Name: multi-layer cortical ca2+ imaging in freely moving mice with prism probes and miniaturized fluorescence microscopy
Uploaded: 2017-06-13T12:30:00
Duration: 10 min 35 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multi-layer Cortical Ca2+ Imaging in Freely Moving Mice with Prism Probes and Miniaturized Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Forfatterne vil gjerne takke V. Jayaraman, DS Kim, LL Looger og K. Svoboda fra Genie-prosjektet Genetisk kodet Neuronal Indicator and Effector (GENIE) på Janelia Research Campus i Howard Hughes Medical Institute for deres sjenerøse donasjon av AAV1-GCaMP6f Til University of Pennsylvania Vector Core. De vil også gjerne takke A. Olson og Neuroscience Microscopy Core ved Stanford University støttet av NIH NS069375 stipend for sine konfokale mikroskopi tjenester.

<ol>
	<li>McConnell, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+decision-making+in+the+mammalian+cerebral+cortex.">Development and decision-making in the mammalian cerebral cortex.</a> Brain Res. 472 (1), 1-23 (1988).</li><li>Kwon, S. E., Yang, H., Minamisawa, G., O'Connor, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensory+and+decision-related+activity+propagate+in+a+cortical+feedback+loop+during+touch+perception.">Sensory and decision-related activity propagate in a cortical feedback loop during touch perception.</a> Nat. Neurosci. 19 (9), 1243-1249 (2016).</li><li>Miller, E. K., Cohen, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrative+theory+of+prefrontal+cortex+function.">An integrative theory of prefrontal cortex function.</a> Annu. Rev. Neurosci. 24, 167-202 (2001).</li><li>Bailey, M. R., Simpson, E. H., Balsam, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+substrates+underlying+effort,+time,+and+risk-based+decision+making+in+motivated+behavior.">Neural substrates underlying effort, time, and risk-based decision making in motivated behavior.</a> Neurobiol. Learn. Mem. 133, 233-256 (2016).</li><li>Dehaene, S., Changeux, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reward-dependent+learning+in+neuronal+networks+for+planning+and+decision+making.">Reward-dependent learning in neuronal networks for planning and decision making.</a> Prog. Brain Res. 126, 217-229 (2000).</li><li>Ferenczi, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prefrontal+cortical+regulation+of+brainwide+circuit+dynamics+and+reward-related+behavior.">Prefrontal cortical regulation of brainwide circuit dynamics and reward-related behavior.</a> Science. 351 (6268), aac9698 (2016).</li><li>Anomal, R. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+Processing+in+the+Primary+Auditory+Cortex+of+an+Animal+Model+of+Autism.">Impaired Processing in the Primary Auditory Cortex of an Animal Model of Autism.</a> Front. Sys. Neurosci. 9, 158 (2015).</li><li>Pauls, D. L., Abramovitch, A., Rauch, S. L., Geller, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obsessive-compulsive+disorder:+an+integrative+genetic+and+neurobiological+perspective.">Obsessive-compulsive disorder: an integrative genetic and neurobiological perspective.</a> Nat. Rev. Neurosci. 15 (6), 410-424 (2014).</li><li>Ziv, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+dynamics+of+CA1+hippocampal+place+codes.">Long-term dynamics of CA1 hippocampal place codes.</a> Nat. Neurosci. 16 (3), 264-266 (2013).</li><li>Jennings, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+hypothalamic+network+dynamics+for+appetitive+and+consummatory+behaviors.">Visualizing hypothalamic network dynamics for appetitive and consummatory behaviors.</a> Cell. 160 (3), 516-527 (2015).</li><li>Betley, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurons+for+hunger+and+thirst+transmit+a+negative-valence+teaching+signal.">Neurons for hunger and thirst transmit a negative-valence teaching signal.</a> Nature. 521 (7551), 180-185 (2015).</li><li>Sun, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+speed+dependence+of+entorhinal+island+and+ocean+cells,+including+respective+grid+cells.">Distinct speed dependence of entorhinal island and ocean cells, including respective grid cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 112 (30), 9466-9471 (2015).</li><li>Kitamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entorhinal+Cortical+Ocean+Cells+Encode+Specific+Contexts+and+Drive+Context-Specific+Fear+Memory.">Entorhinal Cortical Ocean Cells Encode Specific Contexts and Drive Context-Specific Fear Memory.</a> Neuron. 87 (6), 1317-1331 (2015).</li><li>Pinto, L., Dan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-Type-Specific+Activity+in+Prefrontal+Cortex+during+Goal-Directed+Behavior.">Cell-Type-Specific Activity in Prefrontal Cortex during Goal-Directed Behavior.</a> Neuron. 87 (2), 437-450 (2015).</li><li>Cox, J., Pinto, L., Dan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+imaging+of+sleep-wake+related+neuronal+activity+in+the+dorsal+pons.">Calcium imaging of sleep-wake related neuronal activity in the dorsal pons.</a> Nat. Comm. 7, 10763 (2016).</li><li>Resendez, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+cortical,+subcortical+and+deep+brain+neural+circuit+dynamics+during+naturalistic+mammalian+behavior+with+head-mounted+microscopes+and+chronically+implanted+lenses.">Visualization of cortical, subcortical and deep brain neural circuit dynamics during naturalistic mammalian behavior with head-mounted microscopes and chronically implanted lenses.</a> Nat. Protoc. 11 (3), 566-597 (2016).</li><li>Hooks, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+cortical+and+thalamic+input+to+pyramidal+neurons+in+mouse+motor+cortex.">Organization of cortical and thalamic input to pyramidal neurons in mouse motor cortex.</a> The J. Neurosci. 33 (2), 748-760 (2013).</li><li>Masamizu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+distinct+layer-specific+dynamics+of+cortical+ensembles+during+learning+of+a+motor+task.">Two distinct layer-specific dynamics of cortical ensembles during learning of a motor task.</a> Nat. Neurosci. 17 (7), 987-994 (2014).</li><li>Rowland, D. C., Moser, M. -. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+cortical+modules+to+memories.">From cortical modules to memories.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 24 (1), 22-27 (2014).</li><li>Ghosh, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Miniaturized+integration+of+a+fluorescence+microscope.">Miniaturized integration of a fluorescence microscope.</a> Nat. Methods. 8 (10), 871-878 (2011).</li><li>Mukamel, E. A., Nimmerjahn, A., Schnitzer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+analysis+of+cellular+signals+from+large-scale+calcium+imaging+data.">Automated analysis of cellular signals from large-scale calcium imaging data.</a> Neuron. 63 (6), 747-760 (2009).</li><li>Andermann, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+cellular+imaging+of+entire+cortical+columns+in+awake+mice+using+microprisms.">Chronic cellular imaging of entire cortical columns in awake mice using microprisms.</a> Neuron. 80 (4), 900-913 (2013).</li><li>Goldey, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removable+cranial+windows+for+long-term+imaging+in+awake+mice.">Removable cranial windows for long-term imaging in awake mice.</a> Nat. Protoc. 9 (11), 2515-2538 (2014).</li><li>Chia, T. H., Levene, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+deep+cortical+layers+using+a+microprism.">In vivo imaging of deep cortical layers using a microprism.</a> J. Vis. Exp. (30), (2009).</li><li>Chia, T. H., Levene, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microprisms+for+in+vivo+multilayer+cortical+imaging.">Microprisms for in vivo multilayer cortical imaging.</a> J. Neurophysiol. 102 (2), 1310-1314 (2009).</li><li>Chia, T. H., Levene, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-layer+in+vivo+imaging+of+neocortex+using+a+microprism.">Multi-layer in vivo imaging of neocortex using a microprism.</a> Cold Spring Harb. Protoc. 2010 (8), (2010).</li><li>Low, R. J., Gu, Y., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+resolution+optical+access+to+brain+regions+in+fissures:+imaging+medial+prefrontal+cortex+and+grid+cells+in+entorhinal+cortex.">Cellular resolution optical access to brain regions in fissures: imaging medial prefrontal cortex and grid cells in entorhinal cortex.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 111 (52), 18739-18744 (2014).</li><li>Zeisel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+structure.+Cell+types+in+the+mouse+cortex+and+hippocampus+revealed+by+single-cell+RNA-seq.">Brain structure. Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq.</a> Science. 347 (6226), 1138-1142 (2015).</li><li>Hawrylycz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inferring+cortical+function+in+the+mouse+visual+system+through+large-scale+systems+neuroscience.">Inferring cortical function in the mouse visual system through large-scale systems neuroscience.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 113 (27), 7337-7344 (2016).</li><li>Petrof, I., Viaene, A. N., Sherman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+the+primary+somatosensory+cortex+projection+to+the+primary+motor+cortex+in+the+mouse.">Properties of the primary somatosensory cortex projection to the primary motor cortex in the mouse.</a> J. Neurophysiol. 113 (7), 2400-2407 (2015).</li><li>Aronoff, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-range+connectivity+of+mouse+primary+somatosensory+barrel+cortex.">Long-range connectivity of mouse primary somatosensory barrel cortex.</a> Euro. J. Neurosci. 31 (12), 2221-2233 (2010).</li><li>Rogan, S. C., Roth, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remote+control+of+neuronal+signaling.">Remote control of neuronal signaling.</a> Pharma. Rev. 63 (2), 291-315 (2011).</li><li>Berdyyeva, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zolpidem+reduces+hippocampal+neuronal+activity+in+freely+behaving+mice:+a+large+scale+calcium+imaging+study+with+miniaturized+fluorescence+microscope.">Zolpidem reduces hippocampal neuronal activity in freely behaving mice: a large scale calcium imaging study with miniaturized fluorescence microscope.</a> PloS One. 9 (11), e112068 (2014).</li></ol>

Forfatterne har lest journalens policy og har følgende konkurrerende interesser: SG, SO og VC er betalt ansatte hos Inscopix.

Forståelse av neural kretsaktivitet under våken oppførsel er et viktig nivå av nevro-vitenskapelig etterforskning som trengs for å effektivt dissekere hjernens funksjon i helse og sykdom. Cortex er en spesielt viktig region for å studere i sammenheng med våken oppførsel, da den spiller en viktig rolle i mange viktige sensoriske, kognitive og utøvende funksjoner 28 , 29 . Den kortikale kolonnen antas å være den grunnleggende funksjonelle enheten i cortex og populasjonsnivåaktiviteten av kortikale celler er kjent for å variere basert på deres fysiske plassering i kolonnen. Eksempelvis stimulerer eksitatoriske nevroner i lag 2/3 i den somatosensoriske cortex primært til andre neokortiske områder og modulerer andre kortikale nettverk 30 , mens celler i dypere lag primært prosjekterer til subkortiske områder som thalamus 31 . Registrere aktiviteten til hundreS av forhåndsdefinerte corticale celler samtidig og pålitelig over tid på tvers av forskjellige laminer i fritt oppførte fag, vil i stor grad fremme vår forståelse av kortikal informasjonsflyt, noe som muliggjør finere funksjonell disseksjon av kortikale kolonner informert av sanntidsadferddsinformasjon og oppgaverelevant tids- skalaer. Innsamling av dette nivået av nevrale kretsdata gjøres mulig ved bruk av en effektiv og strømlinjeformet miniatyrisert mikroskopi-plattform for å gjennomføre storskala Ca 2+ -bildebehandling i fritt oppførte fag (eller hovede fag som ønsket). Brukes med genetisk kodede kalsiumindikatorer for å muliggjøre spesifikk målretting av celletype og avbildning av et flerlags synsfelt levert av en kronisk implantert prisme-sonde, undersøkte denne protokollen en sak blant mange mulige anvendelser: observere laminære forskjeller i somatosensorisk kortisk behandling når mus Fysisk engasjert med et nytt objekt ( figur 5 ).Dette er den første prosessuelle illustrasjonen av denne typen spesifikke, in vivo tilnærming for celletype for å studere flere kortikale lag i våte, fritt oppførte dyr, og bredere spekteret av eksperimentelle metoder som er tilgjengelige for å forstå laminære strukturer i den aktive hjerne. Det periskopiske synsfelt aktivert av prisme-sonden i denne teknikken kan gjennomførbart påføres andre hjernestrukturer når bevaring av vevet direkte dorsalt til en region av interesse er ønsket; For eksempel kan CA3-bildebehandling oppnås uten forstyrrelse av hippokampfunksjonen. Prismodellbasert tilnærming for avbildning av Ca 2+ -aktivitet krever fysisk innsetting og permanent implantering av en mikroprism i barken, noe som tilsvarer opprettelsen av en kortisk lesjon hvor linsesonden sitter inn. Dette kan føre til forstyrrelser i det lokale nevrale kretsløpet, inkludert avskjæring av apikale dendriter og prosesser. THans prosedyre vil også føre til en initial aktivering av glialceller i regionen, selv om dette forventes å være lokalisert til vevet ca. 150 μm fra prismeflaten, og å avta etter at hjernen har helbredet 22 . Det er svært viktig å vurdere om denne teknikken vil påvirke normal kretsanatomi og / eller oppførsel av dyrene når du planlegger eksperimenter. Behaviorskontrollgrupper bør alltid utføres for å sikre at det ikke er noen signifikante endringer i baseline atferd som kan forårsake forvirrende eksperimentelle resultater. Ved hjelp av denne miniatyriserte, mobile Ca 2+ -bildebehandlingsteknikken med nevro-farmakologisk manipulasjon, ulike kognitive, sosiale, motoriske eller iboende atferdsparadigmaer, og kombinere det med andre fysiologiske beregninger, kan du fordyre og berike studier som er fokusert på å forstå funksjonelle roller i nevrale kretser i atferd og signal Prosessering 32 . Suppression eller aktivAtion av visse veier modulert av legemidler kan påvirke tilhørende atferd, noe som lett kan studeres ved hjelp av denne teknologien 33 . Forgrening i forskjellige celletyper ved å modifisere målingen av kalsiumindikatoren er en annen kraftig og nyttig applikasjon, og muliggjør mange kreative kombinasjoner av eksperimentelle verktøy for å adressere ulike neurale kretsspørsmål.

Cortexen er en viktig spiller i mange komplekse mentale og atferdsfunksjoner, fra oppmerksomhet, sensorisk oppfatning og top-down kognitiv kontroll 1 , 2 , 3 til motivasjons-, belønnings- og avhengighetsveier 4 , 5 . Å forstå de beregningsmessige prosessene som ligger til grund for sin funksjon er et viktig mål å drive en bedre klinisk forståelse av mange psykiske og atferdsforstyrrelser. Mange nåværende teorier om psykiatrisk sykdom senterer ideen om at kortikale nevrale krets dysfunksjon eller diskoordinering kan ligge til grund for kognitive og adferdsmessige abnormiteter som er kjennetegn ved forhold som skizofreni 6 , autisme 7 eller tvangssyndrom 8 . Dermed oppnår man nevraaktivitetsdata fra populasjonsnivå fra koRtiske kretser innenfor riktig sammenheng med samtidig atferdsdata er av stor betydning, og kan ideelt sett målrettes mot bestemte celletyper for finere nevrale kretsdiseksjon. Miniaturiserte mikroskoper i forbindelse med implanterbare gradientbrytningsindeks (GRIN) mikrolinser muliggjør optisk tilgang til neuronale ensembler under frie bevegelige forhold fra et mangfold av mulige hjernegrupper 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , inkludert cortex 14 , 15 , 16 . Ved å bruke et mobilt mikroskopisystem kombinert med genetisk kodede kalsiumindikatorer, muliggjør konsistent avbildning av den samme cellulære befolkningen som omfatter hundrevis av nevroner i løpet av dager til uker i mange hjernegrupper 9 , og kan væreGenetisk målrettet mot bestemte celletyper ved bruk av viral vektor eller transgene teknikker. Som cortex er kjent for å støtte forskjellige funksjoner og koble til forskjellige hjerneområder, avhengig av plasseringen av cellene i cortical lamina 17 , 18 , 19 , er vi interessert i å skaffe samtidig flerlags nevral aktivitet i våte oppførende fag. Her viser vi hvordan du kan vise hundrevis av fluorescensmerkede nevroner i fritt oppførsel av mus over dager, ved hjelp av det miniatyriserte fluorescensmikroskop 20 parret med en implantert prisme-sonde, som gir en flerlagsvisning av cortexen ( figur 1 ). Prismåleren som brukes her består av to separate GRIN-linser: et prisme og et sylindrisk reléobjektiv ( figur 1 ). Lyset fra mikroskopet stimulerer fluorescensmerketCeller som befinner seg langs bildebehandlingsoverflaten av prisme-sonden, etter å være reflektert av hypotenus av prismedelen av sonden. Det utstrålede lyset fra cellene reflekterer også av prismens hypotenuse, samles inn gjennom mikroskopens mål og når sensoren i mikroskopet. Prisme sonden som brukes i denne prosedyren er tilpasset for enkel bruk med standard stereotaksisk utstyr. Det miniatyriserte fluorescensmikroskop 20 detekterer virkningspotensial-fremkalte Ca 2+ transienter i nevronpopulasjoner med enkeltcelleoppløsning, etter at disse cellene har blitt spesifikt merket med Ca 2+ -følsomme genetisk kodede fluorescerende indikatorer. I denne protokollen injiserer vi Ca 2+ -indikatoren kodet i en viral vektor (AAV1.CaMKII.GCaMP6f.WPRE.SV40), implanterer en prisme sonde, installerer mikroskopet, og oppnår så mange dager somatosensoriske (S1 bakre lemmer) nevrale aktivitetsdata Fra et dyr avsløreD til nye objektoverflater under fri leting ( figur 2 ).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Neurostar Motorized 
			Ultra Precise Small Animal Stereotaxic Instrument</td>
			<td>Kopf</td>
