Name: multi-layer cortical ca2+ imaging in freely moving mice with prism probes and miniaturized fluorescence microscopy
Uploaded: 2017-06-13T12:30:00
Duration: 10 min 35 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multi-layer Cortical Ca2+ Imaging in Freely Moving Mice with Prism Probes and Miniaturized Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Forfatterne vil gerne takke V. Jayaraman, DS Kim, LL Looger og K. Svoboda fra Genie-projektet (Genie-Encoded Neuronal Indicator and Effector) på Janelia Research Campus i Howard Hughes Medical Institute for deres generøse donation af AAV1-GCaMP6f Til University of Pennsylvania Vector Core. De vil også gerne takke A. Olson og Neuroscience Microscopy Core ved Stanford University støttet af NIH NS069375 tilskud til deres konfokale mikroskopi tjenester.

<ol>
	<li>McConnell, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+decision-making+in+the+mammalian+cerebral+cortex.">Development and decision-making in the mammalian cerebral cortex.</a> Brain Res. 472 (1), 1-23 (1988).</li><li>Kwon, S. E., Yang, H., Minamisawa, G., O'Connor, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensory+and+decision-related+activity+propagate+in+a+cortical+feedback+loop+during+touch+perception.">Sensory and decision-related activity propagate in a cortical feedback loop during touch perception.</a> Nat. Neurosci. 19 (9), 1243-1249 (2016).</li><li>Miller, E. K., Cohen, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrative+theory+of+prefrontal+cortex+function.">An integrative theory of prefrontal cortex function.</a> Annu. Rev. Neurosci. 24, 167-202 (2001).</li><li>Bailey, M. R., Simpson, E. H., Balsam, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+substrates+underlying+effort,+time,+and+risk-based+decision+making+in+motivated+behavior.">Neural substrates underlying effort, time, and risk-based decision making in motivated behavior.</a> Neurobiol. Learn. Mem. 133, 233-256 (2016).</li><li>Dehaene, S., Changeux, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reward-dependent+learning+in+neuronal+networks+for+planning+and+decision+making.">Reward-dependent learning in neuronal networks for planning and decision making.</a> Prog. Brain Res. 126, 217-229 (2000).</li><li>Ferenczi, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prefrontal+cortical+regulation+of+brainwide+circuit+dynamics+and+reward-related+behavior.">Prefrontal cortical regulation of brainwide circuit dynamics and reward-related behavior.</a> Science. 351 (6268), aac9698 (2016).</li><li>Anomal, R. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+Processing+in+the+Primary+Auditory+Cortex+of+an+Animal+Model+of+Autism.">Impaired Processing in the Primary Auditory Cortex of an Animal Model of Autism.</a> Front. Sys. Neurosci. 9, 158 (2015).</li><li>Pauls, D. L., Abramovitch, A., Rauch, S. L., Geller, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obsessive-compulsive+disorder:+an+integrative+genetic+and+neurobiological+perspective.">Obsessive-compulsive disorder: an integrative genetic and neurobiological perspective.</a> Nat. Rev. Neurosci. 15 (6), 410-424 (2014).</li><li>Ziv, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+dynamics+of+CA1+hippocampal+place+codes.">Long-term dynamics of CA1 hippocampal place codes.</a> Nat. Neurosci. 16 (3), 264-266 (2013).</li><li>Jennings, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+hypothalamic+network+dynamics+for+appetitive+and+consummatory+behaviors.">Visualizing hypothalamic network dynamics for appetitive and consummatory behaviors.</a> Cell. 160 (3), 516-527 (2015).</li><li>Betley, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurons+for+hunger+and+thirst+transmit+a+negative-valence+teaching+signal.">Neurons for hunger and thirst transmit a negative-valence teaching signal.</a> Nature. 521 (7551), 180-185 (2015).</li><li>Sun, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+speed+dependence+of+entorhinal+island+and+ocean+cells,+including+respective+grid+cells.">Distinct speed dependence of entorhinal island and ocean cells, including respective grid cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 112 (30), 9466-9471 (2015).</li><li>Kitamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entorhinal+Cortical+Ocean+Cells+Encode+Specific+Contexts+and+Drive+Context-Specific+Fear+Memory.">Entorhinal Cortical Ocean Cells Encode Specific Contexts and Drive Context-Specific Fear Memory.</a> Neuron. 87 (6), 1317-1331 (2015).</li><li>Pinto, L., Dan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-Type-Specific+Activity+in+Prefrontal+Cortex+during+Goal-Directed+Behavior.">Cell-Type-Specific Activity in Prefrontal Cortex during Goal-Directed Behavior.</a> Neuron. 87 (2), 437-450 (2015).</li><li>Cox, J., Pinto, L., Dan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+imaging+of+sleep-wake+related+neuronal+activity+in+the+dorsal+pons.">Calcium imaging of sleep-wake related neuronal activity in the dorsal pons.</a> Nat. Comm. 7, 10763 (2016).