Name: multi-layer cortical ca2+ imaging in freely moving mice with prism probes and miniaturized fluorescence microscopy
Uploaded: 2017-06-13T12:30:00
Duration: 10 min 35 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multi-layer Cortical Ca2+ Imaging in Freely Moving Mice with Prism Probes and Miniaturized Fluorescence Microscopy at JoVE.com

De auteurs danken V. Jayaraman, DS Kim, LL Looger en K. Svoboda van het Genetisch-Gecodeerde Neuronale Indicator en Effector (GENIE) Project op Janelia Research Campus van het Howard Hughes Medical Institute voor hun royale donatie van AAV1-GCaMP6f Naar de Universiteit van Pennsylvania Vector Core. Zij willen ook de A. Olson en Neuroscience Microscopy Core aan de Stanford University bedanken, ondersteund door NIH NS069375 subsidie ​​voor hun confocale microscopiediensten.

<ol>
	<li>McConnell, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+decision-making+in+the+mammalian+cerebral+cortex.">Development and decision-making in the mammalian cerebral cortex.</a> Brain Res. 472 (1), 1-23 (1988).</li><li>Kwon, S. E., Yang, H., Minamisawa, G., O'Connor, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensory+and+decision-related+activity+propagate+in+a+cortical+feedback+loop+during+touch+perception.">Sensory and decision-related activity propagate in a cortical feedback loop during touch perception.</a> Nat. Neurosci. 19 (9), 1243-1249 (2016).</li><li>Miller, E. K., Cohen, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrative+theory+of+prefrontal+cortex+function.">An integrative theory of prefrontal cortex function.</a> Annu. Rev. Neurosci. 24, 167-202 (2001).</li><li>Bailey, M. R., Simpson, E. H., Balsam, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+substrates+underlying+effort,+time,+and+risk-based+decision+making+in+motivated+behavior.">Neural substrates underlying effort, time, and risk-based decision making in motivated behavior.</a> Neurobiol. Learn. Mem. 133, 233-256 (2016).</li><li>Dehaene, S., Changeux, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reward-dependent+learning+in+neuronal+networks+for+planning+and+decision+making.">Reward-dependent learning in neuronal networks for planning and decision making.</a> Prog. Brain Res. 126, 217-229 (2000).</li><li>Ferenczi, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prefrontal+cortical+regulation+of+brainwide+circuit+dynamics+and+reward-related+behavior.">Prefrontal cortical regulation of brainwide circuit dynamics and reward-related behavior.</a> Science. 351 (6268), aac9698 (2016).</li><li>Anomal, R. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+Processing+in+the+Primary+Auditory+Cortex+of+an+Animal+Model+of+Autism.">Impaired Processing in the Primary Auditory Cortex of an Animal Model of Autism.</a> Front. Sys. Neurosci. 9, 158 (2015).</li><li>Pauls, D. L., Abramovitch, A., Rauch, S. L., Geller, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obsessive-compulsive+disorder:+an+integrative+genetic+and+neurobiological+perspective.">Obsessive-compulsive disorder: an integrative genetic and neurobiological perspective.</a> Nat. Rev. Neurosci. 15 (6), 410-424 (2014).</li><li>Ziv, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+dynamics+of+CA1+hippocampal+place+codes.">Long-term dynamics of CA1 hippocampal place codes.</a> Nat. Neurosci. 16 (3), 264-266 (2013).</li><li>Jennings, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+hypothalamic+network+dynamics+for+appetitive+and+consummatory+behaviors.">Visualizing hypothalamic network dynamics for appetitive and consummatory behaviors.</a> Cell. 160 (3), 516-527 (2015).</li><li>Betley, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurons+for+hunger+and+thirst+transmit+a+negative-valence+teaching+signal.">Neurons for hunger and thirst transmit a negative-valence teaching signal.</a> Nature. 521 (7551), 180-185 (2015).</li><li>Sun, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+speed+dependence+of+entorhinal+island+and+ocean+cells,+including+respective+grid+cells.">Distinct speed dependence of entorhinal island and ocean cells, including respective grid cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 112 (30), 9466-9471 (2015).</li><li>Kitamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entorhinal+Cortical+Ocean+Cells+Encode+Specific+Contexts+and+Drive+Context-Specific+Fear+Memory.">Entorhinal Cortical Ocean Cells Encode Specific Contexts and Drive Context-Specific Fear Memory.</a> Neuron. 87 (6), 1317-1331 (2015).</li><li>Pinto, L., Dan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-Type-Specific+Activity+in+Prefrontal+Cortex+during+Goal-Directed+Behavior.">Cell-Type-Specific Activity in Prefrontal Cortex during Goal-Directed Behavior.</a> Neuron. 87 (2), 437-450 (2015).</li><li>Cox, J., Pinto, L., Dan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+imaging+of+sleep-wake+related+neuronal+activity+in+the+dorsal+pons.">Calcium imaging of sleep-wake related neuronal activity in the dorsal pons.</a> Nat. Comm. 7, 10763 (2016).