan, L., Liang, Y., Ma, B., Zhu, W., Wang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+regulation+in+chondrocyte+phenotype+maintenance+for+cell-based+cartilage+repair.">Epigenetic regulation in chondrocyte phenotype maintenance for cell-based cartilage repair.</a> Am J Transl Res. 7 (11), 2127-2140 (2015).</li><li>Duan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+profiling+in+chondrocyte+dedifferentiation+in+vitro.">DNA methylation profiling in chondrocyte dedifferentiation in vitro.</a> J Cell Physiol. , (2016).</li><li>Bhat, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+detection+at+single+base+resolution+using+targeted+next+generation+bisulfite+sequencing+and+cross+validation+using+capillary+sequencing.">DNA methylation detection at single base resolution using targeted next generation bisulfite sequencing and cross validation using capillary sequencing.</a> Gene. , (2016).</li><li>Shi, X. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+Genome-wide+DNA+Methylation+Profiles+Altered+in+Kashin-Beck+Disease+Using+Infinium+Human+Methylation+450+Bead+Chips.">Exploring Genome-wide DNA Methylation Profiles Altered in Kashin-Beck Disease Using Infinium Human Methylation 450 Bead Chips.</a> Biomed Environ Sci. 29 (7), 539-543 (2016).</li><li>Li, X. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+an+HPLC+Method+for+Determining+the+Genomic+Methylation+Levels+of+Taxus+Cells.">Optimization of an HPLC Method for Determining the Genomic Methylation Levels of Taxus Cells.</a> J Chromatogr Sci. 54 (2), 200-205 (2016).</li><li>Maghbooli, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+DNA+methylation+as+a+possible+biomarker+fordiabetic+retinopathy.">Global DNA methylation as a possible biomarker fordiabetic retinopathy.</a> Diabetes Metab Res Rev. 31 (2), 183-189 (2015).</li><li>Barlic, A., Drobnic, M., Malicev, E., Kregar-Velikonja, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+gene+expression+in+human+articular+chondrocytes+assigned+for+autologous+implantation.">Quantitative analysis of gene expression in human articular chondrocytes assigned for autologous implantation.</a> J Orthop Res. 26 (6), 847-853 (2008).</li><li>Legendre, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+hyaline+cartilage+matrix+synthesis+in+collagen+sponge+scaffolds+by+using+siRNA+to+stabilizechondrocytes+phenotype+cultured+with+bone+morphogenetic+protein-2+under+hypoxia.">Enhanced hyaline cartilage matrix synthesis in collagen sponge scaffolds by using siRNA to stabilizechondrocytes phenotype cultured with bone morphogenetic protein-2 under hypoxia.</a> Tissue Eng Part C Methods. 19 (7), 550-567 (2013).</li><li>Niethammer, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+autologous+chondrocyte+quality+of+matrix-based+autologous+chondrocyte+implantation+in+the+knee+joint.">Analysis of the autologous chondrocyte quality of matrix-based autologous chondrocyte implantation in the knee joint.</a> Int Orthop. 40 (1), 205-212 (2016).</li><li>Hayatsu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bisulfite+genomic+sequencing+used+in+the+analysis+of+epigenetic+states,+a+technique+in+the+emerging+environmental+genotoxicology+research.">The bisulfite genomic sequencing used in the analysis of epigenetic states, a technique in the emerging environmental genotoxicology research.</a> Mutat Res. 659 (1-2), 77-82 (2008).</li><li>Haque, N., Nishiguchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bisulfite+sequencing+for+cytosine-methylation+analysis+in+plants.">Bisulfite sequencing for cytosine-methylation analysis in plants.</a> Methods Mol Biol. 744, 187-197 (2011).</li><li>Ananiev, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+mapping+discerns+genome+wide+DNA+methylation+profiles.">Optical mapping discerns genome wide DNA methylation profiles.</a> BMC Mol Biol. 9, 68 (2008).</li></ol>

La dedifferentiation condrocitica in vitro compromette gravemente l&#39;esito dell&#39;ACI nel trattamento della riparazione di difetti della cartilagine 11 , 12 . Per ottimizzare l&#39;esito ACI, è fondamentale evitare l&#39;uso di condrociti dedifferenziati 13 . Gli studi hanno suggerito che il livello generale di metilazione del DNA è associato all&#39;estensione della dedifferentiation condroscica 4 ...

