Name: multi-layer cortical ca2+ imaging in freely moving mice with prism probes and miniaturized fluorescence microscopy
Uploaded: 2017-06-13T12:30:00
Duration: 10 min 35 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multi-layer Cortical Ca2+ Imaging in Freely Moving Mice with Prism Probes and Miniaturized Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Die Autoren danken V. Jayaraman, DS Kim, LL Looger und K. Svoboda aus dem Genetisch-Encoded Neuronal Indicator und Effector (GENIE) Projekt am Janelia Research Campus des Howard Hughes Medical Institute für ihre großzügige Spende von AAV1-GCaMP6f Zur Universität von Pennsylvania Vector Core. Sie danken auch der A. Olson und Neuroscience Microscopy Core an der Stanford University, unterstützt von NIH NS069375 Grant für ihre konfokalen Mikroskopie Dienstleistungen.

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Sci. 112 (30), 9466-9471 (2015).</li><li>Kitamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entorhinal+Cortical+Ocean+Cells+Encode+Specific+Contexts+and+Drive+Context-Specific+Fear+Memory.">Entorhinal Cortical Ocean Cells Encode Specific Contexts and Drive Context-Specific Fear Memory.</a> Neuron. 87 (6), 1317-1331 (2015).</li><li>Pinto, L., Dan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-Type-Specific+Activity+in+Prefrontal+Cortex+during+Goal-Directed+Behavior.">Cell-Type-Specific Activity in Prefrontal Cortex during Goal-Directed Behavior.</a> Neuron. 87 (2), 437-450 (2015).</li><li>Cox, J., Pinto, L., Dan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+imaging+of+sleep-wake+related+neuronal+activity+in+the+dorsal+pons.">Calcium imaging of sleep-wake related neuronal activity in the dorsal pons.</a> Nat. 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Vis. Exp. (30), (2009).</li><li>Chia, T. H., Levene, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microprisms+for+in+vivo+multilayer+cortical+imaging.">Microprisms for in vivo multilayer cortical imaging.</a> J. Neurophysiol. 102 (2), 1310-1314 (2009).</li><li>Chia, T. H., Levene, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-layer+in+vivo+imaging+of+neocortex+using+a+microprism.">Multi-layer in vivo imaging of neocortex using a microprism.</a> Cold Spring Harb. Protoc. 2010 (8), (2010).</li><li>Low, R. J., Gu, Y., Tank, D. 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Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq.</a> Science. 347 (6226), 1138-1142 (2015).</li><li>Hawrylycz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inferring+cortical+function+in+the+mouse+visual+system+through+large-scale+systems+neuroscience.">Inferring cortical function in the mouse visual system through large-scale systems neuroscience.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 113 (27), 7337-7344 (2016).</li><li>Petrof, I., Viaene, A. N., Sherman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+the+primary+somatosensory+cortex+projection+to+the+primary+motor+cortex+in+the+mouse.">Properties of the primary somatosensory cortex projection to the primary motor cortex in the mouse.</a> J. Neurophysiol. 113 (7), 2400-2407 (2015).</li><li>Aronoff, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-range+connectivity+of+mouse+primary+somatosensory+barrel+cortex.">Long-range connectivity of mouse primary somatosensory barrel cortex.</a> Euro. J. Neurosci. 31 (12), 2221-2233 (2010).</li><li>Rogan, S. C., Roth, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remote+control+of+neuronal+signaling.">Remote control of neuronal signaling.</a> Pharma. Rev. 63 (2), 291-315 (2011).</li><li>Berdyyeva, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zolpidem+reduces+hippocampal+neuronal+activity+in+freely+behaving+mice:+a+large+scale+calcium+imaging+study+with+miniaturized+fluorescence+microscope.">Zolpidem reduces hippocampal neuronal activity in freely behaving mice: a large scale calcium imaging study with miniaturized fluorescence microscope.</a> PloS One. 9 (11), e112068 (2014).</li></ol>

Die Autoren haben die Politik der Zeitschrift gelesen und haben folgende konkurrierende Interessen: SG, SO und VC sind bezahlte Mitarbeiter bei Inscopix.

Das Verständnis der neuronalen Kreislaufaktivität während des wachen Verhaltens ist ein wichtiges Niveau der neurowissenschaftlichen Untersuchung, die benötigt wird, um die Gehirnfunktion in Gesundheit und Krankheit wirksam zu sezieren. Die Kortex ist eine besonders wichtige Region, um im Kontext des wachen Verhaltens zu studieren, da sie in vielen lebenswichtigen sensorischen, kognitiven und exekutiven Funktionen eine wichtige Rolle spielt. 28 , 29 . Es wird angenommen, dass die kortikale Säule die grundlegende funktionelle Einheit in der Kortex ist und die Populationsaktivität von kortikalen Zellen auf der Grundlage ihrer physikalischen Lage innerhalb der Säule bekannt ist. Zum Beispiel projizieren exzitatorische Neuronen in Schichten 2/3 im somatosensorischen Kortex vorwiegend in andere neokortikale Regionen und modulieren andere kortikale Netzwerke 30 , während Zellen in tieferen Schichten primär zu subkortikalen Regionen wie dem Thalamus 31 projizieren. Aufzeichnung der Aktivität von hundertS von vordefinierten kortikalen Zellen gleichzeitig und zuverlässig über die Zeit über verschiedene Lamina in frei verhaltenden Themen würde unser Verständnis des kortikalen Informationsflusses erheblich vorantreiben, was eine feinere funktionelle Dissektion von kortikalen Säulen ermöglicht, die durch Echtzeit-Verhaltensinformationen und aufgabenrelevante Zeit- Waage. Das Sammeln dieses Niveaus der neuronalen Schaltungsdaten wird durch die Verwendung einer effizienten und stromlinienförmigen miniaturisierten Mikroskopieplattform ermöglicht, um eine großformatige Ca 2+ -Bildgebung in frei verhaltenden Probanden (oder kopffesten Themen wie gewünscht) durchzuführen. Verwendet mit genetisch codierten Calciumindikatoren, um zelltypspezifisches Targeting zu ermöglichen und ein mehrschichtiges Sichtfeld, das von einer chronisch implantierten Prismensonde bereitgestellt wird, zu untersuchen, untersuchte dieses Protokoll einen Fall unter vielen möglichen Anwendungen: Beobachten von laminaren Unterschieden in der somatosensorischen kortikalen Verarbeitung bei Mäusen Physisch mit einem neuartigen Objekt beschäftigt (Abbildung 5 ).Dies ist die erste prozedurale Darstellung dieser Art von zelltypspezifischen, in vivo- Ansatz, um mehrere kortikale Schichten in wachen, frei verhaltenden Tieren zu untersuchen und erweitert das Spektrum der experimentellen Methoden, um Laminarstrukturen im aktiven Gehirn zu verstehen. Das periskopische Sichtfeld, das durch die Prismensonde in dieser Technik ermöglicht wird, kann auf andere Hirnstrukturen angewendet werden, wenn die Erhaltung des Gewebes, das direkt zu einem interessierenden Bereich dorsal ist, erwünscht ist; Zum Beispiel konnte CA3-Bildgebung ohne Unterbrechung der Hippocampus-Funktion erreicht werden. Der prisma-basierte Ansatz zur Abbildung der Ca 2+ -Aktivität erfordert die physikalische Insertion und permanente Implantation eines Mikroprismas in die Kortikalis, was der Entstehung einer kortikalen Läsion entspricht, bei der die Linsensonde eingesetzt wird. Dies kann zu Störungen der lokalen neuronalen Schaltungen führen, einschließlich der Trennung von apikalen Dendriten und Prozessen. TSeine Prozedur wird auch eine anfängliche Aktivierung von Gliazellen in der Region verursachen, obwohl dies erwartet wird, dass sie auf das Gewebe etwa 150 &amp; mgr; m von der Prismenfläche lokalisiert werden, und um nach dem Gehirn zu verhärten 22 . Es ist sehr wichtig zu prüfen, ob diese Technik die normale Schaltkreisanatomie und / oder das Verhalten der Tiere bei der Planung von Experimenten beeinflussen wird. Behavioral Control Groups sollten immer durchgeführt werden, um sicherzustellen, dass es keine signifikanten Veränderungen in Baseline-Verhaltensweisen, die zu verletzenden experimentellen Ergebnissen führen könnte. Mit dieser miniaturisierten, mobilen Ca 2+ Imaging-Technik mit neuropharmakologischer Manipulation können verschiedene kognitive, soziale, motorische oder intrinsische Verhaltensparadigmen kombiniert und mit anderen physiologischen Metriken kombiniert werden, um Studien zu vertiefen und zu bereichern, die auf das Verständnis der funktionellen Rollen von neuronalen Schaltungen in Verhalten und Signal ausgerichtet sind Verarbeitung 32 . Unterdrückung oder AktivierungDie durch Medikamente moduliert werden, können die damit verbundenen Verhaltensweisen beeinflussen, die mit dieser Technologie leicht untersucht werden können 33 . Die Verzweigung in verschiedene Zelltypen durch die Änderung der Ausrichtung des Kalziumindikators ist eine weitere leistungsfähige und nützliche Anwendung und ermöglicht viele kreative Kombinationen von experimentellen Werkzeugen, um verschiedene neuronale Schaltungsfragen zu lösen.

Die Kortex ist ein wesentlicher Spieler in vielen komplexen mentalen und Verhaltensfunktionen, von der Aufmerksamkeit, der sensorischen Wahrnehmung und der top-down kognitiven Kontrolle 1 , 2 , 3 bis hin zu Motivations-, Belohnungs- und Suchtwegen 4 , 5 . Das Verständnis der Rechenprozesse, die seiner Funktion zugrunde liegen, ist ein wichtiges Ziel, ein besseres klinisches Verständnis vieler geistiger und Verhaltensstörungen zu erreichen. Viele gegenwärtige Theorien der psychiatrischen Erkrankung konzentrieren sich um die Idee, dass kortikale neuronale Kreislaufdysfunktion oder Diskoordination kognitiven und Verhaltensanomalien unterliegen können, die das Kennzeichen von Bedingungen wie Schizophrenie 6 , Autismus 7 oder Zwangsstörungen sind. So erhalten die Populationsniveau neuronale Aktivitätsdaten von coRtische Schaltungen innerhalb des richtigen Kontextes gleichzeitiger Verhaltensinformationen sind von großer Bedeutung und können idealerweise auf spezifische Zelltypen für eine feinere neuronale Schaltungsdissektion ausgerichtet sein. Miniaturisierte Mikroskope in Verbindung mit implantierbaren Gradientenbrechungsindex (GRIN) Mikrolinsen ermöglichen den optischen Zugang zu neuronalen Ensembles unter frei beweglichen Zuständen aus einer Vielfalt möglicher Hirnareale 9 , 10 , 11 , 12 , 13 einschließlich der Kortex 14 , 15 , 16 . Die Verwendung eines mobilen Mikroskopiesystems, das mit genetisch codierten Calciumindikatoren gekoppelt ist, ermöglicht eine konsistente Abbildung der gleichen zellulären Population, die Hunderte von Neuronen über Tage bis Wochen in vielen Hirnregionen 9 umfasst und kannGenetisch auf spezifische Zelltypen mit viralen Vektor oder transgenen Techniken gerichtet. Da die Kortex bekannt ist, verschiedene Funktionen zu unterstützen und sich in Abhängigkeit von der Lage der Zellen innerhalb der kortikalen Lamina 17 , 18 , 19 mit verschiedenen Hirnregionen zu verbinden, sind wir daran interessiert, eine gleichzeitige mehrschichtige neuronale Aktivität bei wachverhaltenden Probanden zu erhalten. Hier zeigen wir, wie man Hunderte von fluoreszenzbeschrifteten Neuronen in frei verhaltenden Mäusen über Tage bildt, wobei das miniaturisierte Fluoreszenzmikroskop 20 mit einer implantierten Prismensonde gepaart wird, die eine mehrschichtige Sicht auf die Kortikalis bietet (Abbildung 1 ). Die hier verwendete Prismensonde besteht aus zwei getrennten GRIN-Objektiven: einem Prisma und einer zylindrischen Relaislinse ( Bild 1 ). Das Licht aus dem Mikroskop erregt die fluoreszenzbeschriftetZellen, die sich entlang der Abbildungsfläche der Prismensonde befinden, nachdem sie von der Hypotenuse des Prismenabschnitts der Sonde reflektiert wurden. Das emittierte Licht aus den Zellen reflektiert auch die Hypotenuse des Prismas, wird durch das Ziel des Mikroskops gesammelt und erreicht den Sensor im Mikroskop. Die in diesem Verfahren verwendete Prismensonde eignet sich für den einfachen Gebrauch mit Standard-Stereotax-Ausrüstung. Das miniaturisierte Fluoreszenzmikroskop 20 detektiert aktionspotential-evozierte Ca 2+ -Transienten in neuronalen Populationen mit Einzelzell-Auflösung, nachdem diese Zellen spezifisch mit Ca 2+ -sensitiven genetisch codierten Fluoreszenzindikatoren markiert wurden. In diesem Protokoll injizieren wir den in einem viralen Vektor (AAV1.CaMKII.GCaMP6f.WPRE.SV40) codierten Ca 2+ -Anderindikator, implantieren eine Prismensonde, installieren das Mikroskop und erhalten dann mehrere Tage somatosensorische (s1 hintere Gliedmaßen) neuronale Aktivitätsdaten Von einem Tier aussetzenD zu neuartigen Objektoberflächen während der freien Exploration (Abbildung 2 ).