</li><li>Resendez, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+cortical,+subcortical+and+deep+brain+neural+circuit+dynamics+during+naturalistic+mammalian+behavior+with+head-mounted+microscopes+and+chronically+implanted+lenses.">Visualization of cortical, subcortical and deep brain neural circuit dynamics during naturalistic mammalian behavior with head-mounted microscopes and chronically implanted lenses.</a> Nat. Protoc. 11 (3), 566-597 (2016).</li><li>Hooks, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+cortical+and+thalamic+input+to+pyramidal+neurons+in+mouse+motor+cortex.">Organization of cortical and thalamic input to pyramidal neurons in mouse motor cortex.</a> The J. Neurosci. 33 (2), 748-760 (2013).</li><li>Masamizu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+distinct+layer-specific+dynamics+of+cortical+ensembles+during+learning+of+a+motor+task.">Two distinct layer-specific dynamics of cortical ensembles during learning of a motor task.</a> Nat. Neurosci. 17 (7), 987-994 (2014).</li><li>Rowland, D. C., Moser, M. -. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+cortical+modules+to+memories.">From cortical modules to memories.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 24 (1), 22-27 (2014).</li><li>Ghosh, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Miniaturized+integration+of+a+fluorescence+microscope.">Miniaturized integration of a fluorescence microscope.</a> Nat. Methods. 8 (10), 871-878 (2011).</li><li>Mukamel, E. A., Nimmerjahn, A., Schnitzer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+analysis+of+cellular+signals+from+large-scale+calcium+imaging+data.">Automated analysis of cellular signals from large-scale calcium imaging data.</a> Neuron. 63 (6), 747-760 (2009).</li><li>Andermann, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+cellular+imaging+of+entire+cortical+columns+in+awake+mice+using+microprisms.">Chronic cellular imaging of entire cortical columns in awake mice using microprisms.</a> Neuron. 80 (4), 900-913 (2013).</li><li>Goldey, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removable+cranial+windows+for+long-term+imaging+in+awake+mice.">Removable cranial windows for long-term imaging in awake mice.</a> Nat. Protoc. 9 (11), 2515-2538 (2014).</li><li>Chia, T. H., Levene, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+deep+cortical+layers+using+a+microprism.">In vivo imaging of deep cortical layers using a microprism.</a> J. Vis. Exp. (30), (2009).</li><li>Chia, T. H., Levene, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microprisms+for+in+vivo+multilayer+cortical+imaging.">Microprisms for in vivo multilayer cortical imaging.</a> J. Neurophysiol. 102 (2), 1310-1314 (2009).</li><li>Chia, T. H., Levene, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-layer+in+vivo+imaging+of+neocortex+using+a+microprism.">Multi-layer in vivo imaging of neocortex using a microprism.</a> Cold Spring Harb. Protoc. 2010 (8), (2010).</li><li>Low, R. J., Gu, Y., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+resolution+optical+access+to+brain+regions+in+fissures:+imaging+medial+prefrontal+cortex+and+grid+cells+in+entorhinal+cortex.">Cellular resolution optical access to brain regions in fissures: imaging medial prefrontal cortex and grid cells in entorhinal cortex.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 111 (52), 18739-18744 (2014).</li><li>Zeisel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+structure.+Cell+types+in+the+mouse+cortex+and+hippocampus+revealed+by+single-cell+RNA-seq.">Brain structure. Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq.</a> Science. 347 (6226), 1138-1142 (2015).</li><li>Hawrylycz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inferring+cortical+function+in+the+mouse+visual+system+through+large-scale+systems+neuroscience.">Inferring cortical function in the mouse visual system through large-scale systems neuroscience.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 113 (27), 7337-7344 (2016).</li><li>Petrof, I., Viaene, A. N., Sherman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+the+primary+somatosensory+cortex+projection+to+the+primary+motor+cortex+in+the+mouse.">Properties of the primary somatosensory cortex projection to the primary motor cortex in the mouse.</a> J. Neurophysiol. 113 (7), 2400-2407 (2015).</li><li>Aronoff, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-range+connectivity+of+mouse+primary+somatosensory+barrel+cortex.">Long-range connectivity of mouse primary somatosensory barrel cortex.</a> Euro. J. Neurosci. 31 (12), 2221-2233 (2010).</li><li>Rogan, S. C., Roth, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remote+control+of+neuronal+signaling.">Remote control of neuronal signaling.</a> Pharma. Rev. 63 (2), 291-315 (2011).</li><li>Berdyyeva, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zolpidem+reduces+hippocampal+neuronal+activity+in+freely+behaving+mice:+a+large+scale+calcium+imaging+study+with+miniaturized+fluorescence+microscope.">Zolpidem reduces hippocampal neuronal activity in freely behaving mice: a large scale calcium imaging study with miniaturized fluorescence microscope.</a> PloS One. 9 (11), e112068 (2014).</li></ol>

