Name: multi-layer cortical ca2+ imaging in freely moving mice with prism probes and miniaturized fluorescence microscopy
Uploaded: 2017-06-13T12:30:00
Duration: 10 min 35 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multi-layer Cortical Ca2+ Imaging in Freely Moving Mice with Prism Probes and Miniaturized Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Авторы хотели бы поблагодарить В. Джаярамана, Д. С. Кима, Л. Л. Логера и К. Свободы из проекта Генетически кодированного нейронального индикатора и эффектора (GENIE) в Исследовательском кампусе Джанелии Медицинского института Говарда Хьюза за их щедрое пожертвование AAV1-GCaMP6f В Университет штата Пенсильвания. Они также хотели бы поблагодарить ядро ​​A. Olson и Neuroscience Microscopy Core в Стэнфордском университете, поддерживаемое грантом NIH NS069375 для своих услуг конфокальной микроскопии.

<ol>
	<li>McConnell, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+decision-making+in+the+mammalian+cerebral+cortex.">Development and decision-making in the mammalian cerebral cortex.</a> Brain Res. 472 (1), 1-23 (1988).</li><li>Kwon, S. E., Yang, H., Minamisawa, G., O'Connor, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensory+and+decision-related+activity+propagate+in+a+cortical+feedback+loop+during+touch+perception.">Sensory and decision-related activity propagate in a cortical feedback loop during touch perception.</a> Nat. Neurosci. 19 (9), 1243-1249 (2016).</li><li>Miller, E. K., Cohen, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrative+theory+of+prefrontal+cortex+function.">An integrative theory of prefrontal cortex function.</a> Annu. Rev. Neurosci. 24, 167-202 (2001).</li><li>Bailey, M. R., Simpson, E. H., Balsam, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+substrates+underlying+effort,+time,+and+risk-based+decision+making+in+motivated+behavior.">Neural substrates underlying effort, time, and risk-based decision making in motivated behavior.</a> Neurobiol. Learn. Mem. 133, 233-256 (2016).</li><li>Dehaene, S., Changeux, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reward-dependent+learning+in+neuronal+networks+for+planning+and+decision+making.">Reward-dependent learning in neuronal networks for planning and decision making.</a> Prog. Brain Res. 126, 217-229 (2000).</li><li>Ferenczi, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prefrontal+cortical+regulation+of+brainwide+circuit+dynamics+and+reward-related+behavior.">Prefrontal cortical regulation of brainwide circuit dynamics and reward-related behavior.</a> Science. 351 (6268), aac9698 (2016).</li><li>Anomal, R. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+Processing+in+the+Primary+Auditory+Cortex+of+an+Animal+Model+of+Autism.">Impaired Processing in the Primary Auditory Cortex of an Animal Model of Autism.</a> Front. Sys. Neurosci. 9, 158 (2015).</li><li>Pauls, D. L., Abramovitch, A., Rauch, S. L., Geller, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obsessive-compulsive+disorder:+an+integrative+genetic+and+neurobiological+perspective.">Obsessive-compulsive disorder: an integrative genetic and neurobiological perspective.</a> Nat. Rev. Neurosci. 15 (6), 410-424 (2014).</li><li>Ziv, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+dynamics+of+CA1+hippocampal+place+codes.">Long-term dynamics of CA1 hippocampal place codes.</a> Nat. Neurosci. 16 (3), 264-266 (2013).</li><li>Jennings, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+hypothalamic+network+dynamics+for+appetitive+and+consummatory+behaviors.">Visualizing hypothalamic network dynamics for appetitive and consummatory behaviors.</a> Cell. 160 (3), 516-527 (2015).</li><li>Betley, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurons+for+hunger+and+thirst+transmit+a+negative-valence+teaching+signal.">Neurons for hunger and thirst transmit a negative-valence teaching signal.</a> Nature. 521 (7551), 180-185 (2015).</li><li>Sun, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+speed+dependence+of+entorhinal+island+and+ocean+cells,+including+respective+grid+cells.">Distinct speed dependence of entorhinal island and ocean cells, including respective grid cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 112 (30), 9466-9471 (2015).</li><li>Kitamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entorhinal+Cortical+Ocean+Cells+Encode+Specific+Contexts+and+Drive+Context-Specific+Fear+Memory.">Entorhinal Cortical Ocean Cells Encode Specific Contexts and Drive Context-Specific Fear Memory.</a> Neuron. 87 (6), 1317-1331 (2015).</li><li>Pinto, L., Dan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-Type-Specific+Activity+in+Prefrontal+Cortex+during+Goal-Directed+Behavior.">Cell-Type-Specific Activity in Prefrontal Cortex during Goal-Directed Behavior.</a> Neuron. 87 (2), 437-450 (2015).</li><li>Cox, J., Pinto, L., Dan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+imaging+of+sleep-wake+related+neuronal+activity+in+the+dorsal+pons.">Calcium imaging of sleep-wake related neuronal activity in the dorsal pons.</a> Nat. Comm. 7, 10763 (2016).