Name: multi-layer cortical ca2+ imaging in freely moving mice with prism probes and miniaturized fluorescence microscopy
Uploaded: 2017-06-13T12:30:00
Duration: 10 min 35 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multi-layer Cortical Ca2+ Imaging in Freely Moving Mice with Prism Probes and Miniaturized Fluorescence Microscopy at JoVE.com

ويود المؤلفون أن يشكروا كل من ف. جايارامان و دس كيم و لوجر و K. سفوبودا من مشروع المؤشر العصبي المشفر وراثيا ومشروع الجينات في جانيليا ريزارتش كامبوس بمعهد هاورد هيوز الطبي على تبرعهم السخي من AAV1-GCaMP6f إلى، الجامعة، بسبب، البنسلفانيا سهم التوجيه، كور. كما يودون أن يشكروا أولسون و نيوروزينس المجهري الأساسية في جامعة ستانفورد بدعم من المعاهد الوطنية للصحة NS069375 منحة لخدمات المجهر متحد البؤر.

<ol>
	<li>McConnell, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+decision-making+in+the+mammalian+cerebral+cortex.">Development and decision-making in the mammalian cerebral cortex.</a> Brain Res. 472 (1), 1-23 (1988).</li><li>Kwon, S. E., Yang, H., Minamisawa, G., O'Connor, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensory+and+decision-related+activity+propagate+in+a+cortical+feedback+loop+during+touch+perception.">Sensory and decision-related activity propagate in a cortical feedback loop during touch perception.</a> Nat. Neurosci. 19 (9), 1243-1249 (2016).</li><li>Miller, E. K., Cohen, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrative+theory+of+prefrontal+cortex+function.">An integrative theory of prefrontal cortex function.</a> Annu. Rev. Neurosci. 24, 167-202 (2001).</li><li>Bailey, M. R., Simpson, E. H., Balsam, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+substrates+underlying+effort,+time,+and+risk-based+decision+making+in+motivated+behavior.">Neural substrates underlying effort, time, and risk-based decision making in motivated behavior.</a> Neurobiol. Learn. Mem. 133, 233-256 (2016).</li><li>Dehaene, S., Changeux, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reward-dependent+learning+in+neuronal+networks+for+planning+and+decision+making.">Reward-dependent learning in neuronal networks for planning and decision making.</a> Prog. Brain Res. 126, 217-229 (2000).</li><li>Ferenczi, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prefrontal+cortical+regulation+of+brainwide+circuit+dynamics+and+reward-related+behavior.">Prefrontal cortical regulation of brainwide circuit dynamics and reward-related behavior.</a> Science. 351 (6268), aac9698 (2016).</li><li>Anomal, R. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+Processing+in+the+Primary+Auditory+Cortex+of+an+Animal+Model+of+Autism.">Impaired Processing in the Primary Auditory Cortex of an Animal Model of Autism.</a> Front. Sys. Neurosci. 9, 158 (2015).</li><li>Pauls, D. L., Abramovitch, A., Rauch, S. L., Geller, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obsessive-compulsive+disorder:+an+integrative+genetic+and+neurobiological+perspective.">Obsessive-compulsive disorder: an integrative genetic and neurobiological perspective.</a> Nat. Rev. Neurosci. 15 (6), 410-424 (2014).</li><li>Ziv, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+dynamics+of+CA1+hippocampal+place+codes.">Long-term dynamics of CA1 hippocampal place codes.</a> Nat. Neurosci. 16 (3), 264-266 (2013).</li><li>Jennings, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+hypothalamic+network+dynamics+for+appetitive+and+consummatory+behaviors.">Visualizing hypothalamic network dynamics for appetitive and consummatory behaviors.</a> Cell. 160 (3), 516-527 (2015).</li><li>Betley, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurons+for+hunger+and+thirst+transmit+a+negative-valence+teaching+signal.">Neurons for hunger and thirst transmit a negative-valence teaching signal.</a> Nature. 521 (7551), 180-185 (2015).</li><li>Sun, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+speed+dependence+of+entorhinal+island+and+ocean+cells,+including+respective+grid+cells.">Distinct speed dependence of entorhinal island and ocean cells, including respective grid cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 112 (30), 9466-9471 (2015).</li><li>Kitamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entorhinal+Cortical+Ocean+Cells+Encode+Specific+Contexts+and+Drive+Context-Specific+Fear+Memory.">Entorhinal Cortical Ocean Cells Encode Specific Contexts and Drive Context-Specific Fear Memory.</a> Neuron. 87 (6), 1317-1331 (2015).</li><li>Pinto, L., Dan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-Type-Specific+Activity+in+Prefrontal+Cortex+during+Goal-Directed+Behavior.">Cell-Type-Specific Activity in Prefrontal Cortex during Goal-Directed Behavior.</a> Neuron. 87 (2), 437-450 (2015).</li><li>Cox, J., Pinto, L., Dan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+imaging+of+sleep-wake+related+neuronal+activity+in+the+dorsal+pons.">Calcium imaging of sleep-wake related neuronal activity in the dorsal pons.</a> Nat. Comm. 7, 10763 (2016).