Name: a 5-mc dot blot assay quantifying the dna methylation level of chondrocyte dedifferentiation in vitro
Uploaded: 2017-05-17T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A 5-mC Dot Blot Assay Quantifying the DNA Methylation Level of Chondrocyte Dedifferentiation In Vitro at JoVE.com

Este trabajo fue apoyado por las subvenciones siguientes: Fundación de Ciencias Naturales de China (No. 81572198; No. 81260161; No. 81000460); Fundación de Ciencias Naturales de la Provincia de Guangdong, China (No. 2015A030313772); Proyecto financiado por la Fundación de Ciencia Postdoctoral de China (No. 2013M530385); La Fundación de Investigación Médica de la provincia de Guangdong, China (No. A2016314); Proyectos de Ciencia y Tecnología de Shenzhen (No. JCYJ20160301111338144; No. JSGG20151030140325149; No. JSGG20140519105550503; No.GJHZ20130412153906739; No. JCYJ20140414170821160; No.JCYJ20140414170821200).

Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética Humana del Segundo Hospital Popular de Shenzhen. 1. Colección de Tejido Articular Humano y Cultura de Condrocitos <ol><li> Preparación de materiales <ol><li> Preparar el medio de águila modificada de Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% de suero bovino fetal y 1% de penicilina-estreptomicina. Preparar 1 mg / ml de colagenasa II, 0,25% de tripsina-EDTA, solución salina tamponada con fosfato (PBS) y un colador celular (4...

<ol>
	<li>Brittberg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+deep+cartilage+defects+in+the+knee+with+autologous+chondrocyte+transplantation.">Treatment of deep cartilage defects in the knee with autologous chondrocyte transplantation.</a> N Engl J Med. 331, 889-895 (1994).</li><li>Pareek, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-Term+Outcomes+After+Autologous+Chondrocyte+Implantation:+A+Systematic+Review+at+Mean+Follow-Up+of+11.4+Years.">Long-Term Outcomes After Autologous Chondrocyte Implantation: A Systematic Review at Mean Follow-Up of 11.4 Years.</a> Cartilage. 7 (4), 298-308 (2016).</li><li>Duan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokine+networking+of+chondrocyte+dedifferentiation+in+vitro+and+its+implications+for+cell-based+cartilage+therapy.">Cytokine networking of chondrocyte dedifferentiation in vitro and its implications for cell-based cartilage therapy.</a> Am J Transl Res. 7 (2), 194-208 (2015).</li><li>Ma, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+profiling+of+dedifferentiated+human+articular+chondrocytes+in+monolayer+culture.">Gene expression profiling of dedifferentiated human articular chondrocytes in monolayer culture.</a> Osteoarthritis Cartilage. 21 (4), 599-603 (2013).</li><li>Duan, L., Liang, Y., Ma, B., Zhu, W., Wang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+regulation+in+chondrocyte+phenotype+maintenance+for+cell-based+cartilage+repair.">Epigenetic regulation in chondrocyte phenotype maintenance for cell-based cartilage repair.</a> Am J Transl Res. 7 (11), 2127-2140 (2015).</li><li>Duan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+profiling+in+chondrocyte+dedifferentiation+in+vitro.">DNA methylation profiling in chondrocyte dedifferentiation in vitro.</a> J Cell Physiol. , (2016).</li><li>Bhat, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+detection+at+single+base+resolution+using+targeted+next+generation+bisulfite+sequencing+and+cross+validation+using+capillary+sequencing.">DNA methylation detection at single base resolution using targeted next generation bisulfite sequencing and cross validation using capillary sequencing.</a> Gene. , (2016).</li><li>Shi, X. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+Genome-wide+DNA+Methylation+Profiles+Altered+in+Kashin-Beck+Disease+Using+Infinium+Human+Methylation+450+Bead+Chips.">Exploring Genome-wide DNA Methylation Profiles Altered in Kashin-Beck Disease Using Infinium Human Methylation 450 Bead Chips.</a> Biomed Environ Sci. 29 (7), 539-543 (2016).</li><li>Li, X. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+an+HPLC+Method+for+Determining+the+Genomic+Methylation+Levels+of+Taxus+Cells.">Optimization of an HPLC Method for Determining the Genomic Methylation Levels of Taxus Cells.</a> J Chromatogr Sci. 54 (2), 200-205 (2016).</li><li>Maghbooli, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+DNA+methylation+as+a+possible+biomarker+fordiabetic+retinopathy.">Global DNA methylation as a possible biomarker fordiabetic retinopathy.</a> Diabetes Metab Res Rev. 31 (2), 183-189 (2015).</li><li>Barlic, A., Drobnic, M., Malicev, E., Kregar-Velikonja, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+gene+expression+in+human+articular+chondrocytes+assigned+for+autologous+implantation.">Quantitative analysis of gene expression in human articular chondrocytes assigned for autologous implantation.</a> J Orthop Res. 26 (6), 847-853 (2008).</li><li>Legendre, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+hyaline+cartilage+matrix+synthesis+in+collagen+sponge+scaffolds+by+using+siRNA+to+stabilizechondrocytes+phenotype+cultured+with+bone+morphogenetic+protein-2+under+hypoxia.">Enhanced hyaline cartilage matrix synthesis in collagen sponge scaffolds by using siRNA to stabilizechondrocytes phenotype cultured with bone morphogenetic protein-2 under hypoxia.</a> Tissue Eng Part C Methods. 19 (7), 550-567 (2013).</li><li>Niethammer, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+autologous+chondrocyte+quality+of+matrix-based+autologous+chondrocyte+implantation+in+the+knee+joint.">Analysis of the autologous chondrocyte quality of matrix-based autologous chondrocyte implantation in the knee joint.</a> Int Orthop. 40 (1), 205-212 (2016).</li><li>Hayatsu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bisulfite+genomic+sequencing+used+in+the+analysis+of+epigenetic+states,+a+technique+in+the+emerging+environmental+genotoxicology+research.">The bisulfite genomic sequencing used in the analysis of epigenetic states, a technique in the emerging environmental genotoxicology research.</a> Mutat Res. 659 (1-2), 77-82 (2008).</li><li>Haque, N., Nishiguchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bisulfite+sequencing+for+cytosine-methylation+analysis+in+plants.">Bisulfite sequencing for cytosine-methylation analysis in plants.</a> Methods Mol Biol. 744, 187-197 (2011).</li><li>Ananiev, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+mapping+discerns+genome+wide+DNA+methylation+profiles.">Optical mapping discerns genome wide DNA methylation profiles.</a> BMC Mol Biol. 9, 68 (2008).</li></ol>