</li><li>Resendez, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+cortical,+subcortical+and+deep+brain+neural+circuit+dynamics+during+naturalistic+mammalian+behavior+with+head-mounted+microscopes+and+chronically+implanted+lenses.">Visualization of cortical, subcortical and deep brain neural circuit dynamics during naturalistic mammalian behavior with head-mounted microscopes and chronically implanted lenses.</a> Nat. Protoc. 11 (3), 566-597 (2016).</li><li>Hooks, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+cortical+and+thalamic+input+to+pyramidal+neurons+in+mouse+motor+cortex.">Organization of cortical and thalamic input to pyramidal neurons in mouse motor cortex.</a> The J. Neurosci. 33 (2), 748-760 (2013).</li><li>Masamizu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+distinct+layer-specific+dynamics+of+cortical+ensembles+during+learning+of+a+motor+task.">Two distinct layer-specific dynamics of cortical ensembles during learning of a motor task.</a> Nat. Neurosci. 17 (7), 987-994 (2014).</li><li>Rowland, D. C., Moser, M. -. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+cortical+modules+to+memories.">From cortical modules to memories.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 24 (1), 22-27 (2014).</li><li>Ghosh, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Miniaturized+integration+of+a+fluorescence+microscope.">Miniaturized integration of a fluorescence microscope.</a> Nat. Methods. 8 (10), 871-878 (2011).</li><li>Mukamel, E. A., Nimmerjahn, A., Schnitzer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+analysis+of+cellular+signals+from+large-scale+calcium+imaging+data.">Automated analysis of cellular signals from large-scale calcium imaging data.</a> Neuron. 63 (6), 747-760 (2009).</li><li>Andermann, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+cellular+imaging+of+entire+cortical+columns+in+awake+mice+using+microprisms.">Chronic cellular imaging of entire cortical columns in awake mice using microprisms.</a> Neuron. 80 (4), 900-913 (2013).</li><li>Goldey, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removable+cranial+windows+for+long-term+imaging+in+awake+mice.">Removable cranial windows for long-term imaging in awake mice.</a> Nat. Protoc. 9 (11), 2515-2538 (2014).</li><li>Chia, T. H., Levene, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+deep+cortical+layers+using+a+microprism.">In vivo imaging of deep cortical layers using a microprism.</a> J. Vis. Exp. (30), (2009).</li><li>Chia, T. H., Levene, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microprisms+for+in+vivo+multilayer+cortical+imaging.">Microprisms for in vivo multilayer cortical imaging.</a> J. Neurophysiol. 102 (2), 1310-1314 (2009).</li><li>Chia, T. H., Levene, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-layer+in+vivo+imaging+of+neocortex+using+a+microprism.">Multi-layer in vivo imaging of neocortex using a microprism.</a> Cold Spring Harb. Protoc. 2010 (8), (2010).</li><li>Low, R. J., Gu, Y., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+resolution+optical+access+to+brain+regions+in+fissures:+imaging+medial+prefrontal+cortex+and+grid+cells+in+entorhinal+cortex.">Cellular resolution optical access to brain regions in fissures: imaging medial prefrontal cortex and grid cells in entorhinal cortex.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 111 (52), 18739-18744 (2014).</li><li>Zeisel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+structure.+Cell+types+in+the+mouse+cortex+and+hippocampus+revealed+by+single-cell+RNA-seq.">Brain structure. Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq.</a> Science. 347 (6226), 1138-1142 (2015).</li><li>Hawrylycz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inferring+cortical+function+in+the+mouse+visual+system+through+large-scale+systems+neuroscience.">Inferring cortical function in the mouse visual system through large-scale systems neuroscience.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 113 (27), 7337-7344 (2016).</li><li>Petrof, I., Viaene, A. N., Sherman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+the+primary+somatosensory+cortex+projection+to+the+primary+motor+cortex+in+the+mouse.">Properties of the primary somatosensory cortex projection to the primary motor cortex in the mouse.</a> J. Neurophysiol. 113 (7), 2400-2407 (2015).</li><li>Aronoff, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-range+connectivity+of+mouse+primary+somatosensory+barrel+cortex.">Long-range connectivity of mouse primary somatosensory barrel cortex.</a> Euro. J. Neurosci. 31 (12), 2221-2233 (2010).</li><li>Rogan, S. C., Roth, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remote+control+of+neuronal+signaling.">Remote control of neuronal signaling.</a> Pharma. Rev. 63 (2), 291-315 (2011).</li><li>Berdyyeva, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zolpidem+reduces+hippocampal+neuronal+activity+in+freely+behaving+mice:+a+large+scale+calcium+imaging+study+with+miniaturized+fluorescence+microscope.">Zolpidem reduces hippocampal neuronal activity in freely behaving mice: a large scale calcium imaging study with miniaturized fluorescence microscope.</a> PloS One. 9 (11), e112068 (2014).</li></ol>

