Name: multi-layer cortical ca2+ imaging in freely moving mice with prism probes and miniaturized fluorescence microscopy
Uploaded: 2017-06-13T12:30:00
Duration: 10 min 35 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multi-layer Cortical Ca2+ Imaging in Freely Moving Mice with Prism Probes and Miniaturized Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Os autores agradecem a V. Jayaraman, DS Kim, LL Looger e K. Svoboda do Projeto Indicador e Efeito Neuronal (GENIE) codificado genéticamente no Campus de Investigação Janelia do Instituto Médico Howard Hughes por sua generosa doação de AAV1-GCaMP6f Para o Núcleo do Vector da Universidade da Pensilvânia. Eles também gostariam de agradecer a A. Olson e Neuroscience Microscopy Core na Universidade de Stanford apoiada pelo NIH NS069375 para os seus serviços de microscopia confocal.

<ol>
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Vis. Exp. (30), (2009).</li><li>Chia, T. H., Levene, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microprisms+for+in+vivo+multilayer+cortical+imaging.">Microprisms for in vivo multilayer cortical imaging.</a> J. Neurophysiol. 102 (2), 1310-1314 (2009).</li><li>Chia, T. H., Levene, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-layer+in+vivo+imaging+of+neocortex+using+a+microprism.">Multi-layer in vivo imaging of neocortex using a microprism.</a> Cold Spring Harb. Protoc. 2010 (8), (2010).</li><li>Low, R. J., Gu, Y., Tank, D. 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Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq.</a> Science. 347 (6226), 1138-1142 (2015).</li><li>Hawrylycz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inferring+cortical+function+in+the+mouse+visual+system+through+large-scale+systems+neuroscience.">Inferring cortical function in the mouse visual system through large-scale systems neuroscience.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 113 (27), 7337-7344 (2016).</li><li>Petrof, I., Viaene, A. N., Sherman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+the+primary+somatosensory+cortex+projection+to+the+primary+motor+cortex+in+the+mouse.">Properties of the primary somatosensory cortex projection to the primary motor cortex in the mouse.</a> J. Neurophysiol. 113 (7), 2400-2407 (2015).</li><li>Aronoff, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-range+connectivity+of+mouse+primary+somatosensory+barrel+cortex.">Long-range connectivity of mouse primary somatosensory barrel cortex.</a> Euro. J. Neurosci. 31 (12), 2221-2233 (2010).</li><li>Rogan, S. C., Roth, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remote+control+of+neuronal+signaling.">Remote control of neuronal signaling.</a> Pharma. Rev. 63 (2), 291-315 (2011).</li><li>Berdyyeva, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zolpidem+reduces+hippocampal+neuronal+activity+in+freely+behaving+mice:+a+large+scale+calcium+imaging+study+with+miniaturized+fluorescence+microscope.">Zolpidem reduces hippocampal neuronal activity in freely behaving mice: a large scale calcium imaging study with miniaturized fluorescence microscope.</a> PloS One. 9 (11), e112068 (2014).</li></ol>

Os autores leram a política da revista e têm os seguintes interesses concorrentes: SG, SO e VC são funcionários remunerados da Inscopix.

Compreender a atividade do circuito neural durante o comportamento desperto é um nível vital de investigação neurocientífica necessária para efetivamente dissecar a função cerebral na saúde e na doença. O córtex é uma região particularmente importante para estudar no contexto do comportamento desperto, pois desempenha um papel importante em muitas funções sensoriais, cognitivas e executivas vitais 28 , 29 . A coluna cortical é pensada para ser a unidade funcional básica no córtex e a atividade de nível populacional de células corticais é conhecida por diferir com base em sua localização física dentro da coluna. Por exemplo, neurônios excitatórios nas camadas 2/3 no córtex somatossensorial, principalmente para outras regiões neocorticais e modulam outras redes corticais 30 , enquanto que as células em camadas mais profundas são projetadas principalmente para regiões subcorticais como o tálamo 31 . Gravando a atividade de cemS de células corticais pré-especificadas simultaneamente e de forma confiável ao longo do tempo em diferentes lâminas em indivíduos que se comportam livremente, avançarão muito nossa compreensão do fluxo de informação cortical, permitindo uma dissecação funcional mais fina de colunas corticais informadas por informações comportamentais em tempo real e tempo- Escalas. A coleta deste nível de dados do circuito neural é possível com o uso de uma plataforma de microscopia miniaturizada eficiente e racionalizada para conduzir imagens de Ca 2+ em larga escala em indivíduos que se comportam livremente (ou assuntos fixos de cabeça, conforme desejado). Usado com indicadores de cálcio codificados geneticamente para permitir a segmentação específica do tipo celular e imaginar um campo de visão de camada múltipla fornecido por uma sonda de prisma implantada cronicamente, este protocolo explorou um caso entre muitas aplicações possíveis: observando diferenças laminares no processamento cortical somatossensorial quando os ratos Fisicamente envolvido com um novo objeto ( Figura 5 ).Esta é a primeira ilustração processual desse tipo de abordagem específica do tipo celular, in vivo , para estudar múltiplas camadas corticais em animais acordados e de comportamento livre, e amplia o espectro de métodos experimentais disponíveis para compreender as estruturas laminares no cérebro ativo. O campo de visão periscopico habilitado pela sonda de prisma nesta técnica pode ser aplicado de forma viável a outras estruturas cerebrais quando a preservação do tecido diretamente dorsal para uma região de interesse é desejada; Por exemplo, a imagem CA3 pode ser alcançada sem interrupção da função do hipocampo. A abordagem baseada em sonda de prisma para imaginar a atividade de Ca 2 + requer a inserção física e implantação permanente de um microprisma no córtex, o que equivale à criação de uma lesão cortical onde a sonda da lente está inserida. Isso pode resultar em interrupções nos circuitos neurais locais, incluindo a separação de dendritos e processos apical. TSeu procedimento também causará uma ativação inicial das células gliais na região, embora isso seja esperado para ser localizado no tecido a cerca de 150 μm do rosto do prisma e para diminuir após o cérebro curar 22 . É muito importante considerar se esta técnica afetará a anatomia do circuito normal e / ou o comportamento dos animais ao planejar experimentos. Os grupos de controle comportamental devem sempre ser conduzidos para garantir que não haja alterações significativas nos comportamentos basais que possam produzir resultados experimentais confusos. A utilização desta técnica de imagem móvel miniaturais, Ca 2 + com manipulação neurofarmacológica, vários paradigmas comportamentais cognitivos, sociais, motores ou intrínsecos e combinando-a com outras métricas fisiológicas pode aprofundar e enriquecer os estudos focados na compreensão dos papéis funcionais dos circuitos neurais no comportamento e no sinal Processamento 32 . Supressão ou ativaçãoAção de certos caminhos modulados por drogas pode influenciar os comportamentos associados, que podem ser facilmente estudados usando esta tecnologia 33 . Ramificar para diferentes tipos de células, modificando a segmentação do indicador de cálcio é outra aplicação poderosa e útil, e permite muitas combinações criativas de ferramentas experimentais para abordar diversas questões do circuito neural.

O córtex é um jogador essencial em muitas funções mentais e comportamentais complexas, desde a atenção, a percepção sensorial e o controle cognitivo de cima para baixo 1 , 2 , 3 para vias de motivação, recompensa e dependência 4 , 5 . Compreender os processos computacionais subjacentes à sua função é um objetivo importante para melhorar a compreensão clínica de muitas doenças mentais e comportamentais. Muitas teorias atuais da doença psiquiátrica se centram na idéia de que a disfunção ou a discordância do circuito neural cortical podem estar subjacentes a anormalidades cognitivas e comportamentais que são características de condições como esquizofrenia 6 , autismo 7 ou transtorno obsessivo-compulsivo 8 . Assim, obtendo dados de atividade neural de nível populacional de coOs circuitos físicos dentro do contexto adequado da informação comportamental simultânea são de grande importância e, idealmente, podem ser direcionados a tipos de células específicos para uma dissecação mais fina do circuito neural. Os microscópios miniaturizados, em conjunto com microfilmes de índice de refração de gradiente implantável (GRIN) permitem o acesso óptico a conjuntos neuronais sob condições de movimento livre de uma diversidade de possíveis regiões cerebrais 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , incluindo o córtex 14 , 15 , 16 . O uso de um sistema de microscopia móvel acoplado com indicadores de cálcio codificados geneticamente permite uma imagem consistente da mesma população celular que engloba centenas de neurônios ao longo de dias a semanas em muitas regiões cerebrais 9 e pode serGeneticamente direcionados para tipos de células específicas usando vetores virais ou técnicas transgênicas. Como o córtex é conhecido por suportar diferentes funções e se conectar a regiões cerebrais diferentes dependendo da localização das células dentro da lâmina cortical 17 , 18 , 19 , estamos interessados ​​em obter atividade neural multi-camada simultânea em indivíduos com comportamentos acordados. Aqui, demonstramos como a imagem de centenas de neurônios marcados fluorescentemente em ratos que se comportam livremente ao longo de dias, usando o microscópio de fluorescência miniaturizado 20 emparelhado com uma sonda de prisma implantada, que oferece uma visão multicamada do córtex ( Figura 1 ). A sonda de prisma utilizada aqui é composta por duas lentes GRIN separadas: um prisma e uma lente de relé cilíndrica ( Figura 1 ). A luz do microscópio excita a etiqueta fluorescenteCélulas localizadas ao longo da face de imagem da sonda de prisma, após refletir a hipotenusa da porção de prisma da sonda. A luz emitida das células também se reflete na hipotenusa do prisma, é coletada através do objetivo do microscópio e atinge o sensor no microscópio. A sonda de prisma utilizada neste procedimento é adaptada para fácil utilização com equipamentos estereotáxicos padrão. O microscópio de fluorescência miniaturizado 20 detecta transientes de Ca 2+ evocados por potencial de ação em populações neuronais com resolução de célula única, depois que essas células foram especificamente marcadas com indicadores fluorescentes sensíveis a c2 + sensíveis a genes. Neste protocolo, injetamos o indicador de Ca 2+ codificado em um vetor viral (AAV1.CaMKII.GCaMP6f.WPRE.SV40), implantamos uma sonda de prisma, instalamos o microscópio e, em seguida, obtemos vários dias de dados da atividade neuronal somatossensorial (membro do membro traseiro S1) De uma exposição animalD para novas superfícies de objetos durante a exploração livre ( Figura 2 ).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Neurostar Motorized 
			Ultra Precise Small Animal Stereotaxic Instrument</td>
			<td>Kopf</td>
			<td>Model 963SD</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereoscope</td>
			<td>Labomed</td>
			<td>Prima DNT</td>
			<td>Surgery and Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Rectal Thermistor Probe (.062&#34;/1.6mm diameter) - 1/4&#34; Jack</td>
			<td>FHC</td>
			<td>40-90-5D-02</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating Pad 5 X 12.5cm&#160;</td>
			<td>FHC</td>
			<td>40-90-2-07</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC Temperature Controller</td>
			<td>FHC</td>
			<td>40-90-8D</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsyringe Pump</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>UMP3 model; serial 155788 F110</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoFil 10&#956;L Syringe</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>NANOFIL</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 G Beveled Tip Nanofil NDL 2PK</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>NF35BV-2</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omnidrill35, 115-230V</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>503598</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Burrs for Micro Drill</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>19007-05</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nVista</td>
			<td>Inscopix</td>
			<td>100-001048</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV1.CaMKII.GCaMP6f.WPRE.SV40</td>
			<td>Penn Vector Core</td>
			<td>AV-1-PV3435</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketoprofen</td>
			<td>Victor Medical</td>
			<td>5487</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carprofen</td>
			<td>Victor Medical</td>
			<td>1699008&#160;</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Victor Medical</td>
			<td>1001054</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelfoam (Patterson Veterinary Supply Inc Gelfoam Sponge 12cmx7mm)</td>
			<td>Pfizer (Fisher Scientific)</td>
			<td>NC9841478</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5/45 forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-35</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-30</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting knives</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10055-12</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProView Implant Kit</td>
			<td>Inscopix</td>
			<td>100-000756</td>
			<td>Surgery and Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProView Prism Probe 1.0mm-Dia. ~4.3mm Length</td>
			<td>Inscopix</td>
			<td>100-000592</td>
			<td>Surgery and Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kwik-Sil adhesive pack of 2</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>KWIK-SIL</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kwik-Cast Sealant</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>KWIK-CAST</td>
			<td>Surgery and Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniature Optical Mounting Post</td>
			<td>Newport</td>
			<td>M-TSP-3</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Baseplate</td>
			<td>Inscopix</td>
			<td>BPL-2</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Baseplate Cover</td>
			<td>Inscopix</td>
			<td>BPC-2</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multi-layer cortical ca2+ imaging in freely moving mice with prism probes and miniaturized fluorescence microscopy

O circuito in vivo e a imagem funcional de nível celular é uma ferramenta crítica para a compreensão do cérebro em ação. A imagem em alta resolução de neurônios corticais de mouse com microscopia de dois fótons forneceu informações únicas sobre estrutura cortical, função e plasticidade. No entanto, esses estudos são limitados aos animais fixos de cabeça, reduzindo grandemente a complexidade comportamental disponível para estudo. Neste artigo, descrevemos um procedimento para a realização de microscopia de fluorescência crônica com resolução celular em múltiplas camadas corticais em ratos de comportamento livre. Utilizamos um microscópio de fluorescência miniaturizado integrado emparelhado com uma sonda de prisma implantada para visualizar simultaneamente e registrar a dinâmica de cálcio de centenas de neurônios em várias camadas do córtex somatossensorial, enquanto o mouse se envolveu em uma nova tarefa de exploração de objetos em vários dias. Esta técnica pode ser adaptada a outras regiões do cérebro em diferentes espécies animais para outros comportamentos pAradigmas.