</li><li>Resendez, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+cortical,+subcortical+and+deep+brain+neural+circuit+dynamics+during+naturalistic+mammalian+behavior+with+head-mounted+microscopes+and+chronically+implanted+lenses.">Visualization of cortical, subcortical and deep brain neural circuit dynamics during naturalistic mammalian behavior with head-mounted microscopes and chronically implanted lenses.</a> Nat. Protoc. 11 (3), 566-597 (2016).</li><li>Hooks, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+cortical+and+thalamic+input+to+pyramidal+neurons+in+mouse+motor+cortex.">Organization of cortical and thalamic input to pyramidal neurons in mouse motor cortex.</a> The J. Neurosci. 33 (2), 748-760 (2013).</li><li>Masamizu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+distinct+layer-specific+dynamics+of+cortical+ensembles+during+learning+of+a+motor+task.">Two distinct layer-specific dynamics of cortical ensembles during learning of a motor task.</a> Nat. Neurosci. 17 (7), 987-994 (2014).</li><li>Rowland, D. C., Moser, M. -. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+cortical+modules+to+memories.">From cortical modules to memories.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 24 (1), 22-27 (2014).</li><li>Ghosh, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Miniaturized+integration+of+a+fluorescence+microscope.">Miniaturized integration of a fluorescence microscope.</a> Nat. Methods. 8 (10), 871-878 (2011).</li><li>Mukamel, E. A., Nimmerjahn, A., Schnitzer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+analysis+of+cellular+signals+from+large-scale+calcium+imaging+data.">Automated analysis of cellular signals from large-scale calcium imaging data.</a> Neuron. 63 (6), 747-760 (2009).</li><li>Andermann, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+cellular+imaging+of+entire+cortical+columns+in+awake+mice+using+microprisms.">Chronic cellular imaging of entire cortical columns in awake mice using microprisms.</a> Neuron. 80 (4), 900-913 (2013).</li><li>Goldey, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removable+cranial+windows+for+long-term+imaging+in+awake+mice.">Removable cranial windows for long-term imaging in awake mice.</a> Nat. Protoc. 9 (11), 2515-2538 (2014).</li><li>Chia, T. H., Levene, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+deep+cortical+layers+using+a+microprism.">In vivo imaging of deep cortical layers using a microprism.</a> J. Vis. Exp. (30), (2009).</li><li>Chia, T. H., Levene, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microprisms+for+in+vivo+multilayer+cortical+imaging.">Microprisms for in vivo multilayer cortical imaging.</a> J. Neurophysiol. 102 (2), 1310-1314 (2009).</li><li>Chia, T. H., Levene, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-layer+in+vivo+imaging+of+neocortex+using+a+microprism.">Multi-layer in vivo imaging of neocortex using a microprism.</a> Cold Spring Harb. Protoc. 2010 (8), (2010).</li><li>Low, R. J., Gu, Y., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+resolution+optical+access+to+brain+regions+in+fissures:+imaging+medial+prefrontal+cortex+and+grid+cells+in+entorhinal+cortex.">Cellular resolution optical access to brain regions in fissures: imaging medial prefrontal cortex and grid cells in entorhinal cortex.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 111 (52), 18739-18744 (2014).</li><li>Zeisel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+structure.+Cell+types+in+the+mouse+cortex+and+hippocampus+revealed+by+single-cell+RNA-seq.">Brain structure. Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq.</a> Science. 347 (6226), 1138-1142 (2015).</li><li>Hawrylycz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inferring+cortical+function+in+the+mouse+visual+system+through+large-scale+systems+neuroscience.">Inferring cortical function in the mouse visual system through large-scale systems neuroscience.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 113 (27), 7337-7344 (2016).</li><li>Petrof, I., Viaene, A. N., Sherman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+the+primary+somatosensory+cortex+projection+to+the+primary+motor+cortex+in+the+mouse.">Properties of the primary somatosensory cortex projection to the primary motor cortex in the mouse.</a> J. Neurophysiol. 113 (7), 2400-2407 (2015).</li><li>Aronoff, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-range+connectivity+of+mouse+primary+somatosensory+barrel+cortex.">Long-range connectivity of mouse primary somatosensory barrel cortex.</a> Euro. J. Neurosci. 31 (12), 2221-2233 (2010).</li><li>Rogan, S. C., Roth, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remote+control+of+neuronal+signaling.">Remote control of neuronal signaling.</a> Pharma. Rev. 63 (2), 291-315 (2011).</li><li>Berdyyeva, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zolpidem+reduces+hippocampal+neuronal+activity+in+freely+behaving+mice:+a+large+scale+calcium+imaging+study+with+miniaturized+fluorescence+microscope.">Zolpidem reduces hippocampal neuronal activity in freely behaving mice: a large scale calcium imaging study with miniaturized fluorescence microscope.</a> PloS One. 9 (11), e112068 (2014).</li></ol>

وقد قرأ المؤلفون سياسة المجلة ولديهم المصالح التالية: سغ، سو و فك مدفوعة الأجر في إنسكوبيكس.