</li><li>Resendez, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+cortical,+subcortical+and+deep+brain+neural+circuit+dynamics+during+naturalistic+mammalian+behavior+with+head-mounted+microscopes+and+chronically+implanted+lenses.">Visualization of cortical, subcortical and deep brain neural circuit dynamics during naturalistic mammalian behavior with head-mounted microscopes and chronically implanted lenses.</a> Nat. Protoc. 11 (3), 566-597 (2016).</li><li>Hooks, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+cortical+and+thalamic+input+to+pyramidal+neurons+in+mouse+motor+cortex.">Organization of cortical and thalamic input to pyramidal neurons in mouse motor cortex.</a> The J. Neurosci. 33 (2), 748-760 (2013).</li><li>Masamizu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+distinct+layer-specific+dynamics+of+cortical+ensembles+during+learning+of+a+motor+task.">Two distinct layer-specific dynamics of cortical ensembles during learning of a motor task.</a> Nat. Neurosci. 17 (7), 987-994 (2014).</li><li>Rowland, D. C., Moser, M. -. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+cortical+modules+to+memories.">From cortical modules to memories.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 24 (1), 22-27 (2014).</li><li>Ghosh, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Miniaturized+integration+of+a+fluorescence+microscope.">Miniaturized integration of a fluorescence microscope.</a> Nat. Methods. 8 (10), 871-878 (2011).</li><li>Mukamel, E. A., Nimmerjahn, A., Schnitzer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+analysis+of+cellular+signals+from+large-scale+calcium+imaging+data.">Automated analysis of cellular signals from large-scale calcium imaging data.</a> Neuron. 63 (6), 747-760 (2009).</li><li>Andermann, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+cellular+imaging+of+entire+cortical+columns+in+awake+mice+using+microprisms.">Chronic cellular imaging of entire cortical columns in awake mice using microprisms.</a> Neuron. 80 (4), 900-913 (2013).</li><li>Goldey, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removable+cranial+windows+for+long-term+imaging+in+awake+mice.">Removable cranial windows for long-term imaging in awake mice.</a> Nat. Protoc. 9 (11), 2515-2538 (2014).</li><li>Chia, T. H., Levene, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+deep+cortical+layers+using+a+microprism.">In vivo imaging of deep cortical layers using a microprism.</a> J. Vis. Exp. (30), (2009).</li><li>Chia, T. H., Levene, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microprisms+for+in+vivo+multilayer+cortical+imaging.">Microprisms for in vivo multilayer cortical imaging.</a> J. Neurophysiol. 102 (2), 1310-1314 (2009).</li><li>Chia, T. H., Levene, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-layer+in+vivo+imaging+of+neocortex+using+a+microprism.">Multi-layer in vivo imaging of neocortex using a microprism.</a> Cold Spring Harb. Protoc. 2010 (8), (2010).</li><li>Low, R. J., Gu, Y., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+resolution+optical+access+to+brain+regions+in+fissures:+imaging+medial+prefrontal+cortex+and+grid+cells+in+entorhinal+cortex.">Cellular resolution optical access to brain regions in fissures: imaging medial prefrontal cortex and grid cells in entorhinal cortex.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 111 (52), 18739-18744 (2014).</li><li>Zeisel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+structure.+Cell+types+in+the+mouse+cortex+and+hippocampus+revealed+by+single-cell+RNA-seq.">Brain structure. Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq.</a> Science. 347 (6226), 1138-1142 (2015).</li><li>Hawrylycz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inferring+cortical+function+in+the+mouse+visual+system+through+large-scale+systems+neuroscience.">Inferring cortical function in the mouse visual system through large-scale systems neuroscience.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 113 (27), 7337-7344 (2016).</li><li>Petrof, I., Viaene, A. N., Sherman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+the+primary+somatosensory+cortex+projection+to+the+primary+motor+cortex+in+the+mouse.">Properties of the primary somatosensory cortex projection to the primary motor cortex in the mouse.</a> J. Neurophysiol. 113 (7), 2400-2407 (2015).</li><li>Aronoff, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-range+connectivity+of+mouse+primary+somatosensory+barrel+cortex.">Long-range connectivity of mouse primary somatosensory barrel cortex.</a> Euro. J. Neurosci. 31 (12), 2221-2233 (2010).</li><li>Rogan, S. C., Roth, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remote+control+of+neuronal+signaling.">Remote control of neuronal signaling.</a> Pharma. Rev. 63 (2), 291-315 (2011).</li><li>Berdyyeva, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zolpidem+reduces+hippocampal+neuronal+activity+in+freely+behaving+mice:+a+large+scale+calcium+imaging+study+with+miniaturized+fluorescence+microscope.">Zolpidem reduces hippocampal neuronal activity in freely behaving mice: a large scale calcium imaging study with miniaturized fluorescence microscope.</a> PloS One. 9 (11), e112068 (2014).</li></ol>

Авторы читают политику журнала и имеют следующие конкурирующие интересы: SG, SO и VC оплачиваются сотрудниками Inscopix.

Понимание активности нервного цикла во время бодрствования является жизненно важным уровнем нейрофизиологического исследования, необходимого для эффективного рассечения функции мозга в области здоровья и болезней. Кора является особенно важным регионом для изучения в контексте бодрствующего поведения, поскольку она играет важную роль во многих жизненно важных сенсорных, когнитивных и исполнительных функциях 28 , 29 . Известно, что кортикальная колонна является основной функциональной единицей в коре и активность клеточных клеток на уровне популяции, как известно, различается в зависимости от их физического расположения внутри столбца. Например, возбуждающие нейроны в слоях 2/3 в соматосенсорной коре представляют собой проекты в основном в других новоорцитарных областях и модулируют другие корковые сети 30 , тогда как клетки в более глубоких слоях выступают в основном в подкорковые области, такие как таламус 31 . Запись деятельности сотенС заранее определенных кортикальных клеток одновременно и надежно с течением времени на разных ламинах в свободно ведящих субъектах значительно продвигало бы наше понимание потока информации о коры, позволяя более тонкое функциональное рассечение кортикальных столбцов, информированное о поведенческой информации в реальном времени, Весы. Сбор этого уровня данных нейронных цепей стал возможным благодаря использованию эффективной и упрощенной миниатюрной микроскопической платформы для проведения крупномасштабной визуализации Ca 2+ в свободно ведящих субъектах (или по желанию головок). Используемый с генетически закодированными индикаторами кальция для обеспечения специфического таргетинга сотового типа и визуализации многослойного поля зрения, предоставляемого хронически имплантированным призменным зондом, этот протокол исследовал один случай среди многих возможных применений: наблюдение ламинарных различий в обработке соматосенсорной коры при мышах Физически связан с новым объектом ( рис. 5 ).Это первая процедурная иллюстрация такого типа специфического клеточного типа, in vivo, для изучения множественных корковых слоев у бодрствующих, свободно ведящих животных и расширения спектра экспериментальных методов, доступных для понимания ламинарных структур в активном мозге. Перископическое поле зрения, обеспечиваемое зондом призмы в этом методе, может быть применимо к другим структурам мозга, когда желательно сохранение ткани непосредственно дорсальной области интереса; Например, изображение CA3 может быть достигнуто без нарушения функции гиппокампа. Подход, основанный на призме, для визуализации активности Ca 2+, требует физической инсерции и постоянной имплантации микропризма в кору, что приравнивается к созданию кортикального поражения, в которое вставлен линзовый зонд. Это может привести к сбоям в локальной нейронной схеме, включая отрыв апикальных дендритов и процессов. TЕго процедура также вызовет первоначальную активацию глиальных клеток в области, хотя ожидается, что она будет локализована в ткани около 150 мкм от поверхности призмы и исчезнет после заживления мозга 22 . Очень важно учитывать, повлияет ли этот метод на нормальную анатомию схемы и / или поведение животных при планировании экспериментов. Группы поведенческого контроля должны всегда проводиться для обеспечения того, чтобы не было существенных изменений в базовом поведении, которое могло бы привести к смешению экспериментальных результатов. Используя этот миниатюрный мобильный метод Ca 2+ с нейрофармакологической манипуляцией, различные когнитивные, социальные, моторные или внутренние поведенческие парадигмы и сочетая его с другими физиологическими метриками, могут углубить и обогатить исследования, направленные на понимание функциональных ролей нейронных цепей в поведении и сигнале Обработка 32 . Подавление или активизацияВоздействие определенных путей, модулированных лекарственными средствами, может влиять на связанные с ними поведения, которые можно легко изучить с использованием этой технологии. 33 . Разделение на разные типы клеток путем изменения нацеливания индикатора кальция является еще одним мощным и полезным приложением и позволяет использовать множество творческих комбинаций экспериментальных инструментов для решения разнообразных проблем нервной цепи.

Кора является существенным игроком во многих сложных ментальных и поведенческих функциях, от внимания, сенсорного восприятия и нисходящего когнитивного контроля 1 , 2 , 3 до мотивационных, поощрительных и наркотических путей 4 , 5 . Понимание вычислительных процессов, лежащих в основе его функции, является важной задачей для лучшего клинического понимания многих психических и поведенческих расстройств. Многие современные теории психиатрической болезни сосредотачиваются вокруг идеи о том, что дисфункция коры головного нерва или диссоординация могут лежать в основе когнитивных и поведенческих аномалий, которые являются отличительными чертами таких состояний, как шизофрения 6 , аутизм 7 или обсессивно-компульсивное расстройство. Таким образом, получение данных о нейральной активности населенияВ правильном контексте одновременной поведенческой информации имеет большое значение и в идеале может быть нацелена на конкретные типы клеток для более тонкой диссекции нейронных схем. Миниатюрные микроскопы в сочетании с микролинзами с имплантируемым градиентным показателем преломления (GRIN) обеспечивают оптический доступ к нейронным ансамблям в условиях свободного перемещения из разнообразных возможных областей мозга 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , включая кору 14 , 15 , 16 . Использование мобильной микроскопии в сочетании с генетически кодированными индикаторами кальция позволяет обеспечить последовательную визуализацию той же клеточной популяции, охватывающей сотни нейронов, в течение нескольких дней до нескольких недель во многих областях мозга 9 , и может бытьГенетически ориентированных на конкретные типы клеток с использованием вирусного вектора или трансгенных методов. Поскольку известно, что кора поддерживает различные функции и соединяется с различными областями мозга в зависимости от местоположения клеток внутри кортикальной пластинки 17 , 18 , 19 , нас интересует одновременная многослойная нейронная активность у бодрствующих субъектов. Здесь мы демонстрируем, как фотографировать сотни флуоресцентно меченых нейронов у свободнодействующих мышей в течение нескольких дней, используя миниатюрный флуоресцентный микроскоп 20, соединенный с имплантированным призменным зондом, который предлагает многослойный вид коры ( рис. 1 ). Используемый здесь призменный зонд состоит из двух отдельных линз GRIN: призмы и цилиндрического релейного объектива ( рис. 1 ). Свет микроскопа возбуждает флуоресцентно маркированныйЯчейки, расположенные вдоль поверхности изображения зонда призмы, после отражения от гипотенузы призменной части зонда. Испускаемый свет из клеток также отражает от гипотенузы призмы, собирается через объектив микроскопа и достигает датчика в микроскопе. Призматический зонд, используемый в этой процедуре, предназначен для легкого использования со стандартным стереотаксическим оборудованием. Миниатюрный флуоресцентный микроскоп 20 обнаруживает переходные процессы Ca 2+ с потенциально вызванным потенциалом в популяциях нейронов с разрешением одной клетки, после того как эти клетки были специально маркированы чувствительными к Ca 2+ генетически закодированными флуоресцентными индикаторами. В этом протоколе мы вводим индикатор Ca 2+, закодированный в вирусном векторе (AAV1.CaMKII.GCaMP6f.WPRE.SV40), внедряем зонд призмы, устанавливаем микроскоп, затем получаем несколько дней соматосенсорных (S1 задних конечностей) данных о нейральной активности От животного выставлятьD к новым поверхностям объекта во время свободной разведки ( рис. 2 ).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Neurostar Motorized 
			Ultra Precise Small Animal Stereotaxic Instrument</td>
			<td>Kopf</td>
			<td>Model 963SD</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereoscope</td>
			<td>Labomed</td>
			<td>Prima DNT</td>
			<td>Surgery and Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Rectal Thermistor Probe (.062&#34;/1.6mm diameter) - 1/4&#34; Jack</td>
			<td>FHC</td>
			<td>40-90-5D-02</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating Pad 5 X 12.5cm&#160;</td>
			<td>FHC</td>
			<td>40-90-2-07</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC Temperature Controller</td>
			<td>FHC</td>
			<td>40-90-8D</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsyringe Pump</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>UMP3 model; serial 155788 F110</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoFil 10&#956;L Syringe</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>NANOFIL</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 G Beveled Tip Nanofil NDL 2PK</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>NF35BV-2</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omnidrill35, 115-230V</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>503598</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Burrs for Micro Drill</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>19007-05</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nVista</td>
			<td>Inscopix</td>
			<td>100-001048</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV1.CaMKII.GCaMP6f.WPRE.SV40</td>
			<td>Penn Vector Core</td>
			<td>AV-1-PV3435</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketoprofen</td>
			<td>Victor Medical</td>
			<td>5487</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carprofen</td>
			<td>Victor Medical</td>
			<td>1699008&#160;</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Victor Medical</td>
			<td>1001054</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelfoam (Patterson Veterinary Supply Inc Gelfoam Sponge 12cmx7mm)</td>
			<td>Pfizer (Fisher Scientific)</td>
			<td>NC9841478</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5/45 forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-35</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-30</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting knives</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10055-12</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProView Implant Kit</td>
			<td>Inscopix</td>
			<td>100-000756</td>
			<td>Surgery and Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProView Prism Probe 1.0mm-Dia. ~4.3mm Length</td>
			<td>Inscopix</td>
			<td>100-000592</td>
			<td>Surgery and Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kwik-Sil adhesive pack of 2</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>KWIK-SIL</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kwik-Cast Sealant</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>KWIK-CAST</td>
			<td>Surgery and Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniature Optical Mounting Post</td>
			<td>Newport</td>
			<td>M-TSP-3</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Baseplate</td>
			<td>Inscopix</td>
			<td>BPL-2</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Baseplate Cover</td>
			<td>Inscopix</td>
			<td>BPC-2</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multi-layer cortical ca2+ imaging in freely moving mice with prism probes and miniaturized fluorescence microscopy

