Name: multi-layer cortical ca2+ imaging in freely moving mice with prism probes and miniaturized fluorescence microscopy
Uploaded: 2017-06-13T12:30:00
Duration: 10 min 35 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multi-layer Cortical Ca2+ Imaging in Freely Moving Mice with Prism Probes and Miniaturized Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Författarna vill tacka V. Jayaraman, DS Kim, LL Looger och K. Svoboda från Genie-projektet (Genie-Encoded Neuronal Indicator and Effector) på Janelia Research Campus i Howard Hughes Medical Institute för deras generösa donation av AAV1-GCaMP6f Till University of Pennsylvania Vector Core. De skulle också vilja tacka A. Olson och Neuroscience Microscopy Core vid Stanford University med stöd av NIH NS069375 bidrag för sina konfokala mikroskopitjänster.

<ol>
	<li>McConnell, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+decision-making+in+the+mammalian+cerebral+cortex.">Development and decision-making in the mammalian cerebral cortex.</a> Brain Res. 472 (1), 1-23 (1988).</li><li>Kwon, S. E., Yang, H., Minamisawa, G., O'Connor, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensory+and+decision-related+activity+propagate+in+a+cortical+feedback+loop+during+touch+perception.">Sensory and decision-related activity propagate in a cortical feedback loop during touch perception.</a> Nat. Neurosci. 19 (9), 1243-1249 (2016).</li><li>Miller, E. K., Cohen, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrative+theory+of+prefrontal+cortex+function.">An integrative theory of prefrontal cortex function.</a> Annu. Rev. Neurosci. 24, 167-202 (2001).</li><li>Bailey, M. R., Simpson, E. H., Balsam, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+substrates+underlying+effort,+time,+and+risk-based+decision+making+in+motivated+behavior.">Neural substrates underlying effort, time, and risk-based decision making in motivated behavior.</a> Neurobiol. Learn. Mem. 133, 233-256 (2016).</li><li>Dehaene, S., Changeux, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reward-dependent+learning+in+neuronal+networks+for+planning+and+decision+making.">Reward-dependent learning in neuronal networks for planning and decision making.</a> Prog. Brain Res. 126, 217-229 (2000).</li><li>Ferenczi, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prefrontal+cortical+regulation+of+brainwide+circuit+dynamics+and+reward-related+behavior.">Prefrontal cortical regulation of brainwide circuit dynamics and reward-related behavior.</a> Science. 351 (6268), aac9698 (2016).</li><li>Anomal, R. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+Processing+in+the+Primary+Auditory+Cortex+of+an+Animal+Model+of+Autism.">Impaired Processing in the Primary Auditory Cortex of an Animal Model of Autism.</a> Front. Sys. Neurosci. 9, 158 (2015).</li><li>Pauls, D. L., Abramovitch, A., Rauch, S. L., Geller, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obsessive-compulsive+disorder:+an+integrative+genetic+and+neurobiological+perspective.">Obsessive-compulsive disorder: an integrative genetic and neurobiological perspective.</a> Nat. Rev. Neurosci. 15 (6), 410-424 (2014).</li><li>Ziv, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+dynamics+of+CA1+hippocampal+place+codes.">Long-term dynamics of CA1 hippocampal place codes.</a> Nat. Neurosci. 16 (3), 264-266 (2013).</li><li>Jennings, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+hypothalamic+network+dynamics+for+appetitive+and+consummatory+behaviors.">Visualizing hypothalamic network dynamics for appetitive and consummatory behaviors.</a> Cell. 160 (3), 516-527 (2015).</li><li>Betley, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurons+for+hunger+and+thirst+transmit+a+negative-valence+teaching+signal.">Neurons for hunger and thirst transmit a negative-valence teaching signal.</a> Nature. 521 (7551), 180-185 (2015).</li><li>Sun, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+speed+dependence+of+entorhinal+island+and+ocean+cells,+including+respective+grid+cells.">Distinct speed dependence of entorhinal island and ocean cells, including respective grid cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 112 (30), 9466-9471 (2015).</li><li>Kitamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entorhinal+Cortical+Ocean+Cells+Encode+Specific+Contexts+and+Drive+Context-Specific+Fear+Memory.">Entorhinal Cortical Ocean Cells Encode Specific Contexts and Drive Context-Specific Fear Memory.