Desdiferenciación de condrocitos in vitro compromete gravemente el resultado de la ACI en el tratamiento de la reparación de defectos del cartílago [ 11 , 12] . Para optimizar el resultado ACI, es crucial evitar el uso de condrocitos desdiferenciados [ 13] . Los estudios han sugerido que el nivel general de metilación del ADN está asociado con la extensión de la desdiferenciación de los condrocitos 4</sup...

El implante autólogo de los condrocitos (IAC) es un procedimiento relativamente nuevo y de última generación para tratar los defectos del cartílago articular 1 , 2 . Uno de los pasos cruciales en ACI es la amplificación de condrocitos a través de cultivo monocapa in vitro . Durante la amplificación, los condrocitos hialinos pierden fácilmente su fenotipo y se desdiferencian, lo cual es indeseable para el tratamiento con ACI 3 , 4 . Para optimizar el resultado del tratamiento con ACI, se debe determinar la extensión de la desdiferenciación de los condrocitos antes de la replantación. Es imperativo establecer una manera económica y rápida de determinar el estatus de los condrocitos. Recientemente, la asociación entre la metilación del ADN y la desdiferenciación de los condrocitos ha atraído mucha atención 4 , 5 , 6 . La metilación del ADN es un proceso porLos grupos metilo se añaden al ADN, dando como resultado la conversión de residuos de citosina en 5-metilcitosina (5-mC). Para dilucidar la biología de la metilación del ADN en la desdiferenciación de los condrocitos, el primer paso es evaluar el nivel de metilación del ADN de los condrocitos, que hasta ahora ha resultado difícil. La secuenciación genómica del bisulfito es la técnica más utilizada para analizar la metilación del ADN 7 , 8 . En este ensayo, la conversión de bisulfito causa la degradación del ADN, y por lo tanto se debe proporcionar una cantidad sustancial de muestra para el ensayo. Además, se ha utilizado la cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) para cuantificar los niveles globales de metilación del ADN 9 , 10 . Sin embargo, el análisis de HPLC requiere la digestión del ADN genómico. Además, se requieren instrumentos experimentales avanzados y costosos. Por lo tanto, además del alto costo, estos procedimientos experimentales son contra del tiempoUming Los anticuerpos anti-5-mC se han vuelto comercialmente disponibles, lo que ha creado la posibilidad de inmunotransferencia de ADN genómico que contiene 5 mC de genomas complejos. En este informe, hemos extraído ADN genómico de los condrocitos cultivados en una serie de monocapas culturas. Se utilizó un ensayo dot blot para evaluar el contenido de 5 mC en los condrocitos humanos con diferentes números de pasajes. Se encontró que el contenido de 5-mC se incrementó en condrocitos altamente desdiferenciados en comparación con los condrocitos con desdiferenciación de bajo grado. Además, se identificó una relación entre el estado de desdiferenciación y los niveles de 5-mC. Finalmente, se informó de que los cambios en el contenido de 5-mC se asociaron con el fenotipo condrocito. Por lo tanto, el ensayo de transferencia de puntos de 5 mC es un método confiable, simple y rápido para detectar el nivel de metilación del ADN en los condrocitos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM&#160;&#160;</td>
			<td>Gibco Inc.</td>
			<td>11965&#8211;092</td>
			<td>Warm in 37 &#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Phosphate-Buffered Saline(PBS)</td>
			<td rowspan="2">HyClone Inc.</td>
			<td rowspan="2">SH30256.01B</td>
			<td>D-PBS, free of&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ca2+/Mg2+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco Inc.</td>
			<td>10099-141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25%Trypsin/EDTA</td>
			<td>Gibco Inc.</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1%Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco Inc.</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Mallinckrodt</td>
			<td>4440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoamyl Alcohol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I-3643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol</td>
			<td>Gibco BRL</td>
			<td>15513-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Gibco BRL</td>
			<td>24568-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAE buffer&#160;</td>
			<td>Bio Whittaker</td>
			<td>16-011V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled Water</td>
			<td>Gibco BRL</td>
			<td>15230-170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M Tris-HCl</td>
			<td>Biosharp Inc.</td>
			<td>BL514A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween20</td>
			<td>Biotopped Inc.</td>
			<td>C58H114O26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Proliant Inc.</td>
			<td>68700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, Type II</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Names&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Company&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Catalog number&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer(40&#956;m nylon&#65289;</td>
			<td>FALCON Inc.</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>ISOLAB Inc.</td>
			<td>075.03.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 100 mm&#160; dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tubes</td>
			<td>TPP AG</td>
			<td>91050</td>
			<td>Gamma-sterilized</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-speed centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5804R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoMixer</td>
			<td>MIULAB</td>
			<td>MTH-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon dioxide cell incubator</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>3111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemi-imaging Analyse System</td>
			<td>UVITEC Cambridge</td>
			<td>ALLIANCE</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a 5-mc dot blot assay quantifying the dna methylation level of chondrocyte dedifferentiation in vitro