فهم نشاط الدائرة العصبية خلال السلوك مستيقظا هو مستوى حيوي من التحقيق علم الأعصاب اللازمة لتشريح فعال وظيفة الدماغ في الصحة والمرض. القشرة هي منطقة ذات أهمية خاصة للدراسة في سياق السلوك مستيقظا، لأنها تلعب دورا هاما في العديد من الوظائف الحسية والمعرفية والتنفيذية الحيوية 28 ، 29 . ويعتقد أن العمود القشرية لتكون الوحدة الوظيفية الأساسية في القشرة والنشاط على مستوى السكان من الخلايا القشرية هو معروف أن تختلف على أساس موقعها الفعلي داخل العمود. على سبيل المثال، الخلايا العصبية المثيرة في الطبقات 2/3 في مشروع القشرة الحسية الجسدية في المقام الأول إلى المناطق القشرية المخية الأخرى وتعديل الشبكات القشرية الأخرى 30 ، في حين أن الخلايا في طبقات أعمق المشروع في المقام الأول إلى المناطق تحت القشرية مثل المهاد 31 . تسجيل نشاط مائةثانية من الخلايا القشرية قبل محددة في وقت واحد وبشكل موثوق مع مرور الوقت عبر الصفيحة مختلفة في المواضيع تتصرف بحرية من شأنه أن يعزز كثيرا فهمنا لتدفق المعلومات القشرية، والسماح لتشريح وظيفي أدق من أعمدة القشرية أبلغت في الوقت الحقيقي المعلومات السلوكية والمهام ذات الصلة الوقت- النطاقات. جمع هذا المستوى من البيانات الدائرة العصبية هو ممكن مع استخدام كفاءة ومبسطة المنمنمة المنصة المجهرية لإجراء على نطاق واسع كا 2 + التصوير في المواضيع تتصرف بحرية (أو الموضوعات رأس ثابت كما هو مطلوب). تستخدم مع مؤشرات الكالسيوم المشفرة وراثيا لتمكين خلية من نوع محدد الاستهداف، والتصوير مجال متعدد الطبقات للعرض المقدمة من مسبار موشور مزروع مزروع، واستكشاف هذا البروتوكول حالة واحدة من بين العديد من التطبيقات الممكنة: مراقبة الاختلافات الصفحي في معالجة القشرية الحسية الجسدية عند الفئران جسديا تعمل مع كائن رواية ( الشكل 5 ).هذا هو التوضيح الإجرائي الأول من هذا النوع من نوع الخلية محددة، في الجسم الحي نهج لدراسة طبقات القشرية متعددة في مستيقظا، الحيوانات تتصرف بحرية، ويوسع الطيف من الأساليب التجريبية المتاحة لفهم الهياكل الصفحي في الدماغ النشط. مجال الرؤية المنظار من تمكين مسبار المنشور في هذه التقنية يمكن تطبيقها عمليا على هياكل الدماغ الأخرى عند الحفاظ على الأنسجة مباشرة ظهري إلى منطقة من الفائدة هو المطلوب؛ على سبيل المثال، يمكن أن يتحقق التصوير CA3 دون تعطيل وظيفة الحصين. نهج التحقيق مسبار بريزم للتصوير النشاط كا 2 + يتطلب الإدراج البدني والزرع الدائم لل ميكروبريسم في القشرة، وهو ما يعادل إنشاء الآفة القشرية حيث يتم إدراج مسبار العدسة. وهذا قد يؤدي إلى اضطرابات في الدوائر العصبية المحلية، بما في ذلك قطع التشعبات القمي والعمليات. تيفإن الإجراء له أيضا أن يسبب تفعيل الأولي للخلايا الدبقية في المنطقة، على الرغم من أن هذا من المتوقع أن تكون مترجمة إلى الأنسجة حوالي 150 ميكرون من وجه المنشور، وتهدأ بعد أن تلتئم الدماغ 22 . من المهم جدا النظر في ما إذا كانت هذه التقنية سوف تؤثر على تشريح الدائرة الطبيعية و / أو سلوك الحيوانات عند التخطيط للتجارب. وينبغي دائما إجراء مجموعات السيطرة السلوكية لضمان عدم وجود تغييرات كبيرة في السلوكيات الأساسية التي يمكن أن تنتج نتائج تجريبية مربكة. باستخدام هذا المنمنمة، المحمول كا 2 + تقنية التصوير مع التلاعب نيوروفارماكولوجيكال، المعرفية المختلفة، والاجتماعية، والحركية أو النماذج السلوكية الجوهرية، والجمع بينها مع القياسات الفسيولوجية الأخرى يمكن تعميق وإثراء الدراسات التي تركز على فهم الأدوار الوظيفية للدوائر العصبية في السلوك والإشارة معالجة 32 . قمع أو تنشيطيمكن أن تؤثر على بعض مسارات التضمين من قبل المخدرات السلوكيات المرتبطة بها، والتي يمكن دراستها بسهولة باستخدام هذه التكنولوجيا 33 . تتفرع إلى أنواع مختلفة من الخلايا عن طريق تعديل استهداف مؤشر الكالسيوم هو تطبيق قوي ومفيد آخر، وتمكن العديد من مجموعات الإبداعية من الأدوات التجريبية لمعالجة مختلف المسائل الدائرة العصبية.