</a> Neuron. 87 (6), 1317-1331 (2015).</li><li>Pinto, L., Dan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-Type-Specific+Activity+in+Prefrontal+Cortex+during+Goal-Directed+Behavior.">Cell-Type-Specific Activity in Prefrontal Cortex during Goal-Directed Behavior.</a> Neuron. 87 (2), 437-450 (2015).</li><li>Cox, J., Pinto, L., Dan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+imaging+of+sleep-wake+related+neuronal+activity+in+the+dorsal+pons.">Calcium imaging of sleep-wake related neuronal activity in the dorsal pons.</a> Nat. Comm. 7, 10763 (2016).</li><li>Resendez, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+cortical,+subcortical+and+deep+brain+neural+circuit+dynamics+during+naturalistic+mammalian+behavior+with+head-mounted+microscopes+and+chronically+implanted+lenses.">Visualization of cortical, subcortical and deep brain neural circuit dynamics during naturalistic mammalian behavior with head-mounted microscopes and chronically implanted lenses.</a> Nat. Protoc. 11 (3), 566-597 (2016).</li><li>Hooks, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+cortical+and+thalamic+input+to+pyramidal+neurons+in+mouse+motor+cortex.">Organization of cortical and thalamic input to pyramidal neurons in mouse motor cortex.</a> The J. Neurosci. 33 (2), 748-760 (2013).</li><li>Masamizu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+distinct+layer-specific+dynamics+of+cortical+ensembles+during+learning+of+a+motor+task.">Two distinct layer-specific dynamics of cortical ensembles during learning of a motor task.</a> Nat. Neurosci. 17 (7), 987-994 (2014).</li><li>Rowland, D. C., Moser, M. -. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+cortical+modules+to+memories.">From cortical modules to memories.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 24 (1), 22-27 (2014).</li><li>Ghosh, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Miniaturized+integration+of+a+fluorescence+microscope.">Miniaturized integration of a fluorescence microscope.</a> Nat. Methods. 8 (10), 871-878 (2011).</li><li>Mukamel, E. A., Nimmerjahn, A., Schnitzer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+analysis+of+cellular+signals+from+large-scale+calcium+imaging+data.">Automated analysis of cellular signals from large-scale calcium imaging data.</a> Neuron. 63 (6), 747-760 (2009).</li><li>Andermann, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+cellular+imaging+of+entire+cortical+columns+in+awake+mice+using+microprisms.">Chronic cellular imaging of entire cortical columns in awake mice using microprisms.</a> Neuron. 80 (4), 900-913 (2013).</li><li>Goldey, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removable+cranial+windows+for+long-term+imaging+in+awake+mice.">Removable cranial windows for long-term imaging in awake mice.</a> Nat. Protoc. 9 (11), 2515-2538 (2014).</li><li>Chia, T. H., Levene, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+deep+cortical+layers+using+a+microprism.">In vivo imaging of deep cortical layers using a microprism.</a> J. Vis. Exp. (30), (2009).</li><li>Chia, T. H., Levene, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microprisms+for+in+vivo+multilayer+cortical+imaging.">Microprisms for in vivo multilayer cortical imaging.</a> J. Neurophysiol. 102 (2), 1310-1314 (2009).</li><li>Chia, T. H., Levene, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-layer+in+vivo+imaging+of+neocortex+using+a+microprism.">Multi-layer in vivo imaging of neocortex using a microprism.</a> Cold Spring Harb. Protoc. 2010 (8), (2010).</li><li>Low, R. J., Gu, Y., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+resolution+optical+access+to+brain+regions+in+fissures:+imaging+medial+prefrontal+cortex+and+grid+cells+in+entorhinal+cortex.">Cellular resolution optical access to brain regions in fissures: imaging medial prefrontal cortex and grid cells in entorhinal cortex.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 111 (52), 18739-18744 (2014).</li><li>Zeisel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+structure.+Cell+types+in+the+mouse+cortex+and+hippocampus+revealed+by+single-cell+RNA-seq.">Brain structure. Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq.</a> Science. 347 (6226), 1138-1142 (2015).</li><li>Hawrylycz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inferring+cortical+function+in+the+mouse+visual+system+through+large-scale+systems+neuroscience.">Inferring cortical function in the mouse visual system through large-scale systems neuroscience.