Forfatterne har læst tidsskriftets politik og har følgende konkurrerende interesser: SG, SO og VC betales medarbejdere hos Inscopix.

Forståelse af neuralt kredsløbsaktivitet under vågen adfærd er et vigtigt niveau af neurovidenskabelig undersøgelse, der er nødvendig for effektivt at dissekere hjernens funktion i sundhed og sygdom. Cortex er en særlig vigtig region at studere i forbindelse med vågen opførsel, da den spiller en vigtig rolle i mange vitale sensoriske, kognitive og udøvende funktioner 28 , 29 . Den kortikale søjle antages at være den grundlæggende funktionelle enhed i cortexen, og populationsniveauaktiviteten af ​​corticalceller er kendt for at variere baseret på deres fysiske placering i søjlen. Eksempelvis ekspiratoriske neuroner i lag 2/3 i den somatosensoriske cortex projekterer primært til andre neokortiske regioner og modulerer andre kortikale netværk 30 , mens celler i dybere lag primært rammer subkortale områder som thalamus 31 . Optagelse af aktiviteten af ​​hundredeS af forudbestemte corticalceller samtidig og pålideligt over tid på tværs af forskellige laminer i fritt optrængende emner vil i høj grad fremme vores forståelse af cortical informationsstrøm, hvilket muliggør en finere funktionel dissektion af cortikale søjler informeret af realtids adfærdsmæssige oplysninger og opgaverelevant tids- skalaer. Indsamling af dette niveau af neurale kredsløbsdata er muliggjort ved brug af en effektiv og strømlinet miniaturiseret mikroskopiplatform til at gennemføre storskaleret Ca 2+ -billeddannelse i frit opførende emner (eller hovedfokuserede emner som ønsket). Anvendes med genetisk kodede calciumindikatorer til at muliggøre specifik målretning af celletype og billeddannelse af et flerlags synsfelt tilvejebragt af en kronologisk implanteret prisme-probe, undersøgte denne protokol én sag blandt mange mulige anvendelser: observering af laminære forskelle i somatosensorisk kortikal behandling, når mus Fysisk engageret med en ny genstand ( figur 5 ).Dette er den første proceduremæssige illustration af denne type celle-type specifik, in vivo tilgang til at studere flere kortikale lag i våde, fritt opfølgende dyr og udvider spektret af forsøgsmetoder til rådighed for at forstå laminære strukturer i den aktive hjerne. Det periskopiske synsfelt aktiveret af prisme sonden i denne teknik kan med fordel anvendes på andre hjernestrukturer, når bevaring af vævet direkte dorsalt til en region af interesse er ønsket; For eksempel kan CA3 billeddannelse opnås uden forstyrrelse af hippocampal funktion. Prismatsbaseret tilgang til billeddannelse Ca 2+ aktivitet kræver fysisk indsættelse og permanent implantation af en mikroprism i cortexen, hvilket svarer til dannelsen af ​​en kortikal læsion, hvor linsensonden er indsat. Dette kan resultere i forstyrrelser af det lokale neurale kredsløb, herunder afbrydelse af apikale dendritter og processer. THans procedure vil også forårsage en initial aktivering af glialceller i regionen, selv om dette forventes at være lokaliseret til vævet omkring 150 μm fra prismatfladen og at aftage efter at hjernen har helet 22 . Det er meget vigtigt at overveje, om denne teknik vil påvirke dyrets normale kredsløbsanatomi og / eller opførsel ved planlægning af forsøg. Adfærdskontrolgrupper bør altid udføres for at sikre, at der ikke er nogen signifikante ændringer i baseline-adfærd, der kan forårsage forvirrende eksperimentelle resultater. Ved hjælp af denne miniaturiserede mobile Ca 2+ -billedteknik med neurofarmakologisk manipulation kan forskellige kognitive, sociale, motoriske eller indre adfærdsmæssige paradigmer kombineres med andre fysiologiske målinger uddybe og berige studier, der fokuserer på at forstå neurale kredsløbs funktionelle roller i adfærd og signal Behandling 32 . Suppression eller aktivAtion af bestemte veje moduleret af lægemidler kan påvirke tilknyttede adfærd, som let kan undersøges ved hjælp af denne teknologi 33 . Forgrening i forskellige celletyper ved at ændre målretningen for calciumindikatoren er en anden kraftfuld og nyttig applikation og muliggør mange kreative kombinationer af eksperimentelle værktøjer til at behandle forskellige neurale kredsløbsspørgsmål.

Cortex er en vigtig spiller i mange komplekse mentale og adfærdsmæssige funktioner, fra opmærksomhed, sensorisk opfattelse og top-down kognitiv kontrol 1 , 2 , 3 til motiverende, belønning og afhængighedsveje 4 , 5 . At forstå de beregningsmæssige processer, der ligger til grund for dens funktion, er et vigtigt mål at opnå en bedre klinisk forståelse af mange mentale og adfærdsmæssige lidelser. Mange aktuelle teorier om psykiatrisk sygdom drejer sig om ideen om, at kortikale neurale kredsløbsforstyrrelser eller diskoordination kan understøtte kognitive og adfærdsmæssige abnormiteter, der er kendetegnene for tilstande som skizofreni 6 , autisme 7 eller obsessiv-kompulsiv lidelse 8 . Således opnår man niveau for neurale aktivitetsdata fra coRtiske kredsløb inden for den rette sammenhæng med samtidige adfærdsmæssige oplysninger er af stor betydning og kan ideelt set målrettes mod specifikke celletyper til finere neuralkredsløshed. Miniaturiserede mikroskoper i forbindelse med implanterbare gradientbrydningsindeks (GRIN) mikrolenser muliggør optisk adgang til neuronelle ensembler under frit bevægelige betingelser fra en mangfoldighed af mulige hjernegrupper 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , inklusiv cortex 14 , 15 , 16 . Anvendelse af et mobilt mikroskopisystem kombineret med genetisk kodede calciumindikatorer muliggør konsistent billeddannelse af den samme cellulære population, der omfatter hundreder af neuroner i løbet af dage til uger i mange hjerneområder 9 og kan væreGenetisk målrettet mod specifikke celletyper ved anvendelse af viral vektor eller transgene teknikker. Da cortex er kendt for at understøtte forskellige funktioner og forbinde til forskellige hjerneområder afhængigt af placeringen af ​​cellerne i den corticale lamina 17 , 18 , 19 , er vi interesserede i at opnå samtidig multilags neural aktivitet i våde, opfører fag. Her viser vi, hvordan man billediserer hundredvis af fluorescensmærkede neuroner i frit opførende mus i løbet af dage ved brug af det miniaturiserede fluorescensmikroskop 20 parret med en implanteret prisme probe, som giver et flertalsbillede af cortexen ( figur 1 ). Prismåben anvendt her består af to separate GRIN-objektiver: et prisme og et cylindrisk relæobjektiv ( Figur 1 ). Lyset fra mikroskopet spænder fluorescensmærkningenCeller placeret langs billedprofilens billedflade, efter at de er reflekteret ud fra hypotenussen af ​​prismedelen af ​​sonden. Det udsendte lys fra cellerne afspejler også ud fra prismehypotenusen, opsamles gennem mikroskopets mål og når sensoren i mikroskopet. Den prisme sonde, der anvendes i denne procedure, er tilpasset til nem brug med standard stereotaxisk udstyr. Det miniaturiserede fluorescensmikroskop 20 detekterer actionpotentiale-fremkaldte Ca2 + -transienter i neuronpopulationer med enkeltcelleopløsning, efter at disse celler er blevet specifikt mærket med Ca2 + -følsomme genetisk kodede fluorescerende indikatorer. I denne protokol injicerer vi Ca 2+ -indikator kodet i en viral vektor (AAV1.CaMKII.GCaMP6f.WPRE.SV40), implanterer en prisme sonde, installerer mikroskopet og dernæst opnår flere dage somatosensoriske (S1-bakben) neurale aktivitetsdata Fra et dyr udsættesD til nye objektoverflader under fri udforskning ( figur 2 ).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Neurostar Motorized 
			Ultra Precise Small Animal Stereotaxic Instrument</td>
			<td>Kopf</td>
			<td>Model 963SD</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereoscope</td>
			<td>Labomed</td>
			<td>Prima DNT</td>
			<td>Surgery and Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Rectal Thermistor Probe (.062&#34;/1.6mm diameter) - 1/4&#34; Jack</td>
			<td>FHC</td>
			<td>40-90-5D-02</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating Pad 5 X 12.5cm&#160;</td>
			<td>FHC</td>
			<td>40-90-2-07</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC Temperature Controller</td>
			<td>FHC</td>
			<td>40-90-8D</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsyringe Pump</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>UMP3 model; serial 155788 F110</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoFil 10&#956;L Syringe</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>NANOFIL</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 G Beveled Tip Nanofil NDL 2PK</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>NF35BV-2</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omnidrill35, 115-230V</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>503598</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Burrs for Micro Drill</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>19007-05</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nVista</td>
			<td>Inscopix</td>
			<td>100-001048</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV1.CaMKII.GCaMP6f.WPRE.SV40</td>
			<td>Penn Vector Core</td>
			<td>AV-1-PV3435</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketoprofen</td>
			<td>Victor Medical</td>
			<td>5487</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carprofen</td>
			<td>Victor Medical</td>
			<td>1699008&#160;</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Victor Medical</td>
			<td>1001054</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelfoam (Patterson Veterinary Supply Inc Gelfoam Sponge 12cmx7mm)</td>
			<td>Pfizer (Fisher Scientific)</td>
			<td>NC9841478</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5/45 forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-35</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-30</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting knives</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10055-12</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProView Implant Kit</td>
			<td>Inscopix</td>
			<td>100-000756</td>
			<td>Surgery and Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProView Prism Probe 1.0mm-Dia. ~4.3mm Length</td>
			<td>Inscopix</td>
			<td>100-000592</td>
			<td>Surgery and Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kwik-Sil adhesive pack of 2</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>KWIK-SIL</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kwik-Cast Sealant</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>KWIK-CAST</td>
			<td>Surgery and Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniature Optical Mounting Post</td>
			<td>Newport</td>
			<td>M-TSP-3</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Baseplate</td>
			<td>Inscopix</td>
			<td>BPL-2</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Baseplate Cover</td>
			<td>Inscopix</td>
			<td>BPC-2</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multi-layer cortical ca2+ imaging in freely moving mice with prism probes and miniaturized fluorescence microscopy