القشرة هي لاعب أساسي في العديد من الوظائف العقلية والسلوكية المعقدة، من الانتباه، الإدراك الحسي والسيطرة على المعرفي من أعلى إلى أسفل 1 ، 2 ، 3 إلى التحفيز والمكافأة، والإدمان مسارات 4 ، 5 . فهم العمليات الحسابية التي تكمن وراء وظيفتها هو هدف مهم لدفع فهم السريري أفضل من العديد من الاضطرابات النفسية والسلوكية. العديد من النظريات الحالية من الأمراض النفسية مركز حول فكرة أن القشرية ضعف الدائرة العصبية أو ديسكورديناتيون قد تكمن وراء الشذوذ المعرفي والسلوكي التي هي السمات المميزة لظروف مثل الفصام 6 ، التوحد 7 أو اضطراب الوسواس القهري 8 . وبالتالي، الحصول على مستوى السكان بيانات النشاط العصبي من المشاركوالدوائر التحليلية ضمن السياق السليم للمعلومات السلوكية المتزامنة ذات أهمية كبيرة، ومن الناحية المثالية يمكن أن تستهدف أنواع محددة من الخلايا لأقوى تشريح الدائرة العصبية. المجاهر مصغرة بالتزامن مع زرع الانكسار مؤشر الانكسار (غرين) ميكرولنسس تمكين الوصول البصري إلى الفرق العصبية تحت ظروف تتحرك بحرية من مجموعة متنوعة من مناطق الدماغ الممكنة 9 ، 10 ، 11 ، 12 ، 13 ، بما في ذلك القشرة 14 ، 15 ، 16 . باستخدام نظام المجهري المحمول إلى جانب مؤشرات الكالسيوم المشفرة وراثيا يسمح للتصوير متسقة من السكان الخلوية نفسها تشمل مئات من الخلايا العصبية على مدى أيام إلى أسابيع في العديد من مناطق الدماغ 9 ، ويمكن أن يكونمستهدفة وراثيا لأنواع محددة من الخلايا باستخدام ناقلات فيروسية أو تقنيات المعدلة وراثيا. كما هو معروف القشرة لدعم وظائف مختلفة والتواصل مع مناطق الدماغ المختلفة اعتمادا على موقع الخلايا داخل الصفيحة القشرية 17 ، 18 ، 19 ، ونحن مهتمون في الحصول على نشاط العصبية متعددة الطبقات في وقت واحد في موضوعات تتصرف مستيقظا. هنا علينا أن نظهر كيفية صورة مئات من الخلايا العصبية المسمى فلورزنتلي في الفئران تتصرف بحرية على مدى أيام، وذلك باستخدام المجهر مضان مضان 20 يقترن مسبار المنشور زرع، والذي يقدم وجهة نظر متعددة الطبقات من القشرة ( الشكل 1 ). يتكون مسبار المنشور المستخدمة هنا من اثنين من العدسات غرين منفصلة: منظور وعدسة تتابع أسطواني ( الشكل 1 ). ضوء من المجهر يثير فلوريسنتلي المسمىالخلايا الموجودة على طول وجه التصوير من التحقيق المنشور، بعد أن تنعكس على الوتر من جزء المنشور من التحقيق. الضوء المنبعث من الخلايا يعكس أيضا من الوتر من المنشور، يتم جمعها من خلال الهدف من المجهر ويصل إلى أجهزة الاستشعار في المجهر. يتم تكييف مسبار المنشور المستخدمة في هذا الإجراء لسهولة استخدامها مع المعدات التجسيمي القياسية. مضان مضان المنمنمة 20 بالكشف عن العمل المحتملين أثار كا 2+ العابرين في السكان الخلايا العصبية مع قرار خلية واحدة، بعد تلك الخلايا قد وصفت على وجه التحديد مع كا 2 + -Sensitive المؤشرات الفلورية المشفرة وراثيا. في هذا البروتوكول، ونحن حقن كا 2 + مؤشر مشفرة في ناقلات الفيروسية (AAV1.CaMKII.GCaMP6f.WPRE.SV40)، زرع التحقيق المنشور، تثبيت المجهر، ثم الحصول على عدة أيام من البيانات الحسية الجسدية (S1 هند أطرافه) من حيوان يعرضد لأسطح الكائن الرواية خلال التنقيب مجانا ( الشكل 2 ).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Neurostar Motorized 
			Ultra Precise Small Animal Stereotaxic Instrument</td>
			<td>Kopf</td>
			<td>Model 963SD</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereoscope</td>
			<td>Labomed</td>
			<td>Prima DNT</td>
			<td>Surgery and Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Rectal Thermistor Probe (.062&#34;/1.6mm diameter) - 1/4&#34; Jack</td>
			<td>FHC</td>
			<td>40-90-5D-02</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating Pad 5 X 12.5cm&#160;</td>
			<td>FHC</td>
			<td>40-90-2-07</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC Temperature Controller</td>
			<td>FHC</td>
			<td>40-90-8D</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsyringe Pump</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>UMP3 model; serial 155788 F110</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoFil 10&#956;L Syringe</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>NANOFIL</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 G Beveled Tip Nanofil NDL 2PK</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>NF35BV-2</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omnidrill35, 115-230V</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>503598</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Burrs for Micro Drill</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>19007-05</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nVista</td>
			<td>Inscopix</td>
			<td>100-001048</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV1.CaMKII.GCaMP6f.WPRE.SV40</td>
			<td>Penn Vector Core</td>
			<td>AV-1-PV3435</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketoprofen</td>
			<td>Victor Medical</td>
			<td>5487</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carprofen</td>
			<td>Victor Medical</td>
			<td>1699008&#160;</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Victor Medical</td>
			<td>1001054</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelfoam (Patterson Veterinary Supply Inc Gelfoam Sponge 12cmx7mm)</td>
			<td>Pfizer (Fisher Scientific)</td>
			<td>NC9841478</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5/45 forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-35</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-30</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting knives</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10055-12</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProView Implant Kit</td>
			<td>Inscopix</td>
			<td>100-000756</td>
			<td>Surgery and Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProView Prism Probe 1.0mm-Dia. ~4.3mm Length</td>
			<td>Inscopix</td>
			<td>100-000592</td>
			<td>Surgery and Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kwik-Sil adhesive pack of 2</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>KWIK-SIL</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kwik-Cast Sealant</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>KWIK-CAST</td>
			<td>Surgery and Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniature Optical Mounting Post</td>
			<td>Newport</td>
			<td>M-TSP-3</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Baseplate</td>
			<td>Inscopix</td>
			<td>BPL-2</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Baseplate Cover</td>
			<td>Inscopix</td>
			<td>BPC-2</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multi-layer cortical ca2+ imaging in freely moving mice with prism probes and miniaturized fluorescence microscopy