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 113 (27), 7337-7344 (2016).</li><li>Petrof, I., Viaene, A. N., Sherman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+the+primary+somatosensory+cortex+projection+to+the+primary+motor+cortex+in+the+mouse.">Properties of the primary somatosensory cortex projection to the primary motor cortex in the mouse.</a> J. Neurophysiol. 113 (7), 2400-2407 (2015).</li><li>Aronoff, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-range+connectivity+of+mouse+primary+somatosensory+barrel+cortex.">Long-range connectivity of mouse primary somatosensory barrel cortex.</a> Euro. J. Neurosci. 31 (12), 2221-2233 (2010).</li><li>Rogan, S. C., Roth, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remote+control+of+neuronal+signaling.">Remote control of neuronal signaling.</a> Pharma. Rev. 63 (2), 291-315 (2011).</li><li>Berdyyeva, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zolpidem+reduces+hippocampal+neuronal+activity+in+freely+behaving+mice:+a+large+scale+calcium+imaging+study+with+miniaturized+fluorescence+microscope.">Zolpidem reduces hippocampal neuronal activity in freely behaving mice: a large scale calcium imaging study with miniaturized fluorescence microscope.</a> PloS One. 9 (11), e112068 (2014).</li></ol>

Författarna har läst journalens policy och har följande konkurrerande intressen: SG, SO och VC betalas anställda hos Inscopix.

Att förstå neuralt kretsaktivitet under vakat beteende är en vital nivå av neurovetenskaplig undersökning som behövs för att effektivt dissekera hjärnans funktion i hälsa och sjukdom. Cortexen är en särskilt viktig region för att studera i samband med vaket beteende, eftersom det spelar en viktig roll i många viktiga sensoriska, kognitiva och verkställande funktioner 28 , 29 . Den kortikala kolonnen anses vara den grundläggande funktionella enheten i cortex och populationsnivåaktiviteten hos kortikala celler är känd för att skilja sig beroende på deras fysiska placering i kolonnen. Exempelvis sträcker excitatoriska nervceller i skikt 2/3 i den somatosensoriska cortexen primärt till andra neokortiska områden och modulerar andra kortikala nätverk 30 medan celler i djupare skikt främst verkar för subkortiska områden som thalamus 31 . Spela in aktiviteten av hundraS av fördefinierade kortikala celler samtidigt och tillförlitligt över tid över olika laminer hos fritt uppträdande personer skulle avsevärt öka vår förståelse för kortikalt informationsflöde, vilket möjliggör en finare funktionell dissektion av kortikala kolumner informerad av realtids beteendeinformation och uppgiftsrelevant tids- skalor. Att samla denna nivå av neurala kretsdata är möjlig med hjälp av en effektiv och strömlinjeformad miniatyriserad mikroskopiplattform för att genomföra storskalig Ca 2+ -bildning i fritt uppträdande ämnen (eller huvudfästa ämnen som önskat). Används med genetiskt kodade kalciumindikatorer för att möjliggöra specifikt inriktning av celltyp och avbilda ett flerskiktsfält som tillhandahålls av en kroniskt implanterad prisma sond, undersökte detta protokoll ett fall bland många möjliga tillämpningar: observera laminära skillnader i somatosensorisk kortikal bearbetning när möss Fysiskt förlovad med ett nytt objekt ( figur 5 ).Detta är den första procedurillustrationen av denna typ av celltypsspecifik in vivo-tillvägagångssätt för att studera flera kortikala skikt i vakna, fritt uppförande djur och breddar spektrumet av experimentella metoder som är tillgängliga för att förstå laminära strukturer i den aktiva hjärnan. Det periskopiska synfältet aktiverat av prismatsonden i denna teknik kan med fördel tillämpas på andra hjärnstrukturer när bevarande av vävnaden direkt dorsal till en region av intresse är önskvärt; Till exempel kan CA3-bildbehandling uppnås utan störning av hippocampalfunktionen. Prismatsbaserad metod för bildbehandling av Ca2 + -aktivitet kräver fysisk införande och permanent implantering av en mikroprism i cortexen, vilket motsvarar skapandet av en kortikalskada där linsproben sätts in. Detta kan leda till störningar i den lokala neurala kretsen, inklusive avskiljning av apikala dendriter och processer. THans förfarande kommer också att leda till en initial aktivering av glialceller i regionen, fastän detta förväntas lokaliseras till vävnaden ca 150 | im från prismans ansikte och att sänka sig efter att hjärnan har läkt 22 . Det är mycket viktigt att överväga om denna teknik kommer att påverka normala kretsanatomi och / eller beteende hos djuren vid planering av experiment. Behaviorskontrollgrupper bör alltid genomföras för att säkerställa att det inte finns några signifikanta förändringar i baslinjebeteenden som kan ge upphov till förvirrande experimentella resultat. Användning av denna miniatyriserade mobil Ca 2+ bildteknik med neurofarmakologisk manipulation, olika kognitiva, sociala, motoriska eller inneboende beteendeparadigma och kombinera det med andra fysiologiska mätvärden kan fördjupa och berika studier som är inriktade på att förstå funktionella roller hos neurala kretsar i beteende och signal Bearbetning 32 . Suppression eller aktivAtion av vissa vägar som moduleras av droger kan påverka associerade beteenden, som lätt kan studeras med hjälp av denna teknik 33 . Att förgrena sig till olika celltyper genom att modifiera målningen av kalciumindikatorn är en annan kraftfull och användbar applikation och möjliggör många kreativa kombinationer av experimentella verktyg för att hantera olika neurala kretsfrågor.

Cortexen är en viktig aktör i många komplexa mentala och beteendemässiga funktioner, från uppmärksamhet, sensorisk uppfattning och top-down kognitiv kontroll 1 , 2 , 3 mot motivation, belöning och missbruksvägar 4 , 5 . Att förstå de beräkningsprocesser som ligger till grund för sin funktion är ett viktigt mål att driva en bättre klinisk förståelse för många psykiska och beteendestörningar. Många aktuella teorier om psykiatrisk sjukdom ligger centralt kring idén om att kortikala neurala kretsdysfunktioner eller diskoordination kan ligga till grund för kognitiva och beteendemässiga abnormiteter som är kännetecken för förhållanden som schizofreni 6 , autism 7 eller tvångssyndrom 8 . Således erhöll man uppgift om neurala aktivitetsdata från populationen från koRtiska kretsar inom det korrekta sammanhanget med samtidig beteendeinformation är av stor betydelse och kan idealiskt riktas mot specifika celltyper för finare neuralt kretsdissektion. Miniatyriserade mikroskop i samband med implanterbara gradientbrytningsindex (GRIN) mikrolinser möjliggör optisk åtkomst till neuronella ensembler under fritt rörliga förhållanden från en mångfald av möjliga hjärnområden 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , inkluderande cortex 14 , 15 , 16 . Genom att använda ett mobilmikroskopysystem kopplat till genetiskt kodade kalciumindikatorer möjliggör konsekvent avbildning av samma cellulära population som omfattar hundratals neuroner över dagar till veckor i många hjärnregioner 9 och kan varaGenetiskt riktade mot specifika celltyper med användning av viral vektor eller transgena tekniker. Eftersom cortex är känt för att stödja olika funktioner och ansluta till olika hjärnregioner beroende på placeringen av cellerna i cortical lamina 17 , 18 , 19 , är vi intresserade av att erhålla simultan flerlags neural aktivitet i vakna uppträdande ämnen. Här visar vi hur man bildar hundratals fluorescensmärkta neuroner i fritt uppträdande möss över dagar, med hjälp av det miniatyriserade fluorescensmikroskopet 20 parat med en implanterad prisma sond, som erbjuder en flerskiktsvy av cortexen ( Figur 1 ). Prismatsonden som används här består av två separata GRIN-linser: ett prisma och en cylindrisk relälins ( Figur 1 ). Ljuset från mikroskopet exciterar fluorescensmärkningenCeller belägna längs prismatorns bildningsytan, efter att de reflekterats från hypotenusen av probens delprofil. Det emitterade ljuset från cellerna speglar också av prismans hypotenus, samlas in genom mikroskopets mål och når sensorn i mikroskopet. Den prisma sonden som används i denna procedur är anpassad för enkel användning med standard stereotaxisk utrustning. Det miniatyriserade fluorescensmikroskopet 20 detekterar aktionspotential-framkallade Ca2 + -transienter i neuronpopulationer med enkelcellsupplösning, efter det att dessa celler har märkts specifikt med Ca2 + -sensitiva genetiskt kodade fluorescerande indikatorer. I detta protokoll injicerar vi Ca 2+ -indikatorn kodad i en viral vektor (AAV1.CaMKII.GCaMP6f.WPRE.SV40), implantera en prisma sond, installera mikroskopet och sedan erhålla flera dagar av neurala aktivitetsdata för SAT-bakbenet Från ett djur exponeraD till nya objektytor under fri utforskning ( Figur 2 ).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Neurostar Motorized 