De auteurs hebben het beleid van het tijdschrift gelezen en hebben de volgende concurrerende belangen: SG, SO en VC zijn betaalde werknemers bij Inscopix.

Het begrijpen van neurale kringactiviteit tijdens wakker gedrag is een vitaal niveau van neurowetenschappelijk onderzoek dat nodig is om de hersenfunctie effectief in gezondheid en ziekte op te lossen. De cortex is een bijzonder belangrijk gebied om te studeren in het kader van wakker gedrag, omdat het een belangrijke rol speelt in vele vitale, cognitieve en uitvoerende functies 28 , 29 . De corticale kolom wordt beschouwd als de basisfunctionele eenheid in de cortex en populatie-niveau activiteit van corticale cellen is bekend om te verschillen op basis van hun fysieke locatie binnen de kolom. Bijvoorbeeld, excitatoire neuronen in lagen 2/3 in de somatosensorische cortex projecten in hoofdzaak naar andere neocortische gebieden en moduleren andere corticale netwerken 30 , terwijl cellen in dieper lagen vooral naar subcortische gebieden zoals de thalamus 31 raken. Opnemen van de activiteit van honderdS van vooraf gespecificeerde corticale cellen tegelijkertijd en betrouwbaar over de tijd over verschillende lamina&#39;s in vrijgedragen onderwerpen, zou ons begrip voor de corticale informatiestroom sterk verbeteren, waardoor een fijnere functionele dissectie van corticale kolommen wordt geïnformeerd door real-time gedragsinformatie en taakrelevante tijd- schalen. Het verzamelen van dit niveau van neurale kringsdata is mogelijk gemaakt door gebruik te maken van een efficiënt en gestroomlijnd miniaturiseerd microscopieplatform om grootschalig Ca 2+ beeldvorming in vrijgedragen onderwerpen (of hoofdonderwerpen zoals gewenst) uit te voeren. Gebruikt met genetisch gecodeerde calciumindicatoren om een ​​specifiek targeting van cellen te activeren en een multi-lags gezichtsveld voor te stellen die wordt geleverd door een chronisch geïmplanteerde prisma sonde, onderzoekt dit protocol onder veel mogelijke toepassingen: observatie van laminaire verschillen in somatosensorische corticale verwerking bij muizen Fysiek verloofd met een nieuw object ( figuur 5 ).Dit is de eerste procedurele illustratie van dit soort celtype specifieke, in vivo aanpak om meerdere corticale lagen te bestuderen bij wakker, vrij gedragen dieren en verbrengt het spectrum van experimentele methoden die beschikbaar zijn om laminaire structuren in de actieve hersenen te begrijpen. Het periscopische zichtveld dat door de prisma sonde in deze techniek wordt geactiveerd, kan haalbaar toegepast worden op andere hersenstructuren wanneer het behoud van het weefsel direct dorsaal naar een gebied van belang is gewenst; Bijvoorbeeld, CA3 beeldvorming kan worden bereikt zonder verstoring van de hippocampale functie. Prism sonde gebaseerde aanpak voor imaging Ca 2+ activiteit vereist de fysieke invoeging en permanente implantatie van een microprism in de cortex, die overeenkomt met de creatie van een corticale letsel waar de lens sonde wordt geplaatst. Dit kan leiden tot verstoringen van de lokale neurale schakeling, met inbegrip van de afscheiding van apische dendrieten en processen. TZijn procedure zal ook een initiële activering van glialcellen in het gebied veroorzaken, alhoewel dit naar verwachting wordt gelokaliseerd aan het weefsel ongeveer 150 μm van het prisma-gezicht en om te dalen nadat de hersenen 22 genezen hebben. Het is zeer belangrijk om te overwegen of deze techniek de normale anatomie en / of gedrag van de dieren beïnvloedt bij het plannen van experimenten. Gedragsgroepen moeten altijd worden uitgevoerd om ervoor te zorgen dat er geen significante veranderingen zijn in het basisgedrag dat kan leiden tot confounding experimentele resultaten. Met behulp van deze miniaturiseerde, mobiele Ca 2+ beeldvormingstechniek met neurofarmacologische manipulatie, verschillende cognitieve, sociale, motorische of intrinsieke gedragsparadigma&#39;s, en het combineren met andere fysiologische metrischen kunnen de studies worden verdiept en verrijkt die gericht zijn op het begrijpen van de functionele rollen van neurale schakelingen in gedrag en signaal Verwerking 32 . Onderdrukking of actiefAtion van bepaalde pathes, gemoduleerd door drugs, kan bijbehorend gedrag beïnvloeden, die gemakkelijk met deze technologie kan worden bestudeerd 33 . Uitbreiden in verschillende celtypes door de targeting van de calciumindicator te wijzigen is een andere krachtige en handige applicatie, en maakt het mogelijk om veel creatieve combinaties van experimentele hulpmiddelen aan te passen aan diverse neurale schakelvragen.

De cortex is een essentiële speler in veel complexe mentale en gedragsfuncties, van aandacht, zintuiglijke waarneming en top-down cognitieve controle 1 , 2 , 3 naar motivatie-, beloning- en verslavingsroutes 4 , 5 . Het begrijpen van de berekeningsprocessen die onder zijn functie staan, is een belangrijk doel om een ​​beter klinisch begrip te krijgen van veel mentale en gedragsstoornissen. Veel huidige theorieën van de psychiatrische ziekte concentreren zich op het idee dat corticale neurale circuits disfunctie of discoordinatie kan leiden tot cognitieve en gedragsafwijkingen die de kenmerken zijn van aandoeningen zoals schizofrenie 6 , autisme 7 of obsessieve-compulsieve stoornis 8 . Aldus, het verkrijgen van bevolkingsniveau neurale activiteit data van coRticale circuits binnen de juiste context van gelijktijdige gedragsinformatie is van groot belang en ideaal kan worden gericht op specifieke celtypen voor fijnere neurale circuit dissectie. Miniaturized microscopen in combinatie met implanteerbare gradiëntbrekingsindex (GRIN) microlenses zorgen voor optische toegang tot neuronale ensembles onder vrij bewegende omstandigheden uit een verscheidenheid aan mogelijke hersengebieden 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , inclusief de cortex 14 , 15 , 16 . Het gebruik van een mobiel microscopiesysteem gekoppeld aan genetisch gecodeerde calciumindicatoren zorgt voor consistent beeldvorming van dezelfde cellulaire populatie die honderden neuronen over dagen tot weken in veel hersenregio&#39;s 9 omvat en kan zijnGenetisch gericht op specifieke celtypen met behulp van virale vector of transgene technieken. Aangezien de cortex bekend is om verschillende functies te ondersteunen en te verbinden met verschillende hersengebieden afhankelijk van de locatie van de cellen binnen de corticale lamina 17 , 18 , 19 , zijn we geïnteresseerd in het verkrijgen van gelijktijdige multi-lags neurale activiteit bij wakker gedragen onderwerpen. Hier laten we zien hoe u honderden fluorescente gemerkte neuronen in vrije muizen over dagen kunt opnemen, met behulp van de geminomatiseerde fluorescentiemicroscoop 20 gepaard met een geïmplanteerde prisma sonde, die een multi-layer-weergave van de cortex biedt ( Figuur 1 ). De hier gebruikte prismodule bestaat uit twee afzonderlijke GRIN-objectieven: een prisma en een cilindrische relaislens ( Figuur 1 ). Het licht van de microscoop stimuleert het fluorescente labelCellen die zich langs het beeldvlak van de prisma sonde bevinden, na af te zien van de hypotenus van het prisma gedeelte van de sonde. Het uitgestraalde licht van de cellen weerspiegelt ook de hypotenuse van het prisma, wordt verzameld door middel van de microscoop en bereikt de sensor in de microscoop. De in deze procedure gebruikte prisma sonde is aangepast voor eenvoudig gebruik met standaard stereotaxische apparatuur. De geminiaturiseerde fluorescentiemicroscoop 20 detecteert actiepotentiaal-opgewekte Ca 2+ transiënten in neuronale populaties met enkele celresolutie, nadat die cellen specifiek zijn gemerkt met Ca 2+ -gevoelige genetisch gecodeerde fluorescentie-indicatoren. In dit protocol injecteren we Ca 2+ indicator die gecodeerd is in een virale vector (AAV1.CaMKII.GCaMP6f.WPRE.SV40), een prisma sonde implanteert, de microscoop installeert, dan meerdere dagen van somatosensorale (S1 achterste ledematen) neurale activiteit gegevens verkrijgen Van een dier blootstellenD tot nieuwe objectoppervlakken tijdens vrije exploratie ( Figuur 2 ).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Neurostar Motorized 
			Ultra Precise Small Animal Stereotaxic Instrument</td>
			<td>Kopf</td>
			<td>Model 963SD</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereoscope</td>
			<td>Labomed</td>
			<td>Prima DNT</td>
			<td>Surgery and Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Rectal Thermistor Probe (.062&#34;/1.6mm diameter) - 1/4&#34; Jack</td>
			<td>FHC</td>
			<td>40-90-5D-02</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating Pad 5 X 12.5cm&#160;</td>
			<td>FHC</td>
			<td>40-90-2-07</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC Temperature Controller</td>
			<td>FHC</td>
			<td>40-90-8D</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsyringe Pump</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>UMP3 model; serial 155788 F110</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoFil 10&#956;L Syringe</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>NANOFIL</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 G Beveled Tip Nanofil NDL 2PK</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>NF35BV-2</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omnidrill35, 115-230V</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>503598</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Burrs for Micro Drill</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>19007-05</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nVista</td>
			<td>Inscopix</td>
			<td>100-001048</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV1.CaMKII.GCaMP6f.WPRE.SV40</td>
			<td>Penn Vector Core</td>
			<td>AV-1-PV3435</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketoprofen</td>
			<td>Victor Medical</td>
			<td>5487</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carprofen</td>
			<td>Victor Medical</td>
			<td>1699008&#160;</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Victor Medical</td>
			<td>1001054</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelfoam (Patterson Veterinary Supply Inc Gelfoam Sponge 12cmx7mm)</td>
			<td>Pfizer (Fisher Scientific)</td>
			<td>NC9841478</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5/45 forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-35</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-30</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting knives</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10055-12</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProView Implant Kit</td>
			<td>Inscopix</td>
			<td>100-000756</td>
			<td>Surgery and Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProView Prism Probe 1.0mm-Dia. ~4.3mm Length</td>
			<td>Inscopix</td>
			<td>100-000592</td>
			<td>Surgery and Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kwik-Sil adhesive pack of 2</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>KWIK-SIL</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kwik-Cast Sealant</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>KWIK-CAST</td>
			<td>Surgery and Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniature Optical Mounting Post</td>
			<td>Newport</td>
			<td>M-TSP-3</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Baseplate</td>
			<td>Inscopix</td>
			<td>BPL-2</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Baseplate Cover</td>
			<td>Inscopix</td>
			<td>BPC-2</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multi-layer cortical ca2+ imaging in freely moving mice with prism probes and miniaturized fluorescence microscopy