L&#39;impianto di condrociti autologo (ACI) è una procedura relativamente nuova e all&#39;avanguardia per curare i difetti della cartilagine articolare 1 , 2 . Uno dei punti cruciali in ACI è l&#39;amplificazione dei condrociti attraverso la coltura monolayer in vitro . Durante l&#39;amplificazione, i condrociti ialini facilmente perdono il loro fenotipo e diventano dedifferenziati, che è indesiderabile per il trattamento ACI 3 , 4 . Per ottimizzare l&#39;esito del trattamento ACI, la dimensione della dedifferentiation dei condrociti dovrebbe essere determinata prima della reimpianto. È indispensabile stabilire un modo economico e rapido per determinare lo status di condrociti. Recentemente, l&#39;associazione tra la metilazione del DNA e la dedifferentiation dei condrociti ha attirato molta attenzione 4 , 5 , 6 . La metilazione del DNA è un processo di whI gruppi metilici vengono aggiunti al DNA, con conseguente conversione di residui di citosina a 5-metilcitosina (5-mC). Per chiarire la biologia della metilazione del DNA nella dedifferentiation condrocitica, il primo passo è valutare il livello di metilazione del DNA dei condrociti, che finora si è dimostrato difficile. La sequenza genomica bisulfite è la tecnica più utilizzata per analizzare la metilazione del DNA 7 , 8 . In questo saggio, la conversione di bisolfito provoca il degrado del DNA e quindi una quantità sostanziale di campione deve essere fornita per il dosaggio. Inoltre, la cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) è stata utilizzata per quantificare i livelli di metilazione del DNA a livello mondiale 9 , 10 . Tuttavia, l&#39;analisi HPLC richiede la digestione genomica del DNA. Inoltre, sono necessari strumenti sperimentali avanzati e costosi. Pertanto, oltre al costo elevato, queste procedure sperimentali sono tempi di devastazioneUming. Gli anticorpi anti-5-mC sono ormai diventati commercialmente disponibili, il che ha creato la possibilità di bloccaggio immunitario di DNA genomico contenente 5 mC da genomi complessi. In questo rapporto, abbiamo estratto il DNA genomico dai condrociti coltivati ​​in una serie di colture monolayer. Abbiamo utilizzato un punteggio di punteggio per valutare il contenuto di 5 mc nei condrociti umani con diversi numeri di passaggi. Abbiamo riscontrato che il contenuto di 5 mC è aumentato in condrociti altamente dedifferenziati rispetto ai condrociti con dedifferentiation a basso grado. Inoltre, abbiamo identificato una relazione tra lo stato di dedifferentiation ei livelli di 5-mc. Infine, abbiamo riportato che le variazioni nel contenuto di 5 mc erano associate al fenotipo condrocitico. Pertanto, il test a blot di punti a 5 mc è un metodo affidabile, semplice e rapido per rilevare il livello di metilazione del DNA nei condrociti.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM&#160;&#160;</td>
			<td>Gibco Inc.</td>
			<td>11965&#8211;092</td>
			<td>Warm in 37 &#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Phosphate-Buffered Saline(PBS)</td>
			<td rowspan="2">HyClone Inc.</td>
			<td rowspan="2">SH30256.01B</td>
			<td>D-PBS, free of&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ca2+/Mg2+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco Inc.</td>
			<td>10099-141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25%Trypsin/EDTA</td>
			<td>Gibco Inc.</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1%Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco Inc.</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Mallinckrodt</td>
			<td>4440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoamyl Alcohol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I-3643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol</td>
			<td>Gibco BRL</td>
			<td>15513-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Gibco BRL</td>
			<td>24568-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAE buffer&#160;</td>
			<td>Bio Whittaker</td>
			<td>16-011V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled Water</td>
			<td>Gibco BRL</td>
			<td>15230-170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M Tris-HCl</td>
			<td>Biosharp Inc.</td>
			<td>BL514A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween20</td>
			<td>Biotopped Inc.</td>
			<td>C58H114O26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Proliant Inc.</td>
			<td>68700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, Type II</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Names&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Company&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Catalog number&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer(40&#956;m nylon&#65289;</td>
			<td>FALCON Inc.</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>ISOLAB Inc.</td>
			<td>075.03.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 100 mm&#160; dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tubes</td>
			<td>TPP AG</td>
			<td>91050</td>
			<td>Gamma-sterilized</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-speed centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5804R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoMixer</td>
			<td>MIULAB</td>
			<td>MTH-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon dioxide cell incubator</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>3111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemi-imaging Analyse System</td>
			<td>UVITEC Cambridge</td>
			<td>ALLIANCE</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a 5-mc dot blot assay quantifying the dna methylation level of chondrocyte dedifferentiation in vitro