			Ultra Precise Small Animal Stereotaxic Instrument</td>
			<td>Kopf</td>
			<td>Model 963SD</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereoscope</td>
			<td>Labomed</td>
			<td>Prima DNT</td>
			<td>Surgery and Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Rectal Thermistor Probe (.062&#34;/1.6mm diameter) - 1/4&#34; Jack</td>
			<td>FHC</td>
			<td>40-90-5D-02</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating Pad 5 X 12.5cm&#160;</td>
			<td>FHC</td>
			<td>40-90-2-07</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC Temperature Controller</td>
			<td>FHC</td>
			<td>40-90-8D</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsyringe Pump</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>UMP3 model; serial 155788 F110</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoFil 10&#956;L Syringe</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>NANOFIL</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 G Beveled Tip Nanofil NDL 2PK</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>NF35BV-2</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omnidrill35, 115-230V</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>503598</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Burrs for Micro Drill</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>19007-05</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nVista</td>
			<td>Inscopix</td>
			<td>100-001048</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV1.CaMKII.GCaMP6f.WPRE.SV40</td>
			<td>Penn Vector Core</td>
			<td>AV-1-PV3435</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketoprofen</td>
			<td>Victor Medical</td>
			<td>5487</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carprofen</td>
			<td>Victor Medical</td>
			<td>1699008&#160;</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Victor Medical</td>
			<td>1001054</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelfoam (Patterson Veterinary Supply Inc Gelfoam Sponge 12cmx7mm)</td>
			<td>Pfizer (Fisher Scientific)</td>
			<td>NC9841478</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5/45 forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-35</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-30</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting knives</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10055-12</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProView Implant Kit</td>
			<td>Inscopix</td>
			<td>100-000756</td>
			<td>Surgery and Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProView Prism Probe 1.0mm-Dia. ~4.3mm Length</td>
			<td>Inscopix</td>
			<td>100-000592</td>
			<td>Surgery and Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kwik-Sil adhesive pack of 2</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>KWIK-SIL</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kwik-Cast Sealant</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>KWIK-CAST</td>
			<td>Surgery and Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniature Optical Mounting Post</td>
			<td>Newport</td>
			<td>M-TSP-3</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Baseplate</td>
			<td>Inscopix</td>
			<td>BPL-2</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Baseplate Cover</td>
			<td>Inscopix</td>
			<td>BPC-2</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multi-layer cortical ca2+ imaging in freely moving mice with prism probes and miniaturized fluorescence microscopy

In vivo krets och cellulär nivå funktionell bildbehandling är ett viktigt verktyg för att förstå hjärnan i handling. Högupplösningsavbildning av muscortikala neuroner med tvåfotonmikroskopi har gett unika insikter i kortikal struktur, funktion och plasticitet. Dessa studier är dock begränsade till att fasta fasta djur, vilket avsevärt minskar den beteendemässiga komplexiteten som är tillgänglig för studier. I detta dokument beskriver vi ett förfarande för att utföra kronisk fluorescensmikroskopi med cellulär upplösning över flera kortikala skikt hos frilövande möss. Vi använde ett integrerat miniatyriserat fluorescensmikroskop parat med en implanterad prisma sond för att samtidigt visualisera och registrera kalciumdynamiken hos hundratals neuroner över flera lager av den somatosensoriska cortexen som musen förlovat i en ny objektutforskningsuppgift, över flera dagar. Denna teknik kan anpassas till andra hjärnregioner i olika djurarter för andra beteendepatienteraradigms.