O protocolo descrito aqui descreve uma maneira efetiva e eficiente de realizar imagens longitudinais de Ca 2+ de várias camadas a partir de centenas de neurônios corticais em ratos de comportamento livre usando sondas de prisma ( Figura 1 ). As abordagens anteriores para a imagem cortical de várias camadas foram primariamente restritas aos animais fixos de cabeça 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 . Para adquirir esse nível de dados em um contexto de comportamento livre, utilizou-se uma plataforma de microscópio miniaturizado para flexibilidade comportamental; Um indicador de cálcio codificado geneticamente (GCaMP6f) foi usado para atingir uma população celular específica (células CAMKII + no córtex); E uma sonda de prisma foi escolhida para fornecer um campo de visão crônico e multicamadas. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; Demonstrou o fluxo de trabalho para a preparação do animal para imagens. Um vetor viral que codifica um indicador de cálcio apropriado foi injetado no córtex ( Figura 2 , Etapa 1), antes de implantar cronicamente uma sonda de prisma para habilitar o acesso óptico às células rotuladas ( Figura 2 , Etapa 2). Uma placa de base que serve como uma doca segura e temporária para o posicionamento do microscópio durante as sessões de imagem foi então instalada sobre a cabeça do animal ( Figura 2 , Etapa 3), permitindo a visualização da atividade cortical em múltiplas camadas de células em um experimento de comportamento acordado Configuração ( Figura 2 , Etapa 4). Para assegurar que a população celular desejada estivesse sendo alvo, uma seção de cérebro coronal pós mortem de um mouse representativo é mostrada na Figura 3 com o traço da sonda do prisma e o campo de visão marcado em relação ao laboratório GCaMP6fNeurônios em camadas 2/3 e 5 do córtex somatossensorial. Durante a imagem de comportamento acordado com o sistema, a atividade dos neurônios corticais somatossensoriais foi registrada quando o mouse foi exposto a três ambientes diferentes: Campo aberto (Dia 1), Familiarização com Objetos (Dia 2-4) e Objeto Novo (Dia 5) ( Figura 4 ). No dia 1, o mouse foi colocado em uma arena comportamental desprovida de qualquer objeto. No dia 2-4, o mouse foi colocado na arena com os mesmos dois objetos texturalmente diferentes (um bloco de gel e um bloco de madeira). No dia 5, um dos objetos foi substituído por um novo objeto. O animal foi fotografado em 5 dias por 20 minutos por dia. Após a extração celular usando o software de análise de dados de imagem do Ca 2+ , os filtros espaciais correspondentes aos locais das células foram sobrepostos na projeção de intensidade fluorescente média dos dados de gravação do microscópio( Figura 5) . Uma linha tracejada branca separa camadas 2/3 e 5 células. Os traços correspondentes de Ca 2+ de 5 células de cada uma das camadas mostram o padrão de disparo das células em dois contextos comportamentais diferentes: Object Familiarization e Novel Object Exposure. As células da camada 2/3 foram mais ativas em comparação com as células da camada 5 no dia em que o mouse foi exposto a um novo objeto. Isso também é evidente a partir das parcelas de quadriciclo que mostram a atividade de disparo limiar de todas as células fotográficas nos dias 1, 4 e 5. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/55579/55579fig1.jpg" /> Figura 1: In Vivo Ca 2 + Imaging através de múltiplas camadas corticais em ratos de movimento livre. ( A ) Especificações da sonda prisma e representação do plano de imagem. O revestimento reflexivo no interior da hipotenusa permite a formação de imagens de 90 ° a partir do plano de inserção da sonda prisma. O cuFf integra-se com o suporte da lente, que agiliza o procedimento de implantação e permite a visualização potencial da fluorescência do tecido ambiente durante a implantação ( B ) (i). Ilustração da colocação de craniotomia de sonda de prisma e incisão de faca em relação ao local de injeção de vírus, e (ii) ilustração da localização do lado plano da sonda de prisma em relação à incisão de faca e ao local de injeção de vírus. ( C ) Ilustração da instalação de imagem Ca 2+ in vivo mostrando o caminho da luz para uma pequena área dentro do campo de visão completo através da sonda de prisma implantada no córtex do mouse. ( D ) Exemplo de campo de visão durante a instalação da sonda prisma. O microscópio em miniatura está ligado ao suporte da lente, que contém a sonda de prisma permitindo verificar a expressão do vírus durante a instalação da sonda de prisma. ( E ) Integração de microscópio com sonda de prisma para imagens corticais de várias camadas de células S1 marcadas com GCaMP6f. F Exemplo de campo de visãoDurante a instalação da placa base. O padrão de vasos sanguíneos claros é visível no momento da instalação da placa base com algumas células na imagem em bruto. Mais células são claramente visíveis quando DF / F é ativado na janela do software de aquisição. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55579/55579fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/55579/55579fig2.jpg" /> Figura 2: Esquema mostrando o cronograma dos eventos de fluxo de trabalho para implantação de implante de prisma e instalação de microscópio. O número de semanas é representado no eixo X e as etapas do fluxo de trabalho dos procedimentos ao longo do eixo Y. ( A ) Gráfico ilustrando a injeção viral (AAV1.CaMKII.GCaMP6f.WPRE.SV40) ao longo do mesmo eixo dorso-ventral, para rotular várias camadas do córtex somatossensorial do mouse. ( B ) 2 semanas após injeções de vírus, um problema de prismaE é implantado em um eixo paralelo aos sites de injeção de vírus. ( C ) Aproximadamente uma semana após a implantação da sonda do prisma, o animal é verificado para a expressão com o microscópio e uma placa de base é montada na cabeça se uma população de células estiver visível. ( D ) O animal está pronto para imagens crônicas durante tarefas comportamentais relevantes (clip art do mouse modificado após permissão de UW-Madison Biochemistry MediaLab). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55579/55579fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/55579/55579fig3.jpg" /> Figura 3: Validação histológica pós-mortem da localização da sonda prisma e expressão GCaMP. ( A ) Seção Coronal de um cérebro de mouse representativo que mostra o traço da sonda do prisma e com o lado da imagem voltadaAs células que expressam GCaMP6f (AAV1.CaMKII.GCaMP6f expressadas nos neurônios nas camadas 2/3 e 5). ( B ) Mesma seção do coração coronal após a coloração para DAPI. Barra de escala = 250 μm ( C ) Zoomed vista de GCaMP6f expressando células no córtex somatossensorial. Barra de escala = 100 μm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55579/55579fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/55579/55579fig4.jpg" /> Figura 4: A atividade do mouse durante a habituação, a familiarização e o teste de exposição de objetos novos foram rastreados por vídeo usando o software de vídeo. ( A ) No dia 1, o animal foi colocado em uma arena comportamental desprovida de qualquer objeto (campo aberto). ( B ) Nos dias 2-4, os mesmos dois objetos texturizados diferentes (gel pad e bloco de madeira) foram colocados na arena (Object FamiLiarização). ( C ) No dia 5, um dos objetos foi substituído por um novo objeto (bloco de madeira com papel de areia) (Novel Object Exposure). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55579/55579fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/55579/55579fig5.jpg" /> Figura 5: Dinâmica do cálcio de camadas superficiais e profundas do córtex somatossensorial de um mouse representado com o Microscópio. ( A ) Imagem mesclada de filtros espaciais neuronais (bolhas verdes) e projeção média de intensidade de fluorescência da gravação do microscópio através do campo de visão da sonda prisma. Borda entre camadas supragranular e infragranular indicadas por uma linha tracejada branca. Barra de escala = 100 μm. ( B ) Traços de cálcio de cinco exemplos de células superficiais e de camada profunda (cheio azul e vermelho cElls no painel A), indicando unidades de desvio padrão de fluorescência após análise de componente principal e independente. Barra de escala horizontal 50 s e barra de escala vertical 10 SD ( C ) Raster parcela de células de camadas superficiais (camadas 2/3) e profundas (camada 5) mostradas em campo aberto, Familiarização de objetos e exploração de novo objeto. Barra de escala = 100 s. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55579/55579fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Multi-layer Cortical Ca2+ Imaging in Freely Moving Mice with Prism Probes and Miniaturized Fluorescence Microscopy

Aqui, apresentamos um procedimento para a realização de imagens de Ca 2 + em larga escala com resolução celular em múltiplas camadas corticais em camundongos que se movem livremente. Centenas de células ativas podem ser observadas simultaneamente usando um microscópio em miniatura montado na cabeça acoplado com uma sonda de prisma implantada.

Multi-layer Cortical Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Imaging em ratos com movimento livre com sondas de prisma e microscopia de fluorescência miniaturizada

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