Name: multi-layer cortical ca2+ imaging in freely moving mice with prism probes and miniaturized fluorescence microscopy
Uploaded: 2017-06-13T12:30:00
Duration: 10 min 35 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multi-layer Cortical Ca2+ Imaging in Freely Moving Mice with Prism Probes and Miniaturized Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Gli autori vorrebbero ringraziare V. Jayaraman, DS Kim, LL Looger e K. Svoboda dell&#39;Espressione Neuronale Codificata Genetica ed Effector (GENIE) presso il Campus di Ricerca Janelia presso l&#39;Istituto Medico Hughes Howard per la loro generosa donazione di AAV1-GCaMP6f All&#39;Università di Pennsylvania Vector Core. Vorrebbero inoltre ringraziare l&#39;A. Olson e la Neuroscience Microscopic Core presso l&#39;Università Stanford sostenuta dalla NIH NS069375 per i loro servizi di microscopia confocale.

<ol>
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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reward-dependent+learning+in+neuronal+networks+for+planning+and+decision+making.">Reward-dependent learning in neuronal networks for planning and decision making.</a> Prog. Brain Res. 126, 217-229 (2000).</li><li>Ferenczi, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prefrontal+cortical+regulation+of+brainwide+circuit+dynamics+and+reward-related+behavior.">Prefrontal cortical regulation of brainwide circuit dynamics and reward-related behavior.</a> Science. 351 (6268), aac9698 (2016).</li><li>Anomal, R. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+Processing+in+the+Primary+Auditory+Cortex+of+an+Animal+Model+of+Autism.">Impaired Processing in the Primary Auditory Cortex of an Animal Model of Autism.</a> Front. Sys. Neurosci. 9, 158 (2015).</li><li>Pauls, D. L., Abramovitch, A., Rauch, S. L., Geller, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obsessive-compulsive+disorder:+an+integrative+genetic+and+neurobiological+perspective.">Obsessive-compulsive disorder: an integrative genetic and neurobiological perspective.</a> Nat. Rev. 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Sci. 112 (30), 9466-9471 (2015).</li><li>Kitamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entorhinal+Cortical+Ocean+Cells+Encode+Specific+Contexts+and+Drive+Context-Specific+Fear+Memory.">Entorhinal Cortical Ocean Cells Encode Specific Contexts and Drive Context-Specific Fear Memory.</a> Neuron. 87 (6), 1317-1331 (2015).</li><li>Pinto, L., Dan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-Type-Specific+Activity+in+Prefrontal+Cortex+during+Goal-Directed+Behavior.">Cell-Type-Specific Activity in Prefrontal Cortex during Goal-Directed Behavior.</a> Neuron. 87 (2), 437-450 (2015).</li><li>Cox, J., Pinto, L., Dan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+imaging+of+sleep-wake+related+neuronal+activity+in+the+dorsal+pons.">Calcium imaging of sleep-wake related neuronal activity in the dorsal pons.</a> Nat. Comm. 7, 10763 (2016).</li><li>Resendez, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+cortical,+subcortical+and+deep+brain+neural+circuit+dynamics+during+naturalistic+mammalian+behavior+with+head-mounted+microscopes+and+chronically+implanted+lenses.">Visualization of cortical, subcortical and deep brain neural circuit dynamics during naturalistic mammalian behavior with head-mounted microscopes and chronically implanted lenses.</a> Nat. Protoc. 11 (3), 566-597 (2016).</li><li>Hooks, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+cortical+and+thalamic+input+to+pyramidal+neurons+in+mouse+motor+cortex.">Organization of cortical and thalamic input to pyramidal neurons in mouse motor cortex.</a> The J. Neurosci. 33 (2), 748-760 (2013).</li><li>Masamizu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+distinct+layer-specific+dynamics+of+cortical+ensembles+during+learning+of+a+motor+task.">Two distinct layer-specific dynamics of cortical ensembles during learning of a motor task.</a> Nat. Neurosci. 17 (7), 987-994 (2014).</li><li>Rowland, D. C., Moser, M. -. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+cortical+modules+to+memories.">From cortical modules to memories.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 24 (1), 22-27 (2014).</li><li>Ghosh, K. 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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+cellular+imaging+of+entire+cortical+columns+in+awake+mice+using+microprisms.">Chronic cellular imaging of entire cortical columns in awake mice using microprisms.</a> Neuron. 80 (4), 900-913 (2013).</li><li>Goldey, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removable+cranial+windows+for+long-term+imaging+in+awake+mice.">Removable cranial windows for long-term imaging in awake mice.</a> Nat. Protoc. 9 (11), 2515-2538 (2014).</li><li>Chia, T. H., Levene, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+deep+cortical+layers+using+a+microprism.">In vivo imaging of deep cortical layers using a microprism.</a> J. Vis. Exp. (30), (2009).</li><li>Chia, T. H., Levene, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microprisms+for+in+vivo+multilayer+cortical+imaging.">Microprisms for in vivo multilayer cortical imaging.</a> J. Neurophysiol. 102 (2), 1310-1314 (2009).</li><li>Chia, T. H., Levene, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-layer+in+vivo+imaging+of+neocortex+using+a+microprism.">Multi-layer in vivo imaging of neocortex using a microprism.</a> Cold Spring Harb. Protoc. 2010 (8), (2010).</li><li>Low, R. J., Gu, Y., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+resolution+optical+access+to+brain+regions+in+fissures:+imaging+medial+prefrontal+cortex+and+grid+cells+in+entorhinal+cortex.">Cellular resolution optical access to brain regions in fissures: imaging medial prefrontal cortex and grid cells in entorhinal cortex.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 111 (52), 18739-18744 (2014).</li><li>Zeisel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+structure.+Cell+types+in+the+mouse+cortex+and+hippocampus+revealed+by+single-cell+RNA-seq.">Brain structure. Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq.</a> Science. 347 (6226), 1138-1142 (2015).</li><li>Hawrylycz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inferring+cortical+function+in+the+mouse+visual+system+through+large-scale+systems+neuroscience.">Inferring cortical function in the mouse visual system through large-scale systems neuroscience.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 113 (27), 7337-7344 (2016).</li><li>Petrof, I., Viaene, A. N., Sherman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+the+primary+somatosensory+cortex+projection+to+the+primary+motor+cortex+in+the+mouse.">Properties of the primary somatosensory cortex projection to the primary motor cortex in the mouse.</a> J. Neurophysiol. 113 (7), 2400-2407 (2015).</li><li>Aronoff, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-range+connectivity+of+mouse+primary+somatosensory+barrel+cortex.">Long-range connectivity of mouse primary somatosensory barrel cortex.</a> Euro. J. Neurosci. 31 (12), 2221-2233 (2010).</li><li>Rogan, S. C., Roth, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remote+control+of+neuronal+signaling.">Remote control of neuronal signaling.</a> Pharma. Rev. 63 (2), 291-315 (2011).</li><li>Berdyyeva, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zolpidem+reduces+hippocampal+neuronal+activity+in+freely+behaving+mice:+a+large+scale+calcium+imaging+study+with+miniaturized+fluorescence+microscope.">Zolpidem reduces hippocampal neuronal activity in freely behaving mice: a large scale calcium imaging study with miniaturized fluorescence microscope.</a> PloS One. 9 (11), e112068 (2014).</li></ol>

Gli autori hanno letto la politica del diario e hanno i seguenti interessi concorrenti: SG, SO e VC sono dipendenti pagati a Inscopix.

Capire l&#39;attività del circuito neurale durante il comportamento sveglio è un livello vitale di indagini neuroscientificali necessarie per disciparle efficacemente la funzione del cervello in salute e malattie. La corteccia è una regione particolarmente importante da studiare nel contesto del comportamento sveglio, in quanto svolge un ruolo importante in molte funzioni vitali, cognitive ed esecutive 28 , 29 . La colonna corticale è considerata l&#39;unità funzionale base nella corteccia e l&#39;attività delle cellule corticali a livello di popolazione è noto per essere diversa in base alla loro posizione fisica all&#39;interno della colonna. Ad esempio, i neuroni eccitatori negli strati 2/3 nella corteccia somatosensoria proiettano principalmente altre regioni neocorticali e modulano altre reti corticali 30 , mentre le cellule in strati più profondi proiettano principalmente nelle regioni subcorticali come il thalamus 31 . Registrazione dell&#39;attività di centoS di celle corticali pre-specificate simultaneamente e affidabile nel tempo attraverso diverse lamelle in soggetti liberamente comportanti, avrebbe notevolmente migliorato la nostra comprensione del flusso informativo corticale, consentendo una più funzionale dissezione funzionale di colonne corticali informate da informazioni comportamentali in tempo reale e da tempo- bilancia. La raccolta di questo livello di dati dei circuiti neurali è resa possibile grazie all&#39;impiego di una piattaforma miniaturizzata microscopica efficiente e semplificata per condurre un&#39;imaging su larga scala Ca 2+ in soggetti con comportamenti liberi (o soggetti fisso a piacere). Utilizzato con indicatori di calcio geneticamente codificati per consentire il targeting specifico di tipo cellulare e l&#39;immagine di un campo di visione multistrato fornito da una sonda a prisma cronica impiantato, questo protocollo ha esplorato un caso tra molte applicazioni possibili: osservare le differenze laminari nell&#39;elaborazione corticale somatosensoria quando i topi Fisicamente impegnati con un oggetto nuovo ( Figura 5 ).Questa è la prima illustrazione procedurale di questo tipo di approccio specifico e in vivo di cellule specifiche per studiare più strati corticali in animali svegli e liberamente comportamentali e amplifica lo spettro dei metodi sperimentali disponibili per comprendere le strutture laminari nel cervello attivo. Il campo visivo periscopico permesso dalla sonda a prisma in questa tecnica può essere applicato in modo efficace ad altre strutture del cervello quando si desidera la conservazione del tessuto direttamente dorsale verso una regione di interesse; Per esempio, l&#39;imaging CA3 potrebbe essere raggiunto senza interruzione della funzione ippocampale. L&#39;approccio basato sulla sonda prismatica per l&#39;attività di imaging Ca 2+ richiede l&#39;inserimento fisico e l&#39;impianto permanente di un microprismo nella corteccia, che equivale alla creazione di una lesione corticale in cui viene inserita la sonda dell&#39;obiettivo. Ciò può causare interruzioni alla circuiteria neurale locale, compreso il taglio di dendriti e processi apici. TLa sua procedura provocherà anche un&#39;attivazione iniziale di cellule gliali nella regione, anche se questo si prevede di essere localizzato al tessuto circa 150 μm dalla faccia di prisma e di diminuire dopo che il cervello è guarito 22 . È molto importante considerare se questa tecnica influenzerà la normale anatomia e / o il comportamento del circuito quando pianifica esperimenti. I gruppi di controllo comportamentali dovrebbero sempre essere condotti per garantire che non ci siano alterazioni significative nei comportamenti di base che potrebbero produrre risultati confondenti sperimentali. Utilizzando questa miniatura, la tecnica mobile Ca 2+ di imaging con manipolazione neurofarmacologica, i diversi paradigmi cognitivi, sociali, motori o intrinseci comportamentali e combinandola con altre metriche fisiologiche possono approfondire e arricchire gli studi mirati alla comprensione dei ruoli funzionali dei circuiti neurali nel comportamento e nel segnale Elaborazione 32 . Soppressione o attivazioneLa determinazione di alcuni percorsi modulati da farmaci può influenzare comportamenti associati, che possono essere facilmente studiati usando questa tecnologia 33 . Il raggruppamento in diversi tipi di cellule modificando il targeting dell&#39;indicatore di calcio è un&#39;altra applicazione potente e utile e consente molte combinazioni creative di strumenti sperimentali per affrontare diverse domande sul circuito neurale.

La corteccia è un giocatore essenziale in molte complesse funzioni mentali e comportamentali, dall&#39;attenzione, dalla percezione sensoriale e dai controlli cognitivi dall&#39;alto 1 , 2 , 3 alle motivazioni, ricompense e dipendenze 4 , 5 . Comprendere i processi computazionali che sono alla base della sua funzione è un obiettivo importante per guidare una migliore comprensione clinica di molti disturbi mentali e comportamentali. Molte teorie attuali della malattia psichiatrica si concentrano attorno all&#39;idea che la disfunzione del circuito neuronale corticale o la disordinazione del disco possono essere alla base di anomalie cognitive e comportamentali che sono le caratteristiche di condizioni come la schizofrenia 6 , l&#39;autismo 7 o il disturbo ossessivo-compulsivo 8 . Così, ottenendo dati di attività neurale di popolazione da coI circuiti rtical all&#39;interno del corretto contesto di informazioni comportamentali simultanee sono di grande importanza e idealmente possono essere mirate a specifici tipi di cellule per la disezione del circuito neurale più fine. I microscopi miniaturizzati in combinazione con i microlenti dell&#39;indice di rifrazione del gradiente (GRIN) impiantabili permettono l&#39;accesso ottico a gruppi neuronali in condizioni di libera circolazione da una diversità di possibili regioni del cervello 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , incluse le corteccia 14 , 15 , 16 . L&#39;utilizzo di un sistema di microscopia mobile accoppiato con indicatori di calcio geneticamente codificato consente di ottenere immagini coerenti della stessa popolazione cellulare che comprende centinaia di neuroni tra giorni e settimane in molte regioni del cervello 9 e può essereGeneticamente mirati a specifici tipi di cellule utilizzando vettori virali o tecniche transgeniche. Poiché la corteccia è conosciuta per supportare funzioni diverse e connettersi a diverse regioni del cervello a seconda della posizione delle celle all&#39;interno della lamina corticale 17 , 18 , 19 , siamo interessati ad ottenere un&#39;attività neurale contemporanea multi-strato in soggetti comportamentali svegli. Qui dimostriamo come immagini centinaia di neuroni etichettati a fluorescenza nei topi liberi di comportamento per giorni, utilizzando il microscopio miniaturizzato a fluorescenza 20 accoppiato con una sonda prismata impiantata, che offre una visione multipla della corteccia ( Figura 1 ). La sonda a prisma utilizzata qui è composta da due lenti separate GRIN: un prisma e una lente cilindrica del relè ( figura 1 ). La luce del microscopio eccita il fluorescenti etichettatoCellule situate lungo la faccia di imaging della sonda a prisma, dopo essere riflesse dall&#39;ipotena della porzione di prisma della sonda. La luce emessa dalle cellule riflette anche l&#39;ipotenusa del prisma, viene raccolta attraverso l&#39;obiettivo del microscopio e raggiunge il sensore nel microscopio. La sonda a prisma utilizzata in questa procedura è adattata per un facile utilizzo con apparecchiature standard stereotassiali. Il microscopio miniaturizzato di fluorescenza 20 rileva i transienti Ca 2+ evocati dal potenziale d&#39;azione nelle popolazioni neuronali con risoluzione di una singola cellula, dopo che queste cellule sono state specificamente etichettate con indicatori fluorescenti geneticamente codificati Ca 2+ . In questo protocollo, abbiamo iniettato l&#39;indicatore Ca 2+ codificato in un vettore virale (AAV1.CaMKII.GCaMP6f.WPRE.SV40), implantato una sonda a prisma, installato il microscopio, quindi ottenuto più giorni di dati di attività neurale somatosensoriale (S1 posteriori) Da un animale esponeD alle nuove superfici dell&#39;oggetto durante l&#39;esplorazione gratuita ( Figura 2 ).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Neurostar Motorized 
			Ultra Precise Small Animal Stereotaxic Instrument</td>
			<td>Kopf</td>
			<td>Model 963SD</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereoscope</td>
			<td>Labomed</td>
			<td>Prima DNT</td>
			<td>Surgery and Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Rectal Thermistor Probe (.062&#34;/1.6mm diameter) - 1/4&#34; Jack</td>
			<td>FHC</td>
			<td>40-90-5D-02</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating Pad 5 X 12.5cm&#160;</td>
			<td>FHC</td>
			<td>40-90-2-07</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC Temperature Controller</td>
			<td>FHC</td>