Protokollet som beskrivs här beskriver ett effektivt och effektivt sätt att utföra longitudinell flerskikts Ca 2+ avbildning från hundratals kortikala neuroner hos fritt uppförande möss med användning av prisma-prober ( Figur 1 ). Tidigare tillvägagångssätt gentemot multilags kortikal bildbehandling har i första hand varit begränsad till att fasta fasta djur 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 . För att förvärva denna nivå av data i ett fritt uppträdande sammanhang användes en miniatyriserad mikroskopplattform för beteendeflexibilitet; En genetiskt kodad kalciumindikator (GCaMP6f) användes för att rikta en specifik cellpopulation (CAMKII + -celler i cortexen); Och en prisma-prob valdes för att tillhandahålla ett kroniskt flerskiktsfält. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; Vi demonstrerade arbetsflödet för att förbereda djuret för bildbehandling. En viral vektor som kodar för en lämplig kalciumindikator injicerades i cortexen ( Figur 2 , Steg 1), innan kronisk implantering av en prismatsond för att möjliggöra optisk åtkomst till de märkta cellerna ( Figur 2 , Steg 2). En basplatta som fungerar som en säker, tillfällig brygga för positionering av mikroskopet under bildsessionerna installerades sedan över djurets huvud ( Figur 2 , Steg 3), vilket möjliggör visualisering av kortikal aktivitet över flera cellskikt i en vaken uppförande experimentell Setup ( Figur 2 , Steg 4). För att säkerställa att den önskade cellulära populationen målades, visas en post mortem coronal hjärnsektion från en representativ mus i Figur 3 med prisma sondområdet och synfält markerat i förhållande till GCaMP6f labEled neurons i lag 2/3 och 5 av den somatosensory cortexen. Under vaken uppträder avbildning med systemet registrerades aktiviteten hos de somatosensoriska kortikala nervcellerna när musen utsattes för tre olika miljöer - Open Field (Dag 1), Objektbekännelse (Dag 2-4) och Nya objekt (Dag 5) ( Figur 4 ). På dag 1 placerades musen i en beteendespark som saknar föremål. På dag 2-4 placerades musen i arenan med samma två texturellt olika föremål (en gelkudde och ett träblock). På dag 5 ersattes en av föremålen med ett nytt objekt. Djuret avbildades över 5 dagar i 20 min varje dag. Efter cellutvinning med användning av Ca 2+ bilddataanalysprogrammet överlagrades rumsfilter som motsvarade celllänkar på den medelvärda fluorescensintensitetsprojektionen av mikroskopinspelningsdata( Figur 5) . En vit streckad linje skiljer lager 2/3 och 5 celler. Motsvarande Ca 2+ spår från 5 celler från var och en av skikten visar cellens bränningsmönster i två olika beteendeskontexter - Objektförändring och objektiv exponering av objekt. Lag 2/3 celler var mer aktiva jämfört med skikt 5 celler på den dag då musen exponerades för ett nytt objekt. Detta framgår också av rasterplanerna som visar tröskelvärdet för alla avbildade celler på dagarna 1, 4 och 5. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/55579/55579fig1.jpg" /> Figur 1: In vivo Ca 2+ Imaging över flera kortiska lager i fritt rörliga möss. ( A ) Prism sond specifikationer och avbildning av bildplan. Den reflekterande beläggningen på insidan av hypotenusen möjliggör avbildning 90 ° från prismatorns införingsplan. Linsen cuFf integreras med linshållaren, vilket effektiviserar implantationsproceduren och möjliggör potentiell visning av fluorescens i omgivande vävnad under implantationen ( B ) (i). Illustration av placering av prisma-sondkraniotomi och knivinsnitt i förhållande till virusinjektionsstället, och (ii) illustration av placeringen av prismondens plana sida relativt knivinsnittet och virusinjektionsstället. ( C ) Illustration av in-vivo Ca 2+ -bildningsinställningar som visar ljusbanan för ett litet område inom hela synfältet genom prismatorn implanterad i muscortex. ( D ) Exempel synfält under prismatsinstallation. Miniatyrmikroskop är fastsatt på linshållaren, som håller prisma sonden möjliggör kontroll av virusuttrycket under prismatsinstallation. ( E ) Integrering av mikroskop med prismatsond för multilags kortikal bildbehandling av GCaMP6f-märkta S1-celler. F Exempel synfältUnder basplattans installation. Tydligt blodkärlmönster är synligt vid tidpunkten för basplattformen med vissa celler i råbilden. Fler celler är tydligt synliga när DF / F är påslagen i fönstret för uppköpsprogramvara. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55579/55579fig1large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/55579/55579fig2.jpg" /> Figur 2: Schematisk Visar tidslinjen för arbetsflödeshändelser för prismsimplantation och mikroskopinstallation. Antal veckor representeras på X-axeln och arbetsflödesstegen i rutinerna längs Y-axeln. ( A ) Grafisk illustrerande viral injektion (AAV1.CaMKII.GCaMP6f.WPRE.SV40) längs samma dorso-ventralaxel för att märka flera lager av musens somatosensoriska cortex. ( B ) 2 veckor efter virusinjektioner, en prisma probE implanteras vid en axel som är parallell med virusinjektionsställena. ( C ) Cirka en vecka efter prismatsimplantationen kontrolleras djuret för uttryck med mikroskopet och en basplatta är monterad på huvudet om en population av celler är synlig. ( D ) Djuret är sedan redo för kronisk bildbehandling under relevanta beteendemässiga uppgifter (muspixel modifierad efter tillstånd från- UW-Madison Biochemistry MediaLab). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55579/55579fig2large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/55579/55579fig3.jpg" /> Figur 3: Postmortem Histologisk Validering av Prism Probe Plats och GCaMP Expression. ( A ) Koronavsnitt från en representativ mushjärna som visar prismakroppen och med dess bildsidor vända motDe GCaMP6f-uttryckande cellerna (AAV1.CaMKII.GCaMP6f uttryckta i neuroner i skikt 2/3 och 5). ( B ) Samma koronala hjärnsektion efter färgning för DAPI. Skala bar = 250 μm ( C ) Zoomat med tanke på GCaMP6f uttrycker celler i somatosensory cortex. Skalstång = 100 μm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55579/55579fig3large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.</a> <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/55579/55579fig4.jpg" /> Figur 4: Musaktivitet under Habituation, Familiarization och Novel Object Exposure Testing var videospårad med hjälp av videoprogramvara. ( A ) På dag 1 placerades djuret i en beteendespark som saknade föremål (Open Field). ( B ) På dagarna 2-4 placerades samma två texturellt olika föremål (gelplatta och träblock) i arenan (Object Familiarization). ( C ) På dag 5 ersattes en av föremålen med ett nytt föremål (träblock med sandpapper) (Novel Object Exposure). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55579/55579fig4large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.</a> <img alt="Figur 5" src="/files/ftp_upload/55579/55579fig5.jpg" /> Figur 5: Kalciumdynamik från ytliga och djupa lager av somatosensorisk cortex hos en representativ mus som avbildats med mikroskopet. ( A ) Sammanfogad bild av neuronala rumsfilