Name: a 5-mc dot blot assay quantifying the dna methylation level of chondrocyte dedifferentiation in vitro
Uploaded: 2017-05-17T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A 5-mC Dot Blot Assay Quantifying the DNA Methylation Level of Chondrocyte Dedifferentiation In Vitro at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado pelas seguintes subvenções: Natural Science Foundation of China (No. 81572198; No. 81260161; No. 81000460); Fundação de ciência natural da província de Guangdong, China (No. 2015A030313772); Projeto financiado da fundação da ciência de Postdoctoral de China (No. 2013M530385); A Fundação de Pesquisa Médica da Província de Guangdong, China (No. A2016314); Shenzhen Science and Technology Projects (No. JCYJ20160301111338144; No. JSGG20151030140325149; No. JSGG20140519105550503; No.GJHZ20130412153906739; No. JCYJ20140414170821160; No.JCYJ20140414170821200).

Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética Humana do Segundo Hospital Popular de Shenzhen. 1. Coleção de Tecidos de Cartilagem Articular Humana e Cultura de Condrócitos <ol><li> Preparação de materiais <ol><li> Preparar meio de águia modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de soro bovino fetal e 1% de penicilina-estreptomicina. Preparar 1 mg / mL de colagenase II, 0,25% de tripsina-EDTA, solução salina tamponada com fosfato (PBS) e um filtro de cél...

<ol>
	<li>Brittberg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+deep+cartilage+defects+in+the+knee+with+autologous+chondrocyte+transplantation.">Treatment of deep cartilage defects in the knee with autologous chondrocyte transplantation.</a> N Engl J Med. 331, 889-895 (1994).</li><li>Pareek, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-Term+Outcomes+After+Autologous+Chondrocyte+Implantation:+A+Systematic+Review+at+Mean+Follow-Up+of+11.4+Years.">Long-Term Outcomes After Autologous Chondrocyte Implantation: A Systematic Review at Mean Follow-Up of 11.4 Years.</a> Cartilage. 7 (4), 298-308 (2016).</li><li>Duan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokine+networking+of+chondrocyte+dedifferentiation+in+vitro+and+its+implications+for+cell-based+cartilage+therapy.">Cytokine networking of chondrocyte dedifferentiation in vitro and its implications for cell-based cartilage therapy.</a> Am J Transl Res. 7 (2), 194-208 (2015).</li><li>Ma, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+profiling+of+dedifferentiated+human+articular+chondrocytes+in+monolayer+culture.">Gene expression profiling of dedifferentiated human articular chondrocytes in monolayer culture.</a> Osteoarthritis Cartilage. 21 (4), 599-603 (2013).</li><li>Duan, L., Liang, Y., Ma, B., Zhu, W., Wang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+regulation+in+chondrocyte+phenotype+maintenance+for+cell-based+cartilage+repair.">Epigenetic regulation in chondrocyte phenotype maintenance for cell-based cartilage repair.</a> Am J Transl Res. 7 (11), 2127-2140 (2015).</li><li>Duan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+profiling+in+chondrocyte+dedifferentiation+in+vitro.">DNA methylation profiling in chondrocyte dedifferentiation in vitro.</a> J Cell Physiol. , (2016).</li><li>Bhat, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+detection+at+single+base+resolution+using+targeted+next+generation+bisulfite+sequencing+and+cross+validation+using+capillary+sequencing.">DNA methylation detection at single base resolution using targeted next generation bisulfite sequencing and cross validation using capillary sequencing.</a> Gene. , (2016).</li><li>Shi, X. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+Genome-wide+DNA+Methylation+Profiles+Altered+in+Kashin-Beck+Disease+Using+Infinium+Human+Methylation+450+Bead+Chips.">Exploring Genome-wide DNA Methylation Profiles Altered in Kashin-Beck Disease Using Infinium Human Methylation 450 Bead Chips.</a> Biomed Environ Sci. 29 (7), 539-543 (2016).</li><li>Li, X. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+an+HPLC+Method+for+Determining+the+Genomic+Methylation+Levels+of+Taxus+Cells.">Optimization of an HPLC Method for Determining the Genomic Methylation Levels of Taxus Cells.</a> J Chromatogr Sci. 54 (2), 200-205 (2016).</li><li>Maghbooli, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+DNA+methylation+as+a+possible+biomarker+fordiabetic+retinopathy.">Global DNA methylation as a possible biomarker fordiabetic retinopathy.</a> Diabetes Metab Res Rev. 31 (2), 183-189 (2015).</li><li>Barlic, A., Drobnic, M., Malicev, E., Kregar-Velikonja, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+gene+expression+in+human+articular+chondrocytes+assigned+for+autologous+implantation.">Quantitative analysis of gene expression in human articular chondrocytes assigned for autologous implantation.</a> J Orthop Res. 26 (6), 847-853 (2008).</li><li>Legendre, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+hyaline+cartilage+matrix+synthesis+in+collagen+sponge+scaffolds+by+using+siRNA+to+stabilizechondrocytes+phenotype+cultured+with+bone+morphogenetic+protein-2+under+hypoxia.">Enhanced hyaline cartilage matrix synthesis in collagen sponge scaffolds by using siRNA to stabilizechondrocytes phenotype cultured with bone morphogenetic protein-2 under hypoxia.</a> Tissue Eng Part C Methods. 19 (7), 550-567 (2013).</li><li>Niethammer, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+autologous+chondrocyte+quality+of+matrix-based+autologous+chondrocyte+implantation+in+the+knee+joint.">Analysis of the autologous chondrocyte quality of matrix-based autologous chondrocyte implantation in the knee joint.</a> Int Orthop. 40 (1), 205-212 (2016).</li><li>Hayatsu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bisulfite+genomic+sequencing+used+in+the+analysis+of+epigenetic+states,+a+technique+in+the+emerging+environmental+genotoxicology+research.">The bisulfite genomic sequencing used in the analysis of epigenetic states, a technique in the emerging environmental genotoxicology research.</a> Mutat Res. 659 (1-2), 77-82 (2008).</li><li>Haque, N., Nishiguchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bisulfite+sequencing+for+cytosine-methylation+analysis+in+plants.">Bisulfite sequencing for cytosine-methylation analysis in plants.</a> Methods Mol Biol. 744, 187-197 (2011).</li><li>Ananiev, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+mapping+discerns+genome+wide+DNA+methylation+profiles.">Optical mapping discerns genome wide DNA methylation profiles.</a> BMC Mol Biol. 9, 68 (2008).</li></ol>