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Neurostar Motorized 
			Ultra Precise Small Animal Stereotaxic Instrument</td>
			<td>Kopf</td>
			<td>Model 963SD</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereoscope</td>
			<td>Labomed</td>
			<td>Prima DNT</td>
			<td>Surgery and Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Rectal Thermistor Probe (.062&#34;/1.6mm diameter) - 1/4&#34; Jack</td>
			<td>FHC</td>
			<td>40-90-5D-02</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating Pad 5 X 12.5cm&#160;</td>
			<td>FHC</td>
			<td>40-90-2-07</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC Temperature Controller</td>
			<td>FHC</td>
			<td>40-90-8D</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsyringe Pump</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>UMP3 model; serial 155788 F110</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoFil 10&#956;L Syringe</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>NANOFIL</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 G Beveled Tip Nanofil NDL 2PK</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>NF35BV-2</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omnidrill35, 115-230V</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>503598</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Burrs for Micro Drill</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>19007-05</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nVista</td>
			<td>Inscopix</td>
			<td>100-001048</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV1.CaMKII.GCaMP6f.WPRE.SV40</td>
			<td>Penn Vector Core</td>
			<td>AV-1-PV3435</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketoprofen</td>
			<td>Victor Medical</td>
			<td>5487</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carprofen</td>
			<td>Victor Medical</td>
			<td>1699008&#160;</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Victor Medical</td>
			<td>1001054</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelfoam (Patterson Veterinary Supply Inc Gelfoam Sponge 12cmx7mm)</td>
			<td>Pfizer (Fisher Scientific)</td>
			<td>NC9841478</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5/45 forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-35</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-30</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting knives</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10055-12</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProView Implant Kit</td>
			<td>Inscopix</td>
			<td>100-000756</td>
			<td>Surgery and Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProView Prism Probe 1.0mm-Dia. ~4.3mm Length</td>
			<td>Inscopix</td>
			<td>100-000592</td>
			<td>Surgery and Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kwik-Sil adhesive pack of 2</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>KWIK-SIL</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kwik-Cast Sealant</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>KWIK-CAST</td>
			<td>Surgery and Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniature Optical Mounting Post</td>
			<td>Newport</td>
			<td>M-TSP-3</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Baseplate</td>
			<td>Inscopix</td>
			<td>BPL-2</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Baseplate Cover</td>
			<td>Inscopix</td>
			<td>BPC-2</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
	</tbody>
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multi-layer cortical ca2+ imaging in freely moving mice with prism probes and miniaturized fluorescence microscopy

In-vivo -Schaltung und zelluläre Ebene funktionale Bildgebung ist ein kritisches Werkzeug für das Verständnis des Gehirns in Aktion. Die hochauflösende Bildgebung von Mauskortikalen Neuronen mit Zwei-Photonen-Mikroskopie bietet einzigartige Einblicke in die kortikale Struktur, Funktion und Plastizität. Allerdings sind diese Studien auf Kopf feste Tiere begrenzt, stark reduziert die Verhaltenskomplexität zur Verfügung für die Studie. In dieser Arbeit beschreiben wir ein Verfahren zur Durchführung einer chronischen Fluoreszenzmikroskopie mit zellulärer Auflösung über mehrere kortikale Schichten bei frei verhaltenden Mäusen. Wir verwendeten ein integriertes miniaturisiertes Fluoreszenzmikroskop, gepaart mit einer implantierten Prismensonde, um gleichzeitig die Kalziumdynamik von Hunderten von Neuronen über mehrere Schichten des somatosensorischen Kortex zu visualisieren und aufzuzeichnen, wie die Maus in einer neuartigen Objekt-Explorationsaufgabe über mehrere Tage hinweg. Diese Technik kann an andere Hirnregionen in verschiedenen Tierarten für andere Verhaltensweisen angepasst werdenAradigms

Das hier beschriebene Protokoll beschreibt einen effektiven und effizienten Weg, um eine mehrschichtige Ca 2+ -Bildgebung von Hunderten von kortikalen Neuronen in frei verhaltenden Mäusen unter Verwendung von Prismensonden durchzuführen (Abbildung 1 ). Bisherige Ansätze zur mehrschichtigen kortikalen Bildgebung wurden in erster Linie auf kopffeste Tiere 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 beschränkt. Um diese Datenebene in einem frei verhaltenen Kontext zu erwerben, wurde eine miniaturisierte Mikroskopplattform für Verhaltensflexibilität eingesetzt; Ein genetisch codierter Calciumindikator (GCaMP6f) wurde verwendet, um eine spezifische Zellpopulation (CAMKII + Zellen in der Kortex) zu zielen; Und eine Prismensonde wurde gewählt, um ein chronisches, mehrschichtiges Gesichtsfeld zu schaffen. <p class="jove_content" fo:keep-dieIn-Seite = &quot;1&quot;&gt; Wir haben den Arbeitsablauf zur Vorbereitung des Tieres für die Bildgebung vorgestellt. Ein viraler Vektor, der für einen geeigneten Calciumindikator kodiert, wurde in den Kortex injiziert ( Fig. 2 , Schritt 1), bevor er eine Prismensonde chronisch implantiert, um einen optischen Zugang zu den markierten Zellen zu ermöglichen ( Fig. 2 , Schritt 2). Eine Basisplatte, die als sicheres, temporäres Dock für die Positionierung des Mikroskops während der Bildgebungssitzungen dient, wurde dann über dem Kopf des Tieres installiert (Abbildung 2 , Schritt 3), was die Visualisierung der kortikalen Aktivität über mehrere Zellschichten in einem wachen, das sich experimentell verhält, ermöglicht Setup ( Abbildung 2 , Schritt 4). Um sicherzustellen, dass die gewünschte zelluläre Population angestrebt wurde, ist in Abbildung 3 ein postmortiver koronaler Hirnabschnitt von einer repräsentativen Maus dargestellt, wobei der Prisma-Sonden-Trakt und das im Vergleich zum GCaMP6f-Labor markierte SichtfeldEeligen Neuronen in den Schichten 2/3 und 5 der somatosensorischen Kortex. Während des wachen Verhaltens mit dem System wurde die Aktivität der somatosensorischen kortikalen Neuronen aufgezeichnet, als die Maus drei verschiedenen Umgebungen ausgesetzt war - Open Field (Tag 1), Objekt-Vertrautmachung (Tag 2-4) und neuartiges Objekt (Tag 5) ( Abbildung 4 ). Am Tag 1 wurde die Maus in eine Verhaltensarena ohne irgendwelche Gegenstände gelegt. Am Tag 2-4 wurde die Maus in die Arena mit den gleichen zwei texturally verschiedenen Objekten (ein Gel-Pad und ein Holz-Block) platziert. Am 5. Tag wurde eines der Objekte durch ein neuartiges Objekt ersetzt. Das Tier wurde über 5 Tage für 20 min pro Tag abgebildet. Nach der Zellextraktion unter Verwendung der Ca 2+ Bilddatenanalyse-Software wurden räumliche Filter, die den Zellorten entsprechen, auf der mittleren Fluoreszenzintensitätsprojektion der Mikroskopaufzeichnungsdaten überlagert( Fig. 5) . Eine weiße gestrichelte Linie trennt die Schichten 2/3 und 5 Zellen. Entsprechende Ca 2+ Spuren aus 5 Zellen aus jeder der Schichten zeigen das Zündmuster der Zellen in zwei verschiedenen Verhaltenskontexten - Objektvertrautheit und neuartige Objektbelichtung. Schicht-2/3-Zellen waren im Vergleich zu Schicht-5-Zellen am Tag, an dem die Maus einem neuartigen Objekt ausgesetzt war, aktiver. Dies zeigt sich auch aus den Rasterplots, die an den Tagen 1, 4 und 5 die schwankende Zündaktivität aller abgebildeten Zellen zeigen. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/55579/55579fig1.jpg" /> Abbildung 1: In vivo Ca 2+ Bildgebung über mehrere kortikale Schichten in frei beweglichen Mäusen. ( A ) Prismen-Sonden-Spezifikationen und Darstellung der Bilderzeugungsebene. Die reflektierende Beschichtung auf der Innenseite der Hypotenuse ermöglicht die Abbildung von 90 ° aus der Einsteckebene der Prismensonde. Die Linse cuFf integriert sich mit dem Linsenhalter, der das Implantationsverfahren optimiert und eine mögliche Betrachtung der Umgebungsgewebsfluoreszenz während der Implantation ( B ) (i) ermöglicht. Abbildung der Platzierung der Prismensonde Craniotomie und Messerinzision relativ zur Virusinjektionsstelle und (ii) Darstellung der Lage der Prismensonde flache Seite relativ zum Messereinschnitt und der Virusinjektionsstelle. ( C ) Darstellung des in-vivo Ca 2+ -Bildgebungsaufbaus, der den Lichtweg für einen kleinen Bereich innerhalb des vollen Gesichtsfeldes durch eine im Mauskortex implantierte Prismensonde zeigt. ( D ) Beispiel-Sichtfeld bei der Prisma-Sonde. Das Miniaturmikroskop ist an der Linsenhalterung befestigt, die die Prismensonde hält und die Überprüfung der Virusausdruck während der Prisma-Sonde ermöglicht. ( E ) Integration des Mikroskops mit Prismensonde zur mehrschichtigen kortikalen Bildgebung von GCaMP6f-markierten S1-Zellen. F Beispiel SichtfeldBei der Grundplatteninstallation. Klares Blutgefäßmuster ist zum Zeitpunkt der Basisplatte sichtbar mit einigen Zellen im Rohbild sichtbar. Weitere Zellen sind deutlich sichtbar, wenn DF / F im Fenster der Erfassungssoftware eingeschaltet ist. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55579/55579fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/55579/55579fig2.jpg" /> Abbildung 2: Schematische Darstellung der Zeitleiste von Workflow-Ereignissen für Prisma-Sonden-Implantation und Mikroskop-Installation. Die Anzahl der Wochen ist auf der X-Achse und die Workflow-Schritte der Prozeduren entlang der Y-Achse dargestellt. ( A ) Grafische Darstellung der viralen Injektion (AAV1.CaMKII.GCaMP6f.WPRE.SV40) entlang der gleichen dorso-ventralen Achse, um mehrere Schichten der Maus somatosensorischen Kortex zu markieren. ( B ) 2 Wochen nach Virusinjektionen, ein PrismaproblemE wird an einer Achse implantiert, die parallel zu den Virusinjektionsstellen ist. ( C ) Ungefähr eine Woche nach der Prismensondenimplantation wird das Tier auf den Ausdruck mit dem Mikroskop überprüft und eine Basisplatte wird auf dem Kopf angebracht, wenn eine Population von Zellen sichtbar ist. ( D ) Das Tier ist dann für die chronische Bildgebung bei relevanten Verhaltensaufgaben bereit (Mausclip, modifiziert nach Genehmigung von - UW-Madison Biochemistry MediaLab). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55579/55579fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/55579/55579fig3.jpg" /> Abbildung 3: Postmortem Histologische Validierung der Prismensondenposition und GCaMP Expression. ( A ) Koronaler Abschnitt von einem repräsentativen Maus-Gehirn, das den Prismen-Sonden-Trakt zeigt und mit seiner bildgebenden SeiteDie GCaMP6f-exprimierenden Zellen (AAV1.CaMKII.GCaMP6f, ausgedrückt in Neuronen in den Schichten 2/3 und 5). ( B ) Gleiche koronale Hirnsektion nach Färbung für DAPI. Maßstab = 250 μm ( C ) Vergrößerte Ansicht von GCaMP6f-exprimierenden Zellen in somatosensorischem Kortex. Maßstab = 100 μm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55579/55579fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/55579/55579fig4.jpg" /> Abbildung 4: Mäuseaktivität während der Habituation, Vertrautmachung und neuartige Objektbelichtungstests wurde mit Video-Software aufgezeichnet. ( A ) Am Tag 1 wurde das Tier in eine Verhaltensarena ohne irgendwelche Gegenstände (Open Field) gestellt. ( B ) An den Tagen 2-4 wurden die gleichen zwei texturisch unterschiedlichen Objekte (Gel-Pad und Holzblock) in die Arena gelegt (Object FamiLilierung). ( C ) Am Tag 5 wurde eines der Objekte durch ein neuartiges Objekt (Holzblock mit Sandpapier) ersetzt (Novel Object Exposure). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55579/55579fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/55579/55579fig5.jpg" /> Abbildung 5: Calcium-Dynamik von oberflächlichen und tiefen Schichten des somatosensorischen Cortex einer repräsentativen Maus mit dem Mikroskop abgebildet. ( A ) Zusammengeführtes Bild von neuronalen Raumfiltern (grüne Blobs) und mittlere Fluoreszenzintensitätsprojektion der Mikroskopaufnahme durch Prismensondenfeld. Grenze zwischen supragranularen und infragranulären Schichten, die durch eine weiße gestrichelte Linie dargestellt sind. Maßstab = 100 μm. ( B ) Calciumspuren aus fünf beispielhaften oberflächlichen und tiefen Schichtzellen (gefüllt blau und rot cElls in Panel A), Angabe von Einheiten der Standardabweichung der Fluoreszenz nach prinzipieller und unabhängiger Komponentenanalyse. Horizontale Skalenstange 50 s und vertikale Skalenleiste 10 SD ( C ) Rasterplot von Zellen aus oberflächlichen (Schichten 2/3) und tiefen Schichten (Schicht 5) gezeigt über offenes Feld, Objekt-Vertrautmachung und neuartige Objekt-Exploration. Maßstab = 100 s. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55579/55579fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Multi-layer Cortical Ca2+ Imaging in Freely Moving Mice with Prism Probes and Miniaturized Fluorescence Microscopy

Hier stellen wir ein Verfahren zur Durchführung einer großformatigen Ca 2+ -Bildgebung mit zellulärer Auflösung über mehrere kortikale Schichten in frei beweglichen Mäusen vor. Hunderte von aktiven Zellen können gleichzeitig mit einem Miniatur-, Kopf-Mikroskop gekoppelt mit einer implantierten Prismensonde beobachtet werden.

Mehrschicht-Cortical Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Imaging in frei beweglichen Mäusen mit Prisma-Sonden und miniaturisierte Fluoreszenzmikroskopie

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Research

JoVE Journal

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Multi-layer Cortical Ca2+ Imaging in Freely Moving Mice with Prism Probes and Miniaturized Fluorescence Microscopy

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