			<td>Model 963SD</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereoscope</td>
			<td>Labomed</td>
			<td>Prima DNT</td>
			<td>Surgery and Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Rectal Thermistor Probe (.062&#34;/1.6mm diameter) - 1/4&#34; Jack</td>
			<td>FHC</td>
			<td>40-90-5D-02</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating Pad 5 X 12.5cm&#160;</td>
			<td>FHC</td>
			<td>40-90-2-07</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC Temperature Controller</td>
			<td>FHC</td>
			<td>40-90-8D</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsyringe Pump</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>UMP3 model; serial 155788 F110</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoFil 10&#956;L Syringe</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>NANOFIL</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 G Beveled Tip Nanofil NDL 2PK</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>NF35BV-2</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omnidrill35, 115-230V</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>503598</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Burrs for Micro Drill</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>19007-05</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nVista</td>
			<td>Inscopix</td>
			<td>100-001048</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV1.CaMKII.GCaMP6f.WPRE.SV40</td>
			<td>Penn Vector Core</td>
			<td>AV-1-PV3435</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketoprofen</td>
			<td>Victor Medical</td>
			<td>5487</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carprofen</td>
			<td>Victor Medical</td>
			<td>1699008&#160;</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Victor Medical</td>
			<td>1001054</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelfoam (Patterson Veterinary Supply Inc Gelfoam Sponge 12cmx7mm)</td>
			<td>Pfizer (Fisher Scientific)</td>
			<td>NC9841478</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5/45 forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-35</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-30</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting knives</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10055-12</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProView Implant Kit</td>
			<td>Inscopix</td>
			<td>100-000756</td>
			<td>Surgery and Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProView Prism Probe 1.0mm-Dia. ~4.3mm Length</td>
			<td>Inscopix</td>
			<td>100-000592</td>
			<td>Surgery and Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kwik-Sil adhesive pack of 2</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>KWIK-SIL</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kwik-Cast Sealant</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>KWIK-CAST</td>
			<td>Surgery and Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniature Optical Mounting Post</td>
			<td>Newport</td>
			<td>M-TSP-3</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Baseplate</td>
			<td>Inscopix</td>
			<td>BPL-2</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Baseplate Cover</td>
			<td>Inscopix</td>
			<td>BPC-2</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multi-layer cortical ca2+ imaging in freely moving mice with prism probes and miniaturized fluorescence microscopy

In vivo krets og mobilnivå funksjonell bildebehandling er et kritisk verktøy for å forstå hjernen i handling. Høyoppløselig bildebehandling av musekortiske nevroner med tofotonmikroskopi har gitt unikt innblikk i kortikal struktur, funksjon og plastisitet. Disse studiene er imidlertid begrenset til hodede faste dyr, og reduserer den adferdsmessige kompleksiteten som er tilgjengelig for studier. I dette papiret beskriver vi en prosedyre for å utføre kronisk fluorescensmikroskopi med cellulær oppløsning på tvers av flere kortikale lag i fritt oppførte mus. Vi brukte et integrert miniatyrisert fluorescensmikroskop parret med en implantert prisme sonde for samtidig å visualisere og registrere kalsiumdynamikken til hundrevis av nevroner på tvers av flere lag av den somatosensoriske cortexen som musen forlovet i en romanobservasjonsoppgave i flere dager. Denne teknikken kan tilpasses andre hjernegrupper i forskjellige dyrearter for andre betegnelser paradigms.

Protokollen som er skissert her beskriver en effektiv og effektiv måte å utføre langsgående multilag Ca 2+ avbildning fra hundrevis av kortikale nevroner i fritt oppførte mus ved bruk av prismerprober ( Figur 1 ). Tidligere tilnærminger til flerskikts kortikal bildebehandling er først og fremst begrenset til hodede faste dyr 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 . For å skaffe seg dette nivået av data i en fritt oppførende kontekst, ble en miniatyrisert mikroskopplattform brukt for atferds fleksibilitet; En genetisk kodet kalsiumindikator (GCaMP6f) ble brukt til å målrette en bestemt cellepopulasjon (CAMKII + -celler i cortexen); Og en prisme sonde ble valgt for å gi et kronisk flerskiktsfelt. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; Vi viste arbeidsflyten for å forberede dyret til avbildning. En viral vektor som koder for en passende kalsiumindikator ble injisert i cortexen ( figur 2 , trinn 1) før kronisk implantering av en prisme sonde for å aktivere optisk tilgang til de merkede celler ( figur 2 , trinn 2). Et grunnplater som tjener som en sikker, midlertidig brygge for posisjonering av mikroskopet under bildebehandling ble deretter installert over dyrets hode ( Figur 2 , Trinn 3), som muliggjør visualisering av kortikal aktivitet på tvers av flere cellelag i en våken oppførsel eksperimentell Oppsett ( figur 2 , trinn 4). For å sikre at den ønskede cellulære populasjonen ble målrettet, vises en post mortem-koronal hjerneseksjon fra en representativ mus i figur 3 med prisme-sondens kanal og synsfelt merket i forhold til GCaMP6f-labEled nevroner i lag 2/3 og 5 av den somatosensory cortex. Under våken opptegning med systemet ble aktiviteten til de somatosensoriske kortikale nevronene registrert da musen ble eksponert for tre forskjellige miljøer - Åpen felt (Dag 1), Objektskjennelse (Dag 2-4) og Det nye objektet (Dag 5) ( Figur 4 ). På dag 1 ble musen plassert i en adferds arena uten noen objekter. På dag 2-4 ble musen plassert i arenaen med de samme to teksturelt forskjellige objektene (en gelpute og en treblokk). På dag 5 ble en av objektene erstattet med et nytt objekt. Dyret ble avbildet over 5 dager i 20 minutter hver dag. Etter celleutvinning ved hjelp av Ca 2+ bildedataanalyseprogrammet ble romlige filtre tilsvarende cellesteder overlagt på den midlere fluorescerende intensitetsprojeksjon av mikroskopopptaksdataene( Figur 5) . En hvit strekket linje skiller lag 2/3 og 5 celler. Tilsvarende Ca 2+ -spor fra 5 celler fra hvert lag viser brennstoffmønsteret til cellene i to forskjellige atferdsmessige sammenhenger - Objektkunnskap og objektiv eksponering. Lag 2/3 celler var mer aktive sammenlignet med lag 5-celler på dagen da musen ble utsatt for et nytt objekt. Dette er også tydelig fra rasterplottene som viser terskelbrannaktiviteten til alle avbildede celler på dagene 1, 4 og 5. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/55579/55579fig1.jpg" /> Figur 1: In vivo Ca 2+ Imaging over flere kortiske lag i fritt bevegelige mus. ( A ) Prism sonde spesifikasjoner og avbildning av bildeplan. Det reflekterende belegget på innsiden av hypotenuse muliggjør avbildning 90 ° fra innsprøyningsplanet til prisme sonden. Linsen cuFf integreres med objektivholderen, som strømlinjerer implantasjonsprosedyren og muliggjør potensiell visning av fluorescens i omgivende vev under implantasjon ( B ) (i). Illustrasjon av plassering av prisme sonde kraniotomi og knivinnsnitt i forhold til virusinjeksjonsstedet, og (ii) illustrasjon av plassering av prisme sonde flat side i forhold til knivinnsnitt og virusinjeksjonssted. ( C ) Illustrasjon av in-vivo Ca 2+ -bildeoppsett som viser lysbanen for et lite område i hele synsfeltet gjennom prisme sonde implantert i musekortex. ( D ) Eksempelvis synsfelt under prismannsinstallasjon. Miniatyrmikroskop er festet til objektivholderen, som holder prisme-sonden mulig for å kontrollere virusuttrykket under prisme-sondeinstallasjonen. ( E ) Integrasjon av mikroskop med prisme sonde for multilag kortortisk avbildning av GCaMP6f merkede S1 celler. F Eksempelvis synsfeltUnder grunnplaten installasjon. Klar blodkar mønster er synlig på tidspunktet for grunnplaten installere med noen celler i råbilde. Flere celler er tydelig synlige når DF / F er slått på i oppkjøpsprogramvinduet. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55579/55579fig1large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/55579/55579fig2.jpg" /> Figur 2: Skjematisk Viser tidslinjen for arbeidsflythendelser for Prism Probe Implantation og Microscope Installasjon. Antall uker er representert på X-aksen og arbeidsflytstrinnene i prosedyrene langs Y-aksen. ( A ) Grafisk illustrerende viral injeksjon (AAV1.CaMKII.GCaMP6f.WPRE.SV40) langs samme dorso-ventral-akse, for å merke flere lag av musens somatosensory cortex. ( B ) 2 uker etter virusinjeksjoner, en prisme probE er implantert på en akse som er parallell med virusinjeksjonsstedene. ( C ) Omtrent en uke etter prisme-sondeimplantasjonen, er dyret sjekket for ekspresjon med mikroskopet og en grunnplate er montert på hodet hvis en populasjon av celler er synlig. ( D ) Dyret er så klar for kronisk avbildning under relevante oppførselsoppgaver (Museklipp, modifisert etter tillatelse fra UW-Madison Biochemistry MediaLab). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55579/55579fig2large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/55579/55579fig3.jpg" /> Figur 3: Postmortem Histologisk Validering av Prism Probe Location og GCaMP Expression. ( A ) Koronalseksjonen fra en representativ mushjerne som viser prismesystemet og med bildesiden vendt motGCaMP6f-uttrykkende celler (AAV1.CaMKII.GCaMP6f uttrykt i nevroner i lag 2/3 og 5). ( B ) Samme koronale hjerneseksjon etter farging for DAPI. Målestokk = 250 μm ( C ) Zoomet i lys av GCaMP6f uttrykker celler i somatosensorisk cortex. Skalbjelke = 100 μm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55579/55579fig3large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a> <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/55579/55579fig4.jpg" /> Figur 4: Musaktivitet under Habituation, Familiarization og Novel Object Exposure Testing ble sporet av video ved hjelp av videosoftware. ( A ) På dag 1 ble dyret plassert i en adferds arena uten noen gjenstander (Open Field). ( B ) På dagene 2-4 ble de samme to teksturelt forskjellige objektene (gelpute og treblokk) plassert i arenaen (Object Familiarization). ( C ) På dag 5 ble en av gjenstandene erstattet med en ny gjenstand (treblokk med sandpapir) (Novel Object Exposure). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55579/55579fig4large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a> <img alt="Figur 5" src="/files/ftp_upload/55579/55579fig5.jpg" /> Figur 5: Kalsiumdynamikk fra overfladiske og dype lag av somatosensorisk cortex fra en representativ mus som er avbildet med mikroskopet. ( A ) Fusjonert bilde av neuronal ruimtfiltre (grønne blokker) og gjennomsnittlig fluorescensintensitetsprojeksjon av mikroskopopptaket gjennom prisfrekvensfeltet. Border mellom supragranulære og infragranulære lag angitt med en hvit strekket linje. Skalbjelke = 100 μm. ( B ) Kalsiumspor fra fem eksempel overfladiske og dype lagceller (fylt blå og rødt cElls i panel A), som indikerer enheter av standardavvik for fluorescens etter hoved- og uavhengig komponentanalyse. Horisontal skala 50 s og vertikal skala 10 SD ( C ) Rasterplot av celler fra overflatiske (lag 2/3) og dype lag (lag 5) vist over Åpne felt, Objektkompetanse og Novel objektutforskning. Skalbjelke = 100 s. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55579/55579fig5large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Multi-layer Cortical Ca2+ Imaging in Freely Moving Mice with Prism Probes and Miniaturized Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Multi-layer Cortical Ca2+ Imaging in Freely Moving Mice with Prism Probes and Miniaturized Fluorescence Microscopy