Функциональная визуализация in vivo и клеточного уровня - важный инструмент для понимания мозга в действии. Высокое разрешение изображений кортикальных нейронов мыши с двухфотонной микроскопией обеспечило уникальную информацию о структуре, функции и пластичности коры. Однако эти исследования ограничены головными животными, значительно уменьшающими сложность поведения, доступную для изучения. В этой статье мы описываем процедуру для проведения хронической флуоресцентной микроскопии с клеточным разрешением через несколько корковых слоев у свободнодействующих мышей. Мы использовали интегрированный миниатюрный флуоресцентный микроскоп, соединенный с имплантированным зондом призмы, чтобы одновременно визуализировать и регистрировать динамику кальция сотен нейронов на нескольких слоях соматосенсорной коры, поскольку мышь занималась новой задачей исследования объектов в течение нескольких дней. Этот метод можно адаптировать к другим областям мозга у разных видов животных для других поведенческих paradigms.

Описанный здесь протокол описывает эффективный и эффективный способ получения продольных многослойных изображений Ca 2+ из сотен кортикальных нейронов у свободнодействующих мышей с использованием призменных зондов ( рис. 1 ). Предыдущие подходы к многослойной кортикальной визуализации в основном были ограничены головными неподвижными животными 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 . Чтобы получить этот уровень данных в контексте свободного поведения, для гибкости поведения использовалась миниатюрная платформа микроскопа; Для целей специфической популяции клеток (CAMKII + клетки в коре) использовали генно-кодированный индикатор кальция (GCaMP6f); И зонд призмы был выбран для обеспечения хронического многослойного поля зрения. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; Мы продемонстрировали рабочий процесс для подготовки животного к визуализации. Вирусный вектор, кодирующий соответствующий индикатор кальция, вводили в кору ( рис. 2 , стадия 1) перед тем, как хронически имплантировать призменный зонд, чтобы обеспечить оптический доступ к меченым клеткам ( рис. 2 , стадия 2). Базовая плита, которая служит в качестве безопасной временной док-станции для позиционирования микроскопа во время сеансов визуализации, затем была установлена ​​над головой животного ( рис. 2 , стадия 3), что позволило визуализировать активность коры на нескольких клеточных слоях при активном эксперименте ( Рисунок 2 , шаг 4). Для обеспечения того, чтобы целевая клеточная популяция подвергалась таргетированию, на третьем рисунке показана отскок корональной части мозга от типичной мыши с участком зонда призмы и поле зрения, отмеченным относительно лаборатории GCaMP6fЭлюированных нейронов в слоях 2/3 и 5 соматосенсорной коры. Во время бодрствования при визуализации с системой активность соматосенсорных кортикальных нейронов регистрировалась, когда мышь подвергалась воздействию трех разных сред: открытое поле (день 1), обследование объектов (день 2-4) и новый объект (день 5) ( Рисунок 4 ). В первый день мышь была помещена в поведенческую арену, лишенную каких-либо предметов. В День 2-4 мышь была помещена на арену с теми же двумя текстурно разными объектами (гелевая подушка и деревянный блок). В День 5 один из объектов был заменен новым объектом. Животное отображали через 5 дней в течение 20 минут каждый день. После извлечения клеток с использованием программного обеспечения для анализа данных изображения Ca 2+ пространственные фильтры, соответствующие ячейкам, были наложены на среднюю проекцию интенсивности флуоресценции данных записи микроскопа( Рисунок 5) . Белая пунктирная линия разделяет слои 2/3 и 5 ячеек. Соответствующие следы Ca 2+ из 5 ячеек из каждого из слоев показывают схему обжига клеток в двух разных поведенческих контекстах: обследование объекта и экспозиция нового объекта. Клетки уровня 2/3 были более активными по сравнению с клетками 5-го уровня в тот день, когда мышь подвергалась воздействию нового объекта. Это также видно из растровых графиков, которые показывают пороговую активность обжига всех отображаемых ячеек в дни 1, 4 и 5. <img alt="Рисунок 1" src="/files/ftp_upload/55579/55579fig1.jpg" /> Рисунок 1: In Vivo Ca 2+ Imaging на нескольких корковых слоях у свободно перемещающихся мышей. ( A ) Характеристики зонда призмы и изображение плоскости изображения. Отражающее покрытие на внутренней поверхности гипотенузы позволяет визуализировать 90 ° от плоскости вставки призмы. Объектив cuFf интегрируется с держателем объектива, что упрощает процедуру имплантации и позволяет потенциально наблюдать флуоресценцию окружающей ткани во время имплантации ( B ) (i). Иллюстрация размещения краниотомии зондирующего зонда и разреза ножа относительно места инъекции вируса и (ii) иллюстрации местоположения плоской стороны призматического зонда относительно разреза ножа и места