A desdiferenciação de condrócitos in vitro compromete gravemente o desfecho da ACI no tratamento da reparação de defeitos da cartilagem 11,12. Para otimizar o resultado do ACI, é crucial evitar o uso de condrócitos desdiferenciados 13 . Estudos sugeriram que o nível geral de metilação do DNA está associado à extensão da desdiferenciação dos condrócitos 4,6. Assim, é imperativo estabelecer um método fiável e rápido para detectar o estado geral de metilação do ADN dos...

O implante de condrócitos autólogos (IAC) é um procedimento relativamente novo e de última geração para o tratamento de defeitos da cartilagem articular 1 , 2 . Um dos passos cruciais no ACI é a amplificação de condrócitos através da cultura monocamada in vitro . Durante a amplificação, os condrócitos hialinos perdem facilmente o seu fenótipo e se tornam desdiferenciados, o que é indesejável para o tratamento com ACI 3 , 4 . Para optimizar o resultado do tratamento com ACI, a extensão da desdiferenciação dos condrócitos deve ser determinada antes da replantação. É imperativo estabelecer uma maneira econômica e rápida de determinar o status dos condrócitos. Recentemente, a associação entre metilação do DNA e desdiferenciação de condrócitos atraiu muita atenção 4 , 5 , 6 . A metilação do DNA é um processoGrupos metilo são adicionados ao ADN, resultando na conversão de resíduos de citosina em 5-metilcitosina (5-mC). Para elucidar a biologia da metilação do DNA na desdiferenciação dos condrócitos, o primeiro passo é avaliar o nível de metilação do DNA dos condrócitos, que até agora tem se mostrado desafiador. A sequenciação genômica do bisulfito é a técnica mais utilizada para analisar a metilação do DNA 7 , 8 . Neste ensaio, a conversão de bisulfito provoca a degradação do ADN, e assim uma quantidade substancial de amostra deve ser proporcionada para o ensaio. Além disso, a cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) foi utilizada para quantificar os níveis globais de metilação do DNA 9,10. No entanto, a análise por HPLC requer digestão com ADN genómico. Além disso, são necessários instrumentos experimentais avançados e caros. Portanto, além do alto custo, esses procedimentos experimentais são contra-tempoUming Os anticorpos anti-5-mC tornaram-se agora comercialmente disponíveis, o que criou a possibilidade de imunotransferência de ADN genómico contendo 5 mC a partir de genomas complexos. Neste relatório, extraímos DNA genômico de condrócitos cultivados em uma série de culturas monocamadas. Utilizou-se um ensaio dot blot para avaliar o teor de 5-mC em condrócitos humanos com diferentes números de passagens. Verificou-se que o teor de 5-mC foi aumentado em condrócitos altamente desdiferenciados em comparação com condrócitos com desdiferenciação de baixo grau. Além disso, identificamos uma relação entre o status de desdiferenciação e os níveis de 5-mC. Finalmente, relatamos que as alterações no conteúdo de 5 mC foram associadas ao fenótipo condrócito. Deste modo, o ensaio de dot blot de 5 mC é um método fiável, simples e rápido para detectar o nível de metilação do ADN em condrócitos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM&#160;&#160;</td>
			<td>Gibco Inc.</td>
			<td>11965&#8211;092</td>
			<td>Warm in 37 &#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Phosphate-Buffered Saline(PBS)</td>
			<td rowspan="2">HyClone Inc.</td>
			<td rowspan="2">SH30256.01B</td>
			<td>D-PBS, free of&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ca2+/Mg2+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco Inc.</td>
			<td>10099-141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25%Trypsin/EDTA</td>
			<td>Gibco Inc.</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1%Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco Inc.</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Mallinckrodt</td>
			<td>4440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoamyl Alcohol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I-3643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol</td>
			<td>Gibco BRL</td>
			<td>15513-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Gibco BRL</td>
			<td>24568-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAE buffer&#160;</td>
			<td>Bio Whittaker</td>
			<td>16-011V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled Water</td>
			<td>Gibco BRL</td>
			<td>15230-170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M Tris-HCl</td>
			<td>Biosharp Inc.</td>
			<td>BL514A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween20</td>
			<td>Biotopped Inc.</td>
			<td>C58H114O26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Proliant Inc.</td>
			<td>68700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, Type II</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Names&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Company&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Catalog number&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer(40&#956;m nylon&#65289;</td>
			<td>FALCON Inc.</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>ISOLAB Inc.</td>
			<td>075.03.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 100 mm&#160; dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tubes</td>
			<td>TPP AG</td>
			<td>91050</td>
			<td>Gamma-sterilized</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-speed centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5804R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoMixer</td>
			<td>MIULAB</td>
			<td>MTH-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon dioxide cell incubator</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>3111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemi-imaging Analyse System</td>
			<td>UVITEC Cambridge</td>
			<td>ALLIANCE</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a 5-mc dot blot assay quantifying the dna methylation level of chondrocyte dedifferentiation in vitro