In vivo kredsløb og cellulært niveau funktionel billeddannelse er et kritisk redskab til at forstå hjernen i aktion. Højopløsningsbilleddannelse af musekortiske neuroner med tofotonmikroskopi har givet enestående indsigt i kortikal struktur, funktion og plasticitet. Disse undersøgelser er imidlertid begrænset til hoved faste dyr, hvilket reducerer den adfærdsmæssige kompleksitet, der er til rådighed til undersøgelse. I dette papir beskriver vi en procedure til udførelse af kronisk fluorescensmikroskopi med cellulær opløsning på tværs af flere kortikale lag i frie opførende mus. Vi brugte et integreret miniaturiseret fluorescensmikroskop parret med en implanteret prisme-probe til samtidig visualisering og registrering af calciumdynamikken hos hundredvis af neuroner på tværs af flere lag af den somatosensoriske cortex, idet musen forlovede en ny objektudforskningsopgave i flere dage. Denne teknik kan tilpasses til andre hjerneområder i forskellige dyrearter til andre adfærdsmæssige paradigms.

Den her beskrevne protokol beskriver en effektiv og effektiv måde at udføre langsgående multilag Ca2 + -billeddannelse fra hundredvis af kortikale neuroner i fritt opførende mus ved anvendelse af prismerprober ( figur 1 ). Tidligere tilgange til flerlags kortikal billeddannelse har primært været begrænset til hoved faste dyr 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 . For at erhverve dette niveau af data i en frit opfindsom kontekst blev en miniaturiseret mikroskopplatform brugt til adfærds fleksibilitet; En genetisk kodet calciumindikator (GCaMP6f) blev anvendt til at målrette en specifik cellepopulation (CAMKII + -celler i cortexen); Og en prisme sonde blev valgt til at tilvejebringe et kronisk multilags synsfelt. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; Vi demonstrerede arbejdsprocessen for at forberede dyret til billeddannelse. En viral vektor kodende for en passende calciumindikator blev injiceret i cortexen ( figur 2 , trin 1), før kronisk implantering af en prisme sonde for at muliggøre optisk adgang til de mærkede celler ( figur 2 , trin 2). En basisplade, der tjener som en sikker midlertidig dock til positionering af mikroskopet under billedbehandlinger, blev derefter installeret over dyrets hoved ( Figur 2 , Trin 3), hvilket muliggør visualisering af kortikal aktivitet på tværs af flere cellelag i en vågen, opfører eksperimentel Opsætning ( figur 2 , trin 4). For at sikre, at den ønskede cellulære population blev målrettet, vises en post mortem-coronal hjerneafsnit fra en repræsentativ mus i figur 3 med prisme sondeområdet og synsfeltet markeret i forhold til GCaMP6f labEled neuroner i lag 2/3 og 5 af den somatosensoriske cortex. Under vågen opførsel af billeddannelse med systemet blev aktiviteten af ​​de somatosensoriske kortikale neuroner registreret, da musen blev udsat for tre forskellige miljøer - Åbent felt (Dag 1), Objektsidentifikation (Dag 2-4) og Noveltobjekt (Dag 5) ( Figur 4 ). På dag 1 blev musen anbragt i en adfærdsmæssig arena uden nogen objekter. På dag 2-4 blev musen anbragt i arenaen med de samme to teksturelt forskellige genstande (en gelpude og en træblok). På dag 5 blev en af ​​genstande erstattet af et nyt objekt. Dyret blev afbildet over 5 dage i 20 minutter hver dag. Efter celleekstraktion ved hjælp af Ca 2+ billeddataanalysesoftwaren blev rumlige filtre svarende til cellepositioner overlejret på den gennemsnitlige fluorescerende intensitetsprojektion af mikroskopoptagelsesdataene( Figur 5) . En hvid streget linje adskiller lag 2/3 og 5 celler. Tilsvarende Ca 2+ spor fra 5 celler fra hvert af lagene viser brændemønsteret for cellerne i to forskellige adfærdsmæssige sammenhænge - Objektbeskæftigelse og Novel Object Exposure. Lag 2/3 celler var mere aktive sammenlignet med lag 5 celler på den dag, hvor musen blev udsat for en ny genstand. Dette fremgår også af raster-plotterne, der viser tærskelværdierne for alle afbildede celler på dag 1, 4 og 5. <img alt="figur 1" src="/files/ftp_upload/55579/55579fig1.jpg" /> Figur 1: In vivo Ca 2+ Imaging over flere kortiske lag i frit bevægende mus. ( A ) Prism sonde specifikationer og afbildning af billedplan. Den reflekterende belægning på indersiden af ​​hypotenussen muliggør afbildning af 90 ° fra prismatsens indsætningsplan. Linsen cuFf integreres med objektivholderen, som strømlinierer implantationsproceduren og muliggør potentiel visning af omgivende vævsfluorescens under implantation ( B ) (i). Illustration af placering af prisme-probe craniotomi og knivindsnit i forhold til virussprøjtningsstedet, og (ii) illustration af placeringen af ​​prisme sonde flad side i forhold til knivindsnit og virusinjektionssted. ( C ) Illustration af in-vivo Ca 2+ billeddannelsesopsætning, der viser lysbanen for et lille område inden for det fulde synsfelt gennem prisme sonde implanteret i musekortex. ( D ) Eksempelvis synsfelt under prismatsinstallation. Miniaturemikroskop er fastgjort til objektivholderen, som holder prisme sonden muligt for at kontrollere virusekspression under prisme sonde installation. ( E ) Integration af mikroskop med prisme sonde til multilag kortortisk billeddannelse af GCaMP6f mærket S1 celler. F Eksempel synsfeltUnder bundpladeinstallation. Klar blodkar mønster er synligt på tidspunktet for bundpladen installere med nogle celler i rå billede. Flere celler er tydeligt synlige, når DF / F er tændt i vinduet til køb af software. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55579/55579fig1large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/55579/55579fig2.jpg" /> Figur 2: Skematisk Viser tidslinjen for Workflow Events for Prism Probe Implantation og Microscope Installation. Antal uger er repræsenteret på X-aksen og arbejdsgangstrinnene i procedurerne langs Y-aksen. ( A ) Grafisk illustrerende viral injektion (AAV1.CaMKII.GCaMP6f.WPRE.SV40) langs den samme dorso-ventrale akse for at mærke flere lag af musens somatosensoriske cortex. ( B ) 2 uger efter virusinjektioner, en prisme probE er implanteret ved en akse, der er parallel med virusinjektionsstederne. ( C ) Ca. en uge efter prismonsimplantationen kontrolleres dyret for ekspression med mikroskopet og en basisplade er monteret på hovedet, hvis en population af celler er synlig. ( D ) Dyret er så klar til kronisk billeddannelse under relevante adfærdsmæssige opgaver (museklip modificeret efter tilladelse fra- UW-Madison Biochemistry MediaLab). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55579/55579fig2large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/55579/55579fig3.jpg" /> Figur 3: Postmortem Histologisk Validering af Prism Probe Location og GCaMP Expression. ( A ) Koronale sektion fra en repræsentativ mushjerne, der viser prismodelkanalen og med dens billeddannelsesside vendtGCaMP6f-udtrykkende celler (AAV1.CaMKII.GCaMP6f udtrykt i neuroner i lag 2/3 og 5). ( B ) Samme koronale hjernesektion efter farvning for DAPI. Scale bar = 250 μm ( C ) Zoomet i lyset af GCaMP6f udtrykker celler i somatosensorisk cortex. Målestang = 100 μm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55579/55579fig3large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a> <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/55579/55579fig4.jpg" /> Figur 4: Musaktivitet under Habituation, Familiarization og Novel Object Exposure Testing blev videosporet ved hjælp af videosoftware. ( A ) På dag 1 blev dyret anbragt i en adfærdsmæssig arena uden nogen objekter (Open Field). ( B ) På dag 2-4 blev de samme to teksturelt forskellige genstande (gelpude og træblok) placeret i arenaen (Object Familiarization). ( C ) På dag 5 blev en af ​​genstande erstattet af en ny genstand (træblok med sandpapir) (Novel Object Exposure). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55579/55579fig4large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a> <img alt="Figur 5" src="/files/ftp_upload/55579/55579fig5.jpg" /> Figur 5: Kalsiumdynamik fra overfladiske og dybe lag af somatosensorisk cortex fra en repræsentativ mus, der er billedet med mikroskopet. ( A ) Flettet billede af neuronale rumlige filtre (grønne blobs) og gennemsnitlig fluorescensintensitetsprojektion af mikroskopoptagelse gennem prisme sonde synsfelt. Border mellem supragranulære og infragranulære lag indikeret med en hvid streget linje. Målestang = 100 μm. ( B ) Kalkspor fra fem eksempel overfladiske og dybe lagceller (fyldt blå og rødt cElls i panel A), der angiver enheder af standardafvigelse af fluorescens efter principiel og uafhængig komponentanalyse. Horisontal skala bar 50 s og lodret skala bar 10 SD ( C ) Raster plot af celler fra overfladiske (lag 2/3) og dybe lag (lag 5) vist over Åbent felt, Objekttegnelse og Novel objektudforskning. Skalestang = 100 s. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55579/55579fig5large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Multi-layer Cortical Ca2+ Imaging in Freely Moving Mice with Prism Probes and Miniaturized Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Multi-layer Cortical Ca2+ Imaging in Freely Moving Mice with Prism Probes and Miniaturized Fluorescence Microscopy