في الدائرة الحية والمستوى الخلوي التصوير الوظيفي هو أداة حاسمة لفهم الدماغ في العمل. وقد وفرت التصوير عالية الدقة من الخلايا العصبية الماوس القشرية مع اثنين من الفوتون المجهري رؤى فريدة من نوعها في هيكل القشرية، وظيفة واللدونة. ومع ذلك، تقتصر هذه الدراسات على رأس الحيوانات الثابتة، والحد بشكل كبير من التعقيد السلوكي المتاحة للدراسة. في هذه الورقة، ونحن تصف إجراء لأداء المجهري مضان المزمن مع الخلوية القرار عبر طبقات القشرية متعددة في الفئران تتصرف بحرية. استخدمنا المجهر مضان متكامل مضغوط يقترن مسبار المنشور زرع لتصور في وقت واحد وتسجيل ديناميات الكالسيوم من مئات الخلايا العصبية عبر طبقات متعددة من القشرة الحسية الجسدية كما الفأر تعمل في مهمة استكشاف كائن رواية، على مدى عدة أيام. هذه التقنية يمكن أن تتكيف مع مناطق الدماغ الأخرى في أنواع حيوانية مختلفة ل p السلوكية الأخرىaradigms.

<html> بروتوكول موضح هنا يصف وسيلة فعالة وفعالة لأداء طولية متعدد الطبقات كا 2 + التصوير من مئات الخلايا العصبية القشرية في الفئران تتصرف بحرية باستخدام تحقيقات المنشور ( الشكل 1 ). المقاربات السابقة نحو التصوير القشري متعدد الطبقات قد اقتصرت في المقام الأول على الحيوانات الثابتة الرأس 22 ، 23 ، 24 ، 25 ، 26 ، 27 . من أجل الحصول على هذا المستوى من البيانات في سياق يتصرف بحرية، تم استخدام منصة المجهر المنمنمة للمرونة السلوكية. تم استخدام مؤشر الكالسيوم المشفر وراثيا (GCaMP6f) لاستهداف مجموعة خلايا معينة (كامكي + خلايا في القشرة)؛ وتم اختيار مسبار المنشور لتوفير مجال مزمن، متعدد الطبقات من الرأي. -together.within-بادج = &quot;1&quot;&gt; أظهرنا سير العمل لإعداد الحيوان للتصوير. تم حقن ناقلات فيروسية ترميز مؤشر الكالسيوم المناسب في القشرة ( الشكل 2 ، الخطوة 1)، قبل زرع مزمن مسبار المنشور لتمكين الوصول البصري إلى الخلايا المسمى ( الشكل 2 ، الخطوة 2). ثم تم تركيب لوحة الأساس التي تعمل بمثابة قفص الاتهام آمنة ومؤقتة لتحديد المواقع من المجهر خلال جلسات التصوير على رأس الحيوان ( الشكل 2 ، الخطوة 3)، مما يتيح تصور النشاط القشرية عبر طبقات الخلايا متعددة في مستيقظا يتصرف التجريبي الإعداد ( الشكل 2 ، الخطوة 4). لضمان استهداف السكان الخلوية المطلوب، يظهر قسم الدماغ الاكليلية بعد الوفاة من الماوس التمثيلي في الشكل 3 مع المسالك التحقيق المنشور ومجال الرؤية ملحوظ نسبة إلى مختبر GCaMP6fالخلايا العصبية إليد في الطبقات 2/3 و 5 من القشرة الحسية الجسدية. خلال التصوير مستيقظا مع النظام، تم تسجيل نشاط الخلايا العصبية القشرية الحسية الجسدية عندما تعرض الماوس لثلاثة بيئات مختلفة - حقل مفتوح (يوم 1)، كائن المعرفة (يوم 2-4) وجوه رواية (يوم 5) ( الشكل 4 ). في يوم 1 وضعت الماوس في الساحة السلوكية خالية من أي كائنات. في يوم 2-4 وضعت الماوس في الساحة مع نفس اثنين من الكائنات تكستورالي مختلفة (وسادة هلام وكتلة الخشب). في يوم 5، تم استبدال واحد من الكائنات مع كائن رواية. تم تصوير الحيوان خلال 5 أيام لمدة 20 دقيقة كل يوم. بعد استخراج الخلية باستخدام برنامج تحليل البيانات صورة كا 2 + ، كانت المرشحات المكانية المقابلة لمواقع الخلايا مضافين على متوسط ​​إسقاط كثافة الفلورسنت من بيانات تسجيل المجهر( الشكل 5) . وهناك خط أبيض متقطع يفصل بين الطبقات 2/3 و 5 خلايا. المقابلة كا 2 + آثار من 5 خلايا من كل من طبقات تظهر نمط اطلاق النار من الخلايا في اثنين من السياقات السلوكية المختلفة- كائن المعرفة والتعرض كائن رواية. طبقة 2/3 الخلايا كانت أكثر نشاطا مقارنة مع طبقة 5 خلايا في اليوم عندما تعرض الماوس لجسم رواية. وهذا واضح أيضا من المؤامرات النقطية التي تظهر النشاط اطلاق عتبة من جميع الخلايا المصورة في الأيام 1 و 4 و 5. <img alt="شكل 1" src="/files/ftp_upload/55579/55579fig1.jpg" /> الشكل 1: في فيفو كا 2 + التصوير عبر الطبقات القشرية متعددة في الفئران تتحرك بحرية. ( A ) مواصفات مسبار المنشور وتصوير الطائرة التصوير. طلاء عاكس في الداخل من الوتر يسمح للتصوير 90 درجة من الطائرة الإدراج من التحقيق المنشور. العدسة سوفف يتكامل مع حامل العدسة، الذي يبسط إجراء زرع ويسمح للعرض المحتمل من مضان الأنسجة المحيطة أثناء زرع ( B ) (ط). رسم توضيحي لوضع موضعي التحقيق حج القحف وسكين شق نسبة إلى موقع الحقن الفيروس، و (إي) التوضيح لموقع التحقيق المنشور الجانب المسطح نسبة إلى شق السكين وموقع حقن الفيروس. ( C ) التوضيح من في الجسم الحي كا 2 + الإعداد التصوير تظهر مسار الضوء لمنطقة صغيرة في مجال كامل للعرض من خلال التحقيق المنشور زرعها في قشرة الفأر. ( D ) مثال مجال الرؤية أثناء تثبيت مسبار المنشور. يتم إرفاق المجهر مصغرة إلى حامل العدسة، الذي يحمل التحقيق المنشور يسمح لفحص التعبير الفيروس خلال التثبيت التحقيق المنشور. ( E ) دمج المجهر مع التحقيق المنشور لتصوير القشرية متعددة الطبقات من GCaMP6f المسمى الخلايا S1. F مثال مجال الرؤيةخلال تركيب لوحة الأساس. واضح نمط الأوعية الدموية مرئية في وقت تركيب لوحة الأساس مع بعض الخلايا في صورة خام. المزيد من الخلايا مرئية بوضوح عند تشغيل دف / F في نافذة برنامج الاستحواذ. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55579/55579fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/55579/55579fig2.jpg" /> الشكل 2: التخطيطي عرض الجدول الزمني لسير العمل أحداث للبشرية التحقيق زرع وتركيب المجهر. ويمثل عدد الأسابيع على المحور السيني وخطوات سير العمل للإجراءات على طول المحور Y. ( A ) الرسم التوضيحي حقن الفيروسي (AAV1.CaMKII.GCaMP6f.WPRE.SV40) على طول نفس محور ظهري بطني، لتسمية طبقات متعددة من القشرة الحسية الجسدية الماوس. ( B ) 2 أسابيع الحقن بعد الفيروس، وهو المنشور المنشوريتم زرع ه في محور مواز لمواقع حقن الفيروس. ( C ) بعد أسبوع تقريبا من زرع التحقيق المنشور، يتم فحص الحيوان للتعبير مع المجهر ويتم تركيب لوحة قاعدة على الرأس إذا كان عدد من الخلايا مرئية. ( D ) الحيوان هو ثم على استعداد للتصوير المزمن أثناء المهام السلوكية ذات الصلة (ماوس كليب الفن تعديل بعد إذن من UW- ماديسون الكيمياء الحيوية ميديالاب). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55579/55579fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل 3" src="/files/ftp_upload/55579/55579fig3.jpg" /> الشكل 3: التحقق من صحة النسيج بعد الوفاة من موقع مسبار المنشور والتعبير غمب. ( A ) القسم الاكليلية من الدماغ الماوس تمثيلية تظهر المسالك التحقيق المنشور ومع الجانب التصوير التي تواجههاوالخلايا المعبر عنها GCAMP6f (AAV1.CaMKII.GCaMP6f أعرب في الخلايا العصبية في طبقات 2/3 و 5). ( ب ) نفس قسم الدماغ الاكليلية التالية تلطيخ ل دابي. شريط مقياس = 250 ميكرون ( C ) التكبير في رأي الخلايا GCaMP6f معربا في القشرة الحسية الجسدية. شريط مقياس = 100 ميكرون. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55579/55579fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل 4" src="/files/ftp_upload/55579/55579fig4.jpg" /> الشكل 4: نشاط الماوس أثناء التعود، والتعرف، واختبار التعرض للكائنات الجديدة تم تتبع الفيديو باستخدام برامج الفيديو. ( A ) في يوم 1، وضعت الحيوان في الساحة السلوكية خالية من أي كائنات (حقل مفتوح). ( ب ) في أيام 2-4، وضعت نفس اثنين من الكائنات تكستورالي مختلفة (وسادة هلام وكتلة الخشب) في الساحة (كائن فاميliarization). ( C ) في يوم 5، تم استبدال واحد من الكائنات مع كائن رواية (كتلة الخشب مع ورقة الرمال) (رواية التعرض كائن). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55579/55579fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل 5" src="/files/ftp_upload/55579/55579fig5.jpg" /> الشكل 5: ديناميات الكالسيوم من الطبقات السطحية والعميقة من اللحاء الحسية الجسدية من ماوس ممثل تصوير مع المجهر. ( A ) صورة مدمجة من المرشحات المكانية العصبية (النقط الخضراء) ومتوسط ​​الإسقاط كثافة الإسقاط من تسجيل المجهر من خلال مجال التحقيق المنشور للعرض. الحدود بين الطبقات فوق الحبيبية والداخلية المشار إليها بخط أبيض متقطع. شريط مقياس = 100 ميكرون. ( ب ) آثار الكالسيوم من خمسة مثال سطحية وخلايا طبقة عميقة (شغل الأزرق والأحمر جألس في لوحة A)، مشيرا إلى وحدات الانحراف المعياري من مضان التالية الرئيسية وتحليل المكون المستقل. شريط مقياس أفقي 50 ثانية وبار عمودي مقياس 10 سد ( C ) مؤامرة النقطية من الخلايا من سطحية (طبقات 2/3) وطبقات عميقة (طبقة 5) التي تظهر على حقل مفتوح، كائن دراية واستكشاف كائن رواية. شريط مقياس = 100 ثانية. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55579/55579fig5large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Multi-layer Cortical Ca2+ Imaging in Freely Moving Mice with Prism Probes and Miniaturized Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Multi-layer Cortical Ca2+ Imaging in Freely Moving Mice with Prism Probes and Miniaturized Fluorescence Microscopy