A desdiferenciação de condrócitos hialinos em condrócitos fibroblásticos acompanha frequentemente a expansão monocamada de condrócitos in vitro . O nível global de metilação do ADN dos condrócitos é considerado um biomarcador adequado para a perda do fenótipo dos condrócitos. No entanto, resultados baseados em diferentes métodos experimentais podem ser inconsistentes. Portanto, é importante estabelecer um método preciso, simples e rápido para quantificar os níveis globais de metilação do DNA durante a desdiferenciação dos condrócitos. As técnicas atuais de análise de metilação do genoma abrangem amplamente o seqüenciamento genômico do bisulfito. Devido à degradação do ADN durante a conversão de bissulfito, estes métodos requerem tipicamente um grande volume de amostra. Outros métodos utilizados para quantificar os níveis globais de metilação do DNA incluem a cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC). No entanto, a HPLC requer a digestão completa do ADN genómico. Além disso, o custo proibitivamente alto de HPLC emLimita a aplicação mais ampla da HPLC. Neste estudo, o ADN genómico (gDNA) foi extraído de condrócitos humanos cultivados com número variável de passagens. O nível de metilação de gDNA foi detectado utilizando um ensaio dot blot de metilação específica. Nesta abordagem dot blot, uma mistura de gDNA contendo o ADN metilado a ser detectado foi manchada directamente sobre uma membrana N + como um ponto dentro de um padrão de molde circular previamente desenhado. Em comparação com outras abordagens de blotting baseadas em electroforese em gel e outros processos de transferência de blot, o método dot blot economiza tempo significativo. Além disso, as transferências de pontos podem detectar o nível geral de metilação do ADN utilizando um anticorpo 5-mC comercialmente disponível. Descobrimos que o nível de metilação do DNA diferiu entre as subcultações monocamadas e, portanto, poderia desempenhar um papel chave na desdiferenciação dos condrócitos. A mancha ponto 5-mC é um método confiável, simples e rápido para detectar o nível geral de metilação do DNA para avaliarE fenótipo condrócito.

Os condrócitos foram cultivados numa monocamada até à passagem 6 (P6). Os condrócitos mostraram alterações fenotípicas progressivas com passagens sucessivas da cultura monocamada. A morfologia dos condrócitos P0 foi redonda, enquanto que as células tornaram-se altamente comprimidas e achatadas com passagens sucessivas até P6 ( Figura 1 ). Esta alteração morfológica é típica do processo de desdiferenciação dos condrócitos. Entretanto, os resultados do ma...

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A 5-mC Dot Blot Assay Quantifying the DNA Methylation Level of Chondrocyte Dedifferentiation In Vitro

Apresentamos um método para quantificar a metilação do DNA com base na mancha ponto 5-metilcitosina (5-mC). Determinamos os níveis de 5-mC durante a desdiferenciação de condrócitos. Esta técnica simples poderia ser usada para determinar rapidamente o fenótipo condrócito em tratamento com ACI.

Um Ensaio de Blot de Ponto de 5 mC Quantificando o Nï¿½el de Metilaï¿½o de ADN da Dediferenciaï¿½o de Condrocitos<em&gt; In Vitro</em

The dedifferentiation of hyaline chondrocytes into fibroblastic chondrocytes often accompanies monolayer expansion of chondrocytes in vitro. The global ...

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