Her præsenterer vi en procedure til udførelse af storskala Ca 2+ -billeddannelse med cellulær opløsning på tværs af flere kortikale lag i frit bevægelige mus. Hundredvis af aktive celler kan observeres samtidigt ved hjælp af et miniature, hovedmonteret mikroskop kombineret med en implanteret prisme probe.

Flerlags Cortical Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Billeddannelse i frit bevægende mus med prismeprober og miniaturiseret fluorescensmikroskopi

In vivo circuit and cellular level functional imaging is a critical tool for understanding the brain in action. High resolution imaging of mouse cortical ...

Research

JoVE Journal

Behavior

Multi-layer Cortical Ca2+ Imaging in Freely Moving Mice with Prism Probes and Miniaturized Fluorescence Microscopy

Functional Magnetic Resonance Imaging (fMRI) with Auditory Stimulation in Songbirds

Functional Magnetic Resonance Imaging fMRI with Auditory Stimulation in Songbirds

Funktionel magnetisk resonans (fMRI) med Auditiv Stimulation i Songbirds

The neurobiology of birdsong, as a model for human speech, is a pronounced area of research in behavioral neuroscience. Whereas electrophysiology and ...

Long-term Potentiation of Perforant Pathway-dentate Gyrus Synapse in Freely Behaving Mice

Langsigtet Potentiering af perforante Pathway-dentatgyrus Synapse i frit Opfører Mus

Studies of long-term potentiation of synaptic efficacy, an activity-dependent synaptic phenomenon having properties that make it attractive as a potential ...

Two-photon Calcium Imaging in Mice Navigating a Virtual Reality Environment

To-foton Calcium Imaging i Mus navigerer en Virtual Reality Miljø

In recent years, two-photon imaging has become an invaluable tool in neuroscience, as it allows for chronic measurement of the activity of genetically ...

Quantitative Assessment of Cortical Auditory-tactile Processing in Children with Disabilities

Kvantitativ vurdering af Cortical Auditory-taktile Processing i Børn med handicap

Objective and easy measurement of sensory processing is extremely difficult in nonverbal or vulnerable pediatric patients. We developed a new methodology ...

Measurement of Fronto-limbic Activity Using an Emotional Oddball Task in Children with Familial High Risk for Schizophrenia

Måling af Fronto-limbiske aktivitet Brug af en følelsesmæssig Oddball Opgave i børn med Familiær høj risiko for skizofreni

Adolescence is a critical developmental period where the early symptoms of schizophrenia frequently emerge. First-degree relatives of people with ...

Flat-floored Air-lifted Platform: A New Method for Combining Behavior with Microscopy or Electrophysiology on Awake Freely Moving Rodents

Fladskærms-etagers Air-løftet Platform: en ny metode til at kombinere Behavior med Microscopy eller Elektrofysiologi på Awake Frit Moving Gnavere

It is widely acknowledged that the use of general anesthetics can undermine the relevance of electrophysiological or microscopical data obtained from a ...

The Modified Hole Board - Measuring Behavior, Cognition and Social Interaction in Mice and Rats

Den modificerede Hole Board - Måling Behavior, Erkendelse og social interaktion hos mus og rotter

This protocol describes the modified hole board (mHB), which combines features from a traditional hole board and open field and is designed to measure ...

Simultaneous Transcranial Alternating Current Stimulation and Functional Magnetic Resonance Imaging

Samtidig transcranial vekselstrømsstimulering og funktionel magnetisk resonansbilleddannelse

Transcranial alternating current stimulation (tACS) is a promising tool for noninvasive investigation of brain oscillations. TACS employs ...

Reversible Cooling-induced Deactivations to Study Cortical Contributions to Obstacle Memory in the Walking Cat

Vendbar køling-induceret deaktiveringer at studere kortikale bidrag til hindring hukommelse i den omvandrende kat

On complex, naturalistic terrain, sensory information about an environmental obstacle can be used to rapidly adjust locomotor movements for avoidance. For ...

A Wireless, Bidirectional Interface for In Vivo Recording and Stimulation of Neural Activity in Freely Behaving Rats

A Wireless, Bidirectional Interface for In Vivo Recording and Stimulation of Neural Activity in Freely Behaving Rats

En trådløs, tovejs grænseflade for In Vivo optagelse og Stimulation af neurale aktivitet i frit opfører rotter

In vivo electrophysiology is a powerful technique to investigate the relationship between brain activity and behavior at a millisecond and micrometer ...