инъекции вируса. ( C ) Иллюстрация установки изображения in-vivo Ca 2+, показывающей путь света для небольшой области в пределах полного поля зрения через призменный зонд, имплантированный в кору мышей. ( D ) Пример поля зрения при установке зонда призмы. Миниатюрный микроскоп прикреплен к держателю объектива, который содержит призменный зонд, позволяющий проверять экспрессию вируса во время установки зонда. ( E ) Интеграция микроскопа с призменным зондом для многослойной кортикальной визуализации меченых клеток S1 GCaMP6f. F Пример поля просмотраПри установке базовой плиты. Четкая картина кровеносного сосуда видна во время установки базовой плиты с некоторыми клетками в необработанном изображении. Больше ячеек хорошо видно, когда DF / F включается в окне программного обеспечения для сбора данных. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55579/55579fig1large.jpg" target="_blank">Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a> <img alt="фигура 2" src="/files/ftp_upload/55579/55579fig2.jpg" /> Рисунок 2: Схема, показывающая временную шкалу событий рабочего процесса для имплантации зонда и установки микроскопа. Число недель представлено на оси X и на этапах рабочего процесса процедур вдоль оси Y. ( A ) Графика, иллюстрирующая инъекцию вируса (AAV1.CaMKII.GCaMP6f.WPRE.SV40) вдоль той же дорзо-вентральной оси, чтобы маркировать несколько слоев соматосенсорной коры мыши. ( B ) 2 недели после инъекций вируса, призмыE имплантируется на ось, параллельную сайтам инъекций вирусов. ( C ) Примерно через одну неделю после имплантации имплантата призмы животное проверяется на предмет экспрессии с помощью микроскопа, и на голове устанавливается опорная пластина, если видна популяция клеток. ( D ) Затем животное готово к хроническому отображению во время соответствующих поведенческих задач (клип мыши изменен после разрешения от UW-Madison Biochemistry MediaLab). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55579/55579fig2large.jpg" target="_blank">Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a> <img alt="Рисунок 3" src="/files/ftp_upload/55579/55579fig3.jpg" /> Рисунок 3: Гистологическая валидация места расположения призмы и экспрессия GCaMP. ( A ) Корональный разрез из головного мозга мыши, показывающий тракт призмы и его обратную сторонуЭкспрессирующие клетки GCaMP6f (AAV1.CaMKII.GCaMP6f, выраженные в нейронах в слоях 2/3 и 5). ( B ) То же самое корональное отделение мозга после окрашивания для DAPI. Шкала шкалы = 250 мкм ( C ) Уменьшена с учетом GCaMP6f, экспрессирующего клетки в соматосенсорной коре. Шкала шкалы = 100 мкм. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55579/55579fig3large.jpg" target="_blank">Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a> <img alt="Рисунок 4" src="/files/ftp_upload/55579/55579fig4.jpg" /> Рисунок 4: Активность мыши во время Habituation, ознакомления и тестирования новых объектов подвергалась видео-отслеживанию с использованием программного обеспечения для видео. ( A ) В первый день животное было помещено в поведенческую арену, лишенную каких-либо предметов (Open Field). ( B ) В дни 2-4 на арену были помещены те же два текстурно разных объекта (гель и деревянный блок) (Object Familiarization). ( C ) В День 5 один из объектов был заменен новым объектом (деревянный блок с песочной бумагой) (Novel Object Exposure). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55579/55579fig4large.jpg" target="_blank">Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a> <img alt="Рисунок 5" src="/files/ftp_upload/55579/55579fig5.jpg" /> Рисунок 5: Динамика кальция от поверхностных и глубоких слоев соматосенсорной коры головного мозга с микроскопом. ( A ) Объединенное изображение нейронных пространственных фильтров (зеленые капли) и средняя проекция интенсивности флуоресценции записи микроскопа через поле зрения зонда. Граница между надглазурным и инфрагранулярным слоями, обозначенная белой пунктирной линией. Шкала шкалы = 100 мкм. ( B ) Следы кальция из пяти образцов поверхностных и глубоких слоев (заполнены синим и красным cEll в панели A), что указывает единицы стандартного отклонения флуоресценции после основного и независимого анализа компонентов. Полоса горизонтальной шкалы 50 с и вертикальная шкала шкалы 10 SD ( C ) Растровый график ячеек из поверхностных слоев (слоев 2/3) и глубоких слоев (слой 5), отображаемых над полем «Открытое поле», «Обследование объекта» и «Изучение новых объектов». Шкала шкалы = 100 с. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55579/55579fig5large.jpg" target="_blank">Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Multi-layer Cortical Ca2+ Imaging in Freely Moving Mice with Prism Probes and Miniaturized Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Multi-layer Cortical Ca2+ Imaging in Freely Moving Mice with Prism Probes and Miniaturized Fluorescence Microscopy