هنا، نقدم إجراء لأداء على نطاق واسع كا 2 + التصوير مع الخلوية القرار عبر طبقات القشرية متعددة في الفئران تتحرك بحرية. ويمكن ملاحظة مئات من الخلايا النشطة في وقت واحد باستخدام مصغرة، المجهر محمولة على الرأس إلى جانب مسبار المنشور زرع.

متعدد الطبقات الكالسيوم الكالسيوم<sup&gt; 2+</sup&gt; التصوير في الفئران تتحرك بحرية مع تحقيقات بريزم والمصور المجهري مضان

In vivo circuit and cellular level functional imaging is a critical tool for understanding the brain in action. High resolution imaging of mouse cortical ...

Research

JoVE Journal

Behavior

Multi-layer Cortical Ca2+ Imaging in Freely Moving Mice with Prism Probes and Miniaturized Fluorescence Microscopy

Functional Magnetic Resonance Imaging (fMRI) with Auditory Stimulation in Songbirds

Functional Magnetic Resonance Imaging fMRI with Auditory Stimulation in Songbirds

التصوير بالرنين المغناطيسي الوظيفي (الرنين المغناطيسي الوظيفي) مع التحفيز السمعي في الطيور المغردة

The neurobiology of birdsong, as a model for human speech, is a pronounced area of research in behavioral neuroscience. Whereas electrophysiology and ...

Long-term Potentiation of Perforant Pathway-dentate Gyrus Synapse in Freely Behaving Mice

التقوية طويلة الأمد من المسار الثاقب-التلفيف المسنن سنبس في يتصرفون بحرية الفئران

Studies of long-term potentiation of synaptic efficacy, an activity-dependent synaptic phenomenon having properties that make it attractive as a potential ...

Two-photon Calcium Imaging in Mice Navigating a Virtual Reality Environment

ثنائي الفوتون التصوير الكالسيوم في الفئران التنقل إلى هذا الشخص واقع البيئة

In recent years, two-photon imaging has become an invaluable tool in neuroscience, as it allows for chronic measurement of the activity of genetically ...

Quantitative Assessment of Cortical Auditory-tactile Processing in Children with Disabilities

التقييم الكمي للمعالجة السمعية القشرية عن طريق اللمس لدى الأطفال ذوي الإعاقة

Objective and easy measurement of sensory processing is extremely difficult in nonverbal or vulnerable pediatric patients. We developed a new methodology ...

Measurement of Fronto-limbic Activity Using an Emotional Oddball Task in Children with Familial High Risk for Schizophrenia

قياس النشاط الجبهي الحوفي باستخدام العاطفي غريب الاطوار العمل في الأطفال الذين يعانون من مخاطر عالية العائلي لمرض الفصام

Adolescence is a critical developmental period where the early symptoms of schizophrenia frequently emerge. First-degree relatives of people with ...

Flat-floored Air-lifted Platform: A New Method for Combining Behavior with Microscopy or Electrophysiology on Awake Freely Moving Rodents

مسطحة طوابق منصة رفع الهواء و: طريقة جديدة للجمع بين السلوك مع الميكروسكوب أو الكهربية على استيقظ تتحرك بحرية القوارض

It is widely acknowledged that the use of general anesthetics can undermine the relevance of electrophysiological or microscopical data obtained from a ...

The Modified Hole Board - Measuring Behavior, Cognition and Social Interaction in Mice and Rats

مجلس هول التعديل - قياس السلوك، الإدراك والتفاعل الاجتماعي في الفئران والجرذان

This protocol describes the modified hole board (mHB), which combines features from a traditional hole board and open field and is designed to measure ...

Simultaneous Transcranial Alternating Current Stimulation and Functional Magnetic Resonance Imaging

في وقت واحد عبر الجمجمة بالتناوب التحفيز الحالي والرنين المغناطيسي التصوير بالرنين الوظيفي

Transcranial alternating current stimulation (tACS) is a promising tool for noninvasive investigation of brain oscillations. TACS employs ...

Reversible Cooling-induced Deactivations to Study Cortical Contributions to Obstacle Memory in the Walking Cat

ديكتيفاتيونس عكسها المستحثة بالتبريد لدراسة المساهمات القشرية للذاكرة عقبة في القط المشي

On complex, naturalistic terrain, sensory information about an environmental obstacle can be used to rapidly adjust locomotor movements for avoidance. For ...

A Wireless, Bidirectional Interface for In Vivo Recording and Stimulation of Neural Activity in Freely Behaving Rats

A Wireless, Bidirectional Interface for In Vivo Recording and Stimulation of Neural Activity in Freely Behaving Rats

جهاز لاسلكي، واجهة ثنائية الاتجاه للتسجيل في فيفو وحفز النشاط العصبي في التصرف بحرية الفئران

In vivo electrophysiology is a powerful technique to investigate the relationship between brain activity and behavior at a millisecond and micrometer ...