La desdiferenciación de condrocitos hialinos en condrocitos fibroblásticos acompaña a menudo la expansión monocapa de condrocitos in vitro . El nivel global de metilación del ADN de los condrocitos se considera un biomarcador adecuado para la pérdida del fenotipo de los condrocitos. Sin embargo, los resultados basados ​​en diferentes métodos experimentales pueden ser inconsistentes. Por lo tanto, es importante establecer un método preciso, simple y rápido para cuantificar los niveles globales de metilación del ADN durante la desdiferenciación de los condrocitos. Las técnicas actuales de análisis de metilación en todo el genoma se basan en gran medida en la secuenciación genómica del bisulfito. Debido a la degradación del ADN durante la conversión de bisulfito, estos métodos requieren típicamente un gran volumen de muestra. Otros métodos utilizados para cuantificar los niveles globales de metilación del ADN incluyen la cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC). Sin embargo, la HPLC requiere digestión completa del ADN genómico. Además, el costo prohibitivo de la HPLC enLimita la aplicación más amplia de HPLC. En este estudio, el ADN genómico (gDNA) se extrajo de condrocitos humanos cultivados con un número variable de pasajes. El nivel de metilación de gDNA se detectó usando un ensayo dot blot de metilación específica. En este enfoque dot blot, una mezcla de gDNA que contenía el ADN metilado a detectar se colocó directamente sobre una membrana N + como un punto dentro de un patrón de plantilla circular previamente dibujado. Comparado con otros enfoques basados ​​en electroforesis en gel y otros procedimientos de transferencia de material complejos, el método dot blot ahorra tiempo significativo. Además, las manchas de puntos pueden detectar el nivel de metilación del ADN global usando un anticuerpo de 5 mC comercialmente disponible. Encontramos que el nivel de metilación del ADN difería entre los subcultivos monocapa, y por lo tanto podría desempeñar un papel clave en la desdiferenciación condrocitos. El punto blot de 5 mC es un método confiable, simple y rápido para detectar el nivel general de metilación del ADN a evaluarE fenotipo de condrocito.

Los condrocitos se cultivaron en una monocapa hasta el paso 6 (P6). Los condrocitos mostraron cambios fenotípicos progresivos con pases sucesivos del cultivo monocapa. La morfología de los condrocitos P0 era ronda, mientras que las células se convirtió muy pellizcado y aplanado con pases sucesivos hasta P6 ( Figura 1 ]. Este cambio de morfología es típico del proceso de desdiferenciación de condrocitos. Mientras tanto, los resultados del mapa de calor indicaron qu...

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A 5-mC Dot Blot Assay Quantifying the DNA Methylation Level of Chondrocyte Dedifferentiation In Vitro

Se presenta un método para cuantificar la metilación del ADN basado en la 5-mctilcitosina (5-mC) dot blot. Se determinaron los niveles de 5-mC durante la desdiferenciación de condrocitos. Esta técnica simple podría utilizarse para determinar rápidamente el fenotipo de condrocito en el tratamiento de ACI.

Un ensayo de transferencia de puntos de 5 mC cuantificando el nivel de metilación de ADN de la distredenciación de condrocitos<em&gt; In Vitro</em

The dedifferentiation of hyaline chondrocytes into fibroblastic chondrocytes often accompanies monolayer expansion of chondrocytes in vitro. The global ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

A 5-mC Dot Blot Assay Quantifying the DNA Methylation Level of Chondrocyte Dedifferentiation In Vitro

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