La dedifferentiation dei condrociti ialine nei condrociti fibroblastici spesso accompagna l&#39;espansione monoselocca dei condrociti in vitro . Il livello globale di metilazione del DNA dei condrociti è considerato un biomarker adatto per la perdita del fenotipo condrocitico. Tuttavia, i risultati basati su metodi sperimentali diversi possono essere incoerenti. Pertanto, è importante stabilire un metodo preciso, semplice e rapido per quantificare i livelli globali di metilazione del DNA durante la dedifferentiation della condrociti. Le tecniche di analisi di metilazione a livello genomico in gran parte dipendono dal sequenziamento genomico di bisolfito. A causa del degrado del DNA durante la conversione di bisolfito, questi metodi richiedono tipicamente un grande volume di campione. Altri metodi utilizzati per quantificare i livelli globali di metilazione del DNA includono la cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC). Tuttavia, la HPLC richiede una completa digestione del DNA genomico. Inoltre, il costo proibitativamente elevato di HPLC inGli strumenti limitano l&#39;applicazione più ampia di HPLC. In questo studio, il DNA genomico (gDNA) è stato estratto da condrociti umani coltivati ​​con un numero variabile di passaggi. Il livello di metilazione del gDNA è stato rilevato utilizzando un test di macchia puntale specifico per la metilazione. In questo approccio dot blot, una miscela di gDNA contenente il DNA metilato da rilevare è stata individuata direttamente su una membrana N + come punto all&#39;interno di un modello di schema circolare precedentemente disegnato. Rispetto ad altri approcci di blotting a base di elettroforesi a base di gel e ad altre procedure di blotting complesse, il metodo dot blot consente di risparmiare tempo significativo. Inoltre, le macchie a punti possono rilevare il livello generale di metilazione del DNA utilizzando un anticorpo a 5 mc commercialmente disponibile. Abbiamo scoperto che il livello di metilazione del DNA differiva tra le sottoculture monolayer e quindi potrebbe svolgere un ruolo fondamentale nella dedifferentiation condrocitica. La macchia a punti da 5 mc è un metodo affidabile, semplice e rapido per rilevare il livello generale di metilazione del DNA da valutareE fenotipo condrocitico.

I condrociti sono stati coltivati ​​in un monostrato fino al passaggio 6 (P6). I condrociti hanno mostrato progressi fenotipici con passaggi successivi della coltura monolayer. La morfologia dei condrociti P0 era rotonda, mentre le cellule sono diventate altamente schiacciate e appiattite con passaggi successivi fino a P6 ( Figura 1 ). Questo cambiamento morfologico è tipico del processo di dedifferentiation condrocitico. Nel frattempo, i risultati della mappa termi...

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A 5-mC Dot Blot Assay Quantifying the DNA Methylation Level of Chondrocyte Dedifferentiation In Vitro

Presentiamo un metodo per quantificare la metilazione del DNA in base alla macchia dot-5-metilcitosina (5-mc). Abbiamo determinato i livelli di 5 mC durante la dedifferentiation dei condrociti. Questa semplice tecnica potrebbe essere utilizzata per determinare rapidamente il fenotipo condrocitico nel trattamento ACI.

Un test a blot di 5 mc quantificando il livello di metilazione del DNA della dedifferentiation di condrociti<em&gt; In vitro</em

The dedifferentiation of hyaline chondrocytes into fibroblastic chondrocytes often accompanies monolayer expansion of chondrocytes in vitro. The global ...

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A 5-mC Dot Blot Assay Quantifying the DNA Methylation Level of Chondrocyte Dedifferentiation In Vitro

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