Здесь мы представляем процедуру для крупномасштабной визуализации Ca 2+ с клеточным разрешением через несколько корковых слоев у свободно движущихся мышей. Одновременно можно наблюдать сотни активных клеток, используя миниатюрный микроскоп, монтируемый на голову, в сочетании с имплантированным призменным зондом.

Многослойный кортикальный Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Визуализация в свободно перемещающихся мышах с помощью призматических зондов и миниатюрной флуоресцентной микроскопии

In vivo circuit and cellular level functional imaging is a critical tool for understanding the brain in action. High resolution imaging of mouse cortical ...

Research

JoVE Journal

Behavior

Multi-layer Cortical Ca2+ Imaging in Freely Moving Mice with Prism Probes and Miniaturized Fluorescence Microscopy

Functional Magnetic Resonance Imaging (fMRI) with Auditory Stimulation in Songbirds

Functional Magnetic Resonance Imaging fMRI with Auditory Stimulation in Songbirds

Функциональная магнитно-резонансной томографии (МРТ) с звуковой стимуляции в Певчие птицы

The neurobiology of birdsong, as a model for human speech, is a pronounced area of research in behavioral neuroscience. Whereas electrophysiology and ...

Long-term Potentiation of Perforant Pathway-dentate Gyrus Synapse in Freely Behaving Mice

Долгосрочный Потенцирование перфорантных Pathway-зубчатой ​​извилине Synapse в свободно Поступая Мышей

Studies of long-term potentiation of synaptic efficacy, an activity-dependent synaptic phenomenon having properties that make it attractive as a potential ...

Two-photon Calcium Imaging in Mice Navigating a Virtual Reality Environment

Двухфотонное Кальций изображений на мышах навигации среда виртуальной реальности

In recent years, two-photon imaging has become an invaluable tool in neuroscience, as it allows for chronic measurement of the activity of genetically ...

Quantitative Assessment of Cortical Auditory-tactile Processing in Children with Disabilities

Количественная оценка Кортикальная Слуховые-тактильной обработки в детей с ограниченными возможностями

Objective and easy measurement of sensory processing is extremely difficult in nonverbal or vulnerable pediatric patients. We developed a new methodology ...

Measurement of Fronto-limbic Activity Using an Emotional Oddball Task in Children with Familial High Risk for Schizophrenia

Измерение лобно-лимбической деятельности, используя эмоциональном чудак Задача у детей с семейной высокий риск шизофрении

Adolescence is a critical developmental period where the early symptoms of schizophrenia frequently emerge. First-degree relatives of people with ...

Flat-floored Air-lifted Platform: A New Method for Combining Behavior with Microscopy or Electrophysiology on Awake Freely Moving Rodents

Мини-этажном воздуха поднимается Платформа: Новый метод Объединение Поведение с микроскопии или электрофизиологии на Пробудитесь свободно движущейся Грызунов

It is widely acknowledged that the use of general anesthetics can undermine the relevance of electrophysiological or microscopical data obtained from a ...

The Modified Hole Board - Measuring Behavior, Cognition and Social Interaction in Mice and Rats

Модифицированный Совет Hole - Измерение поведения, познания и социального взаимодействия у мышей и крыс

This protocol describes the modified hole board (mHB), which combines features from a traditional hole board and open field and is designed to measure ...

Simultaneous Transcranial Alternating Current Stimulation and Functional Magnetic Resonance Imaging

Одновременная транскраниальная стимуляция переменного тока и функциональная магнитно-резонансная томография

Transcranial alternating current stimulation (tACS) is a promising tool for noninvasive investigation of brain oscillations. TACS employs ...

Reversible Cooling-induced Deactivations to Study Cortical Contributions to Obstacle Memory in the Walking Cat

Реверсивные охлаждения индуцированной деактиваций учиться корковых вклад препятствие памяти в пешеходных Cat

On complex, naturalistic terrain, sensory information about an environmental obstacle can be used to rapidly adjust locomotor movements for avoidance. For ...

A Wireless, Bidirectional Interface for In Vivo Recording and Stimulation of Neural Activity in Freely Behaving Rats

A Wireless, Bidirectional Interface for In Vivo Recording and Stimulation of Neural Activity in Freely Behaving Rats

Беспроводной, двунаправленный интерфейс для записи в естественных условиях и стимуляции нейронной активности в свободно себя крысы

In vivo electrophysiology is a powerful technique to investigate the relationship between brain activity and behavior at a millisecond and micrometer ...