In vivo circuit en cellulaire niveau functionele beeldvorming is een kritisch instrument om de hersenen in actie te begrijpen. Hoge resolutie beeldvorming van muiscorticale neuronen met twee-foton microscopie heeft unieke inzichten gegeven in corticale structuur, functie en plasticiteit. Echter, deze studies zijn beperkt tot hoofd vaste dieren, waardoor de gedragscomplexiteit die beschikbaar is voor studie sterk vermindert. In dit document beschrijven we een procedure voor het uitvoeren van chronische fluorescentiemicroscopie met cellulaire resolutie over meerdere corticale lagen in vrijgedragen muizen. We gebruikten een geïntegreerde miniaturiseerde fluorescentiemicroscoop die gepaard was met een geïmplanteerde prisma sonde om de calciumdynamiek van honderden neuronen tegelijkertijd over meerdere lagen van de somatosensaire cortex te visualiseren en op te nemen, aangezien de muis over enkele dagen in een nieuwe object exploratietaak betrokken was. Deze techniek kan worden aangepast aan andere hersenregio&#39;s in verschillende diersoorten voor andere gedragspatronenaradigms.

Het hier beschreven protocol beschrijft een effectieve en efficiënte manier om longitudinale multilayer Ca 2+ beeldvorming uit honderden corticale neuronen uit te voeren in vrij gedragen muizen met behulp van prisma sondes ( Figuur 1 ). Vorige benaderingen voor corticale beeldvorming met meerdere lagen zijn voornamelijk beperkt tot hoofd vaste dieren 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 . Om dit niveau van gegevens in een vrij gedragen context te verwerven, werd een miniatuur microscoopplatform gebruikt voor flexibiliteit van gedrag; Een genetisch gecodeerde calcium indicator (GCaMP6f) werd gebruikt om een ​​specifieke celpopulatie (CAMKII + cellen in de cortex) te targeten; En een prisma-sonde werd gekozen om een ​​chronisch multilaagbeeldveld te verschaffen. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; We hebben de workflow aangetoond voor het voorbereiden van het dier voor beeldvorming. Een virale vector die codeert voor een geschikte calciumindicator werd in de cortex geïnjecteerd ( Figuur 2 , Stap 1), voordat een prisma sonde chronisch wordt geïmplanteerd om optische toegang tot de gelabelde cellen mogelijk te maken ( Figuur 2 , Stap 2). Een basisplaat die als veilig, tijdelijke dok voor het positioneren van de microscoop tijdens beeldsessies wordt geïnstalleerd, werd vervolgens over het hoofd van het dier geïnstalleerd ( Figuur 2 , Stap 3), waardoor de visualisatie van corticale activiteit over meerdere cellagen in een wakker gedragen experimentele Setup ( afbeelding 2 , stap 4). Om ervoor te zorgen dat de gewenste cellulaire populatie werd gericht, wordt een post-mortem coronale hersensectie van een representatieve muis getoond in figuur 3 met het prisma sonde kanaal en het zichtveld gemarkeerd ten opzichte van het GCaMP6f labNeuronen in Lagen 2/3 en 5 van de somatosensorische cortex. Tijdens wekelijks gedragen beeldvorming met het systeem werd de activiteit van de somatosensorische corticale neuronen geregistreerd wanneer de muis werd blootgesteld aan drie verschillende omgevingen: Open Field (Dag 1), Object Familiarization (Dag 2-4) en Nieuw Object (Dag 5) ( Figuur 4 ). Op dag 1 werd de muis geplaatst op een gedrags arena zonder voorwerpen. Op dag 2-4 werd de muis in de arena geplaatst met dezelfde twee texturaal verschillende objecten (een geluidskussen en een houten blok). Op dag 5 werd één van de objecten vervangen door een nieuw object. Het dier werd gedurende 5 dagen voor 20 minuten per dag afgebeeld. Na de celontwinning met behulp van de Ca 2+ beelddata-analyse software, werden ruimtelijke filters die overeenkomen met cellocaties overgelegd op de gemiddelde fluorescentie-intensiteit van de microscoop opname data( Figuur 5) . Een witte streeplijn scheidt lagen 2/3 en 5 cellen. Corresponderende Ca 2+ sporen van 5 cellen uit elk van de lagen tonen het ontstekingspatroon van de cellen in twee verschillende gedragscontexten - Object Familiarization en Novel Object Exposure. Layer 2/3 cellen waren meer actief in vergelijking met laag 5 cellen op de dag waarop de muis werd blootgesteld aan een nieuw object. Dit blijkt ook uit de raster plots die de drempelvuuractiviteit van alle afgebeelde cellen op dag 1, 4 en 5 tonen. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/55579/55579fig1.jpg" /> Figuur 1: In Vivo Ca 2+ Imaging over meerdere Cortical Lagen in vrij bewegende muizen. ( A ) Prism sonde specificaties en afbeeldingen van beeldvorming vlak. De reflecterende coating aan de binnenzijde van de hypotenuse maakt het mogelijk om 90 ° van het invoegvlak van de prisma sonde af te beelden. De lens cuFf integreert met de lenshouder, die de implantatieprocedure stroomlijnt en mogelijk maakt voor het bekijken van fluorescentie van de omgevingsweefsel tijdens implantatie ( B ) (i). Illustratie van de plaatsing van de krismotomie van de prisma sonde en het snijden van een mes ten opzichte van de virusinjectieplaats, en (ii) illustratie van de plaats van de prisma sonde vlakke zijde ten opzichte van de mesinspringings- en virusinjectieplaats. ( C ) Illustratie van in-vivo Ca 2+ beeldvorming setup die het lichtpad voor een klein gebied in het volledige zichtveld toont door middel van prisma sonde geïmplanteerd in de muiscortex. ( D ) Voorbeeld zichtveld tijdens de prisma sonde installatie. Miniatuurmicroscoop is bevestigd aan de lenshouder, die de prisma-sonde vasthoudt om de virusuitdrukking tijdens de prisma-sonde-installatie te controleren. ( E ) Integratie van microscoop met prisma sonde voor multi-layer corticale beeldvorming van GCaMP6f gelabelde S1 cellen. F Voorbeeld veld van weergaveTijdens de installatie van de baseplaat. Duidelijke bloedvatpatroon is zichtbaar op het moment waarop de basisplaat installeert met sommige cellen in rauwe afbeelding. Meer cellen zijn duidelijk zichtbaar wanneer DF / F in het acquisitie software venster is ingeschakeld. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55579/55579fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/55579/55579fig2.jpg" /> Figuur 2: Schematische weergave van de tijdlijn van Workflow Events voor Prism Sonde Implantatie en Microscoop Installatie. Aantal weken wordt weergegeven op de X-as en de werkstromen van de procedures langs de Y-as. ( A ) Grafisch illustreren virale injectie (AAV1.CaMKII.GCaMP6f.WPRE.SV40) langs dezelfde dorso-ventrale as, om meerdere lagen van de muis somatosensaire cortex te markeren. ( B ) 2 weken na virusinjecties, een prisma probE wordt geïmplanteerd op een as die parallel is aan de virusinjectieplaatsen. ( C ) Ongeveer een week na de implantatie van de prisma sonde wordt het dier gecontroleerd op expressie met de microscoop en een basisplaat is op het hoofd gemonteerd als een populatie cellen zichtbaar is. ( D ) Het dier is dan klaar voor chronische beeldvorming tijdens relevante gedragstaken (Muisklemkunst gewijzigd na toestemming van- UW-Madison Biochemistry MediaLab). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55579/55579fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/55579/55579fig3.jpg" /> Figuur 3: Postmortem Histologische Validatie van Prism probe Locatie en GCaMP Expression. ( A ) Coronale sectie van een representatieve muisbrein die het prismasectraalkanaal toont en met zijn beeldende zijde naar voren wijstDe GCaMP6f-expressiecellen (AAV1.CaMKII.GCaMP6f uitgedrukt in neuronen in lagen 2/3 en 5). ( B ) Zelfde coronale hersensectie als gevolg van de kleuring voor DAPI. Schaalbalk = 250 μm ( C ) Inzoomen in het licht van GCaMP6f die cellen uitdrukken in somatosensory cortex. Schaalbalk = 100 μm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55579/55579fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/55579/55579fig4.jpg" /> Figuur 4: Muisactiviteit tijdens de Habituation, Familiarization, en Exposure Testing van de nieuwe object werd Video Tracked met behulp van Video Software. ( A ) Op dag 1 werd het dier geplaatst in een gedrags arena zonder voorwerpen (Open Field). ( B ) Op dagen 2-4 werden dezelfde twee texturaal verschillende objecten (gel pad en houtblok) in de arena geplaatst (Object Familiarization). ( C ) Op dag 5 werd één van de voorwerpen vervangen door een nieuw object (houtblok met zandpapier) (nieuwe objectobjectie). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55579/55579fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="Figuur 5" src="/files/ftp_upload/55579/55579fig5.jpg" /> Figuur 5: Calciumdynamica van oppervlakkige en diepe lagen van Somatosensorische Cortex van een representatieve muis die wordt weergegeven met de microscoop. ( A ) samengevoegd beeld van neuronale ruimtelijke filters (groene blobs) en gemiddelde fluorescentie-intensiteit projectie van de microscoop opname door middel van prisma sonde veld van het zicht. Border tussen supragranulaire en infragranulaire lagen aangegeven door een witte streeplijn. Schaalbalk = 100 μm. ( B ) Calciumsporen van vijf voorbeeld oppervlakkige en diepe laagcellen (gevuld blauw en rood cElls in paneel A), waarin de eenheden van standaardafwijking van fluorescentie worden aangegeven, in navolging van hoofd- en onafhankelijke componentanalyse. Horizontale schaalbalk 50 s en verticale schaalbalk 10 SD ( C ) Schema van cellen van oppervlakkig (lagen 2/3) en diepe lagen (laag 5) getoond boven Open veld, Objectbekendheid en Nieuwe object exploratie. Schaalbalk = 100 s. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55579/55579fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Multi-layer Cortical Ca2+ Imaging in Freely Moving Mice with Prism Probes and Miniaturized Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Multi-layer Cortical Ca2+ Imaging in Freely Moving Mice with Prism Probes and Miniaturized Fluorescence Microscopy

Hier presenteren we een procedure voor het uitvoeren van grootschalig Ca 2+ beeldvorming met cellulaire resolutie over meerdere corticale lagen in vrij bewegende muizen. Honderden actieve cellen kunnen tegelijkertijd worden waargenomen met behulp van een miniatuur kop microscoop gekoppeld met een geïmplanteerde prisma sonde.

Multi-layer Cortical Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Beeldvorming in vrij bewegende muizen met prisma sonde en geminiaturiseerde fluorescentiemicroscopie

In vivo circuit and cellular level functional imaging is a critical tool for understanding the brain in action. High resolution imaging of mouse cortical ...

Research

JoVE Journal

Behavior

Multi-layer Cortical Ca2+ Imaging in Freely Moving Mice with Prism Probes and Miniaturized Fluorescence Microscopy

Functional Magnetic Resonance Imaging (fMRI) with Auditory Stimulation in Songbirds

Functional Magnetic Resonance Imaging fMRI with Auditory Stimulation in Songbirds

Functionele Magnetische Resonantie Imaging (fMRI) met Auditieve Stimulatie in Zangvogels

The neurobiology of birdsong, as a model for human speech, is a pronounced area of research in behavioral neuroscience. Whereas electrophysiology and ...

Long-term Potentiation of Perforant Pathway-dentate Gyrus Synapse in Freely Behaving Mice

Langdurige Potentiëring van perforant Pathway-dentate Gyrus Synapse in Vrij Gedragen Muizen

Studies of long-term potentiation of synaptic efficacy, an activity-dependent synaptic phenomenon having properties that make it attractive as a potential ...

Two-photon Calcium Imaging in Mice Navigating a Virtual Reality Environment

Twee-foton Beeldvorming Calcium in Muizen navigeren van een Virtual Reality-omgeving

In recent years, two-photon imaging has become an invaluable tool in neuroscience, as it allows for chronic measurement of the activity of genetically ...

Quantitative Assessment of Cortical Auditory-tactile Processing in Children with Disabilities

Kwantitatieve beoordeling van Corticale auditieve-tactiele verwerking bij kinderen met een handicap

Objective and easy measurement of sensory processing is extremely difficult in nonverbal or vulnerable pediatric patients. We developed a new methodology ...

Measurement of Fronto-limbic Activity Using an Emotional Oddball Task in Children with Familial High Risk for Schizophrenia

Meting van Fronto-limbische activiteit met een emotionele Excentrieke Task bij kinderen met Familial hoog risico op schizofrenie

Adolescence is a critical developmental period where the early symptoms of schizophrenia frequently emerge. First-degree relatives of people with ...

Flat-floored Air-lifted Platform: A New Method for Combining Behavior with Microscopy or Electrophysiology on Awake Freely Moving Rodents

Flat-gevloerd Air-opgeheven Platform: Een nieuwe methode voor het combineren Gedrag met Microscopie of Electrofysiologie op Awake vrij bewegende Knaagdieren

It is widely acknowledged that the use of general anesthetics can undermine the relevance of electrophysiological or microscopical data obtained from a ...

The Modified Hole Board - Measuring Behavior, Cognition and Social Interaction in Mice and Rats

De Modified Hole Board - Het meten van gedrag en cognitieve en sociale interactie bij muizen en ratten

This protocol describes the modified hole board (mHB), which combines features from a traditional hole board and open field and is designed to measure ...

Simultaneous Transcranial Alternating Current Stimulation and Functional Magnetic Resonance Imaging

Gelijktijdige transcraniale wisselstroomstimulatie en functionele magnetische resonantiebeeldvorming

Transcranial alternating current stimulation (tACS) is a promising tool for noninvasive investigation of brain oscillations. TACS employs ...

Reversible Cooling-induced Deactivations to Study Cortical Contributions to Obstacle Memory in the Walking Cat

Omkeerbare koeling-geïnduceerde deactiveringen te bestuderen van de corticale bijdragen aan belemmering geheugen in de wandelende kat

On complex, naturalistic terrain, sensory information about an environmental obstacle can be used to rapidly adjust locomotor movements for avoidance. For ...

A Wireless, Bidirectional Interface for In Vivo Recording and Stimulation of Neural Activity in Freely Behaving Rats

A Wireless, Bidirectional Interface for In Vivo Recording and Stimulation of Neural Activity in Freely Behaving Rats

Een draadloze, bidirectionele Interface voor In Vivo opname en stimulatie van neurale activiteit in vrij gedragen ratten

In vivo electrophysiology is a powerful technique to investigate the relationship between brain activity and behavior at a millisecond and micrometer ...