			<td>40-90-8D</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsyringe Pump</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>UMP3 model; serial 155788 F110</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoFil 10&#956;L Syringe</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>NANOFIL</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 G Beveled Tip Nanofil NDL 2PK</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>NF35BV-2</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omnidrill35, 115-230V</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>503598</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Burrs for Micro Drill</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>19007-05</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nVista</td>
			<td>Inscopix</td>
			<td>100-001048</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV1.CaMKII.GCaMP6f.WPRE.SV40</td>
			<td>Penn Vector Core</td>
			<td>AV-1-PV3435</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketoprofen</td>
			<td>Victor Medical</td>
			<td>5487</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carprofen</td>
			<td>Victor Medical</td>
			<td>1699008&#160;</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Victor Medical</td>
			<td>1001054</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelfoam (Patterson Veterinary Supply Inc Gelfoam Sponge 12cmx7mm)</td>
			<td>Pfizer (Fisher Scientific)</td>
			<td>NC9841478</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5/45 forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-35</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-30</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting knives</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10055-12</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProView Implant Kit</td>
			<td>Inscopix</td>
			<td>100-000756</td>
			<td>Surgery and Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProView Prism Probe 1.0mm-Dia. ~4.3mm Length</td>
			<td>Inscopix</td>
			<td>100-000592</td>
			<td>Surgery and Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kwik-Sil adhesive pack of 2</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>KWIK-SIL</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kwik-Cast Sealant</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>KWIK-CAST</td>
			<td>Surgery and Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniature Optical Mounting Post</td>
			<td>Newport</td>
			<td>M-TSP-3</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Baseplate</td>
			<td>Inscopix</td>
			<td>BPL-2</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Baseplate Cover</td>
			<td>Inscopix</td>
			<td>BPC-2</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
	</tbody>
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multi-layer cortical ca2+ imaging in freely moving mice with prism probes and miniaturized fluorescence microscopy

L&#39; imaging funzionale a livello di circuito e di livello cellulare in vivo è uno strumento cruciale per capire il cervello in azione. L&#39;imaging ad alta risoluzione dei neuroni corticali di topi con la microscopia a due fotoni ha fornito una visione unica sulle strutture corticali, sulla funzionalità e sulla plasticità. Tuttavia, questi studi sono limitati agli animali fisso testa, riducendo notevolmente la complessità comportamentale disponibile per lo studio. In questo articolo descriviamo una procedura per eseguire la microscopia cronica di fluorescenza con risoluzione cellulare su più strati corticali in topi comportamentali liberamente. Abbiamo utilizzato un microscopio integrato miniaturizzato a fluorescenza accoppiato con una sonda prismata impiantata per visualizzare e registrare simultaneamente le dinamiche di calcio di centinaia di neuroni attraverso diversi strati della corteccia somatosensoriale come il mouse si è impegnato in un nuovo esplorazione di oggetti oggetto, per diversi giorni. Questa tecnica può essere adattata ad altre regioni del cervello in diverse specie animali per altri comportamentaliaradigms.

Il protocollo descritto qui descrive un modo efficace ed efficace per eseguire l&#39;imaging Ca 2+ multi-layer longitudinale da centinaia di neuroni corticali in topi comportamentali che usano sonde prismatiche ( Figura 1 ). Gli approcci precedenti verso l&#39;imaging corticale multistrato sono stati principalmente limitati agli animali fisso testa 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 . Per acquisire questo livello di dati in un contesto comportamentale liberamente, è stata utilizzata una piattaforma miniaturizzata di microscopi per la flessibilità comportamentale; Un indicatore di calcio geneticamente codificato (GCaMP6f) è stato utilizzato per individuare una popolazione cellulare specifica (cellule CAMKII + nella corteccia); E una sonda a prisma è stata scelta per fornire un campo visivo cronico e multistrato. <p class="jove_content" fo:keep-ogether.within-page = &quot;1&quot;&gt; Abbiamo dimostrato il flusso di lavoro per la preparazione dell&#39;animale per l&#39;imaging. Un vettore virale che codifica un indicatore di calcio appropriato è stato iniettato nella corteccia ( figura 2 , passaggio 1), prima di impianto cronometrico di una sonda a prisma per consentire l&#39;accesso ottico alle celle etichettate ( figura 2 , passaggio 2). Una piastra base che funge da banchina sicura e temporanea per il posizionamento del microscopio durante le sessioni di imaging è stata poi installata sulla testa dell&#39;animale ( figura 2 , passaggio 3), consentendo la visualizzazione dell&#39;attività corticale su più strati di cellule in un esperimento sveglio di comportamento Setup ( Figura 2 , passaggio 4). Per assicurare che la popolazione cellulare desiderata sia stata selezionata, nella figura 3 è mostrata una sezione cerebrale coronale post-mortem da un topo rappresentativo con il tratto di sonda prismastico e il campo di vista contrassegnato rispetto al laboratorio GCaMP6fNeuroni eled nei livelli 2/3 e 5 della corteccia somatosensoriale. Durante il comportamento sveglio con il sistema, l&#39;attività dei neuroni corticali somatosensori è stata registrata quando il mouse è stato esposto a tre diversi ambienti: Open Field (Day 1), Object Familiarization (Day 2-4) e Object Novel (Day 5) ( Figura 4 ). Il giorno 1 il mouse è stato collocato in un arena comportamentale privo di qualsiasi oggetto. Il giorno 2-4 il mouse è stato messo nell&#39;arena con gli stessi due oggetti strutturalmente diversi (un gel pad e un blocco di legno). Il giorno 5, uno degli oggetti è stato sostituito da un nuovo oggetto. L&#39;animale è stato imaging per 5 giorni per 20 minuti ogni giorno. Dopo l&#39;estrazione delle cellule usando il software di analisi dei dati di immagine Ca 2+ , i filtri spaziali corrispondenti alle posizioni delle cellule sono state sovrapposte alla proiezione di intensità fluorescente media dei dati di registrazione del microscopio( Figura 5) . Una linea tratteggiata bianca separa gli strati di 2/3 e 5 cellule. Le corrispondenti Ca 2+ tracce da 5 celle di ognuno dei livelli mostrano lo schema di cottura delle celle in due contesti comportamentali diversi: Object Familiarization e Novel Object Exposure. Le cellule Layer 2/3 erano più attive rispetto alle cellule del livello 5 il giorno in cui il mouse è stato esposto ad un oggetto nuovo. Ciò è anche evidente dalle trame raster che mostrano l&#39;attività di cottura soggetta a tutte le cellule imaged nei giorni 1, 4 e 5. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55579/55579fig1.jpg" /> Figura 1: In Vivo Ca 2+ Imaging su più livelli corticali in Mouse in movimento. ( A ) Specifiche della sonda prismata e rappresentazione del piano di imaging. Il rivestimento riflettente all&#39;interno dell&#39;ipotenusa consente di imaging 90 ° dal piano di inserimento della sonda a prisma. La lente cuFf si integra con il supporto dell&#39;obiettivo, che semplifica la procedura di impianto e consente la visualizzazione potenziale della fluorescenza del tessuto ambientale durante l&#39;impianto ( B ) (i). Illustrazione del posizionamento della craniotomia e del coltello della pressa prismatica rispetto al sito di iniezione del virus, e (ii) l&#39;illustrazione della posizione della sonda di prisma della superficie piana rispetto all&#39;incisione del coltello e al sito di iniezione del virus. ( C ) Illustrazione di setup in-vivo di Ca 2+ che mostra il percorso della luce per una piccola area all&#39;interno del campo visivo attraverso la sonda a prisma impiantata nella corteccia del mouse. ( D ) Campo di vista di esempio durante l&#39;installazione della sonda a prisma. Il microscopio miniaturizzato è collegato al supporto dell&#39;obiettivo, che contiene la sonda a prisma che consente di controllare l&#39;espressione del virus durante l&#39;installazione della sonda a prisma. ( E ) Integrazione del microscopio con sonda a prisma per l&#39;imaging corticale multistrato di celle S1 etichettate con GCaMP6f. F Campo di visualizzazione di esempioDurante l&#39;installazione del basamento. Il modello di vaso sanguigno chiaro è visibile al momento dell&#39;installazione del basamento con alcune celle nell&#39;immagine grezze. Altre celle sono chiaramente visibili quando DF / F è acceso nella finestra del software di acquisizione. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55579/55579fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/55579/55579fig2.jpg" /> Figura 2: Diagramma che mostra la sequenza temporale degli eventi del flusso di lavoro per l&#39;impianto di impianto e l&#39;installazione del microscopio. Numero di settimane è rappresentato sull&#39;asse X e le fasi del flusso di lavoro delle procedure lungo l&#39;asse Y. ( A ) Grafico che illustra l&#39;iniezione virale (AAV1.CaMKII.GCaMP6f.WPRE.SV40) lungo lo stesso asse dorso-ventrale, per etichettare più strati della corteccia somatosensoria del topo. ( B ) 2 settimane dopo le iniezioni di virus, un prisma probE viene impiantato ad un asse parallelo ai siti di iniezione del virus. ( C ) Circa una settimana dopo l&#39;impianto di pressa pressa, l&#39;animale viene controllato per l&#39;espressione con il microscopio e una piastra di base è montata sulla testa se una popolazione di cellule è visibile. ( D ) L&#39;animale è quindi pronto per l&#39;imaging cronico durante compiti comportamentali pertinenti (Clip art del mouse modificato dopo il permesso di UW-Madison Biochemistry MediaLab). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55579/55579fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/55579/55579fig3.jpg" /> Figura 3: Validazione istologica postmortem della posizione della sonda prismata e dell&#39;espressione GCaMP. ( A ) sezione coronale da un cervello del topo rappresentativo che mostra il tratto della sonda della prism e con il suo lato di imaging rivoltoLe cellule espresse GCaMP6f (AAV1.CaMKII.GCaMP6f espresse nei neuroni negli strati 2/3 e 5). ( B ) Same sezione del cervello coronale dopo la colorazione per DAPI. Barra di scala = 250 μm ( C ) Zoomato in vista delle cellule GCaMP6f espresse in corteccia somatosensoriale. Barra di scala = 100 μm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55579/55579fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/55579/55579fig4.jpg" /> Figura 4: L&#39;attività del mouse durante l&#39;abitudine, la familiarizzazione e il nuovo esame di esposizione degli oggetti sono stati monitorati tramite video utilizzando il software video. ( A ) Il primo giorno, l&#39;animale è stato messo in un arena comportamentale privo di qualsiasi oggetto (Open Field). ( B ) Nei giorni 2-4, gli stessi due oggetti strutturalmente diversi (gel pad e blocco di legno) sono stati posti nell&#39;arena (Object Familiarization). ( C ) Il giorno 5, uno degli oggetti è stato sostituito da un oggetto nuovo (blocco di legno con carta sabbia) (Novel Object Exposure). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55579/55579fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/55579/55579fig5.jpg" /> Figura 5: Dinamica del calcio da superficiali e profondi livelli di corteccia somatosensoriale di un topo rappresentativo con il microscopio. ( A ) Immagine unita di filtri spaziali neuronali (blobs verdi) e proiezione media di intensità di fluorescenza della registrazione del microscopio attraverso il campo visivo della sonda a prisma. Il confine tra gli strati supragranulari e infragranulari indicati da una linea bianca tratteggiata. Barra di scala = 100 μm. ( B ) Tracce di calcio da cinque esempi di cellule strati superficiali e profonde (riempito blu e rosso cElls nel pannello A), indicando unità di deviazione standard della fluorescenza seguendo l&#39;analisi principale e indipendente dei componenti. Barra di scala orizzontale 50 s e barra di scala verticale 10 SD ( C ) Trama raster di celle superficiali (strati 2/3) e strati profondi (livello 5) mostrati sul campo aperto, Object Familiarization e Novel object exploration. Barra di scala = 100 s. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55579/55579fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Multi-layer Cortical Ca2+ Imaging in Freely Moving Mice with Prism Probes and Miniaturized Fluorescence Microscopy

Qui esempiamo una procedura per l&#39;esecuzione di immagini su larga scala Ca 2+ con risoluzione cellulare su più strati corticali in topi liberamente spostati. Centinaia di cellule attive possono essere osservate simultaneamente utilizzando un microscopio a testa in miniatura accoppiato con una sonda a prisma implantato.

Corticale multistrato Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Imaging nei mouse con movimento libero con sonde a prisma e microscopia a fluorescenza miniaturizzata

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