Her presenterer vi en prosedyre for å utføre storskala Ca 2+ avbildning med cellulær oppløsning på tvers av flere kortikale lag i fritt bevegelige mus. Hundrevis av aktive celler kan observeres samtidig ved hjelp av et miniatyrhodet mikroskop kombinert med en implantert prisme sonde.

Multi-lag Cortical Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Imaging i fritt bevegelige mus med prismeprober og miniatyrisert fluorescensmikroskopi

In vivo circuit and cellular level functional imaging is a critical tool for understanding the brain in action. High resolution imaging of mouse cortical ...

Research

JoVE Journal

Behavior

Multi-layer Cortical Ca2+ Imaging in Freely Moving Mice with Prism Probes and Miniaturized Fluorescence Microscopy

Functional Magnetic Resonance Imaging (fMRI) with Auditory Stimulation in Songbirds

Functional Magnetic Resonance Imaging fMRI with Auditory Stimulation in Songbirds

Funksjonell Magnetic Resonance Imaging (fMRI) med auditiv stimulering i Songbirds

The neurobiology of birdsong, as a model for human speech, is a pronounced area of research in behavioral neuroscience. Whereas electrophysiology and ...

Long-term Potentiation of Perforant Pathway-dentate Gyrus Synapse in Freely Behaving Mice

Langsiktig Potensiering av Perforant Pathway-dentate gyrus Synapse i Fritt Oppfører Mus

Studies of long-term potentiation of synaptic efficacy, an activity-dependent synaptic phenomenon having properties that make it attractive as a potential ...

Two-photon Calcium Imaging in Mice Navigating a Virtual Reality Environment

To-foton Kalsium Imaging in Mice Navigere en Virtual Reality Environment

In recent years, two-photon imaging has become an invaluable tool in neuroscience, as it allows for chronic measurement of the activity of genetically ...

Quantitative Assessment of Cortical Auditory-tactile Processing in Children with Disabilities

Kvantitativ vurdering av Cortical Auditory-taktile Processing i barn med nedsatt funksjonsevne

Objective and easy measurement of sensory processing is extremely difficult in nonverbal or vulnerable pediatric patients. We developed a new methodology ...

Measurement of Fronto-limbic Activity Using an Emotional Oddball Task in Children with Familial High Risk for Schizophrenia

Måling av Fronto-limbiske aktivitet Bruke en emosjonell Oddball Task hos barn med familiær høy risiko for schizofreni

Adolescence is a critical developmental period where the early symptoms of schizophrenia frequently emerge. First-degree relatives of people with ...

Flat-floored Air-lifted Platform: A New Method for Combining Behavior with Microscopy or Electrophysiology on Awake Freely Moving Rodents

Flat-floored Air-løftet Platform: En ny metode for å kombinere Behavior med Mikros eller Elektro på Awake fritt bevegelige Gnagere

It is widely acknowledged that the use of general anesthetics can undermine the relevance of electrophysiological or microscopical data obtained from a ...

The Modified Hole Board - Measuring Behavior, Cognition and Social Interaction in Mice and Rats

Forandringer Hole Board - Måling Behavior, kognisjon og sosialt samspill i mus og rotter

This protocol describes the modified hole board (mHB), which combines features from a traditional hole board and open field and is designed to measure ...

Simultaneous Transcranial Alternating Current Stimulation and Functional Magnetic Resonance Imaging

Samtidig transcranial vekselstrømsstimulering og funksjonell magnetisk resonansimaging

Transcranial alternating current stimulation (tACS) is a promising tool for noninvasive investigation of brain oscillations. TACS employs ...

Reversible Cooling-induced Deactivations to Study Cortical Contributions to Obstacle Memory in the Walking Cat

Reversibel kjøling-indusert Deactivations å studere kortikale bidrag til hinder minne i gangavstand katten

On complex, naturalistic terrain, sensory information about an environmental obstacle can be used to rapidly adjust locomotor movements for avoidance. For ...

A Wireless, Bidirectional Interface for In Vivo Recording and Stimulation of Neural Activity in Freely Behaving Rats

A Wireless, Bidirectional Interface for In Vivo Recording and Stimulation of Neural Activity in Freely Behaving Rats

En trådløs, toveis grensesnitt for In Vivo -opptak og stimulering av nevrale aktivitet i fritt oppfører seg rotter

In vivo electrophysiology is a powerful technique to investigate the relationship between brain activity and behavior at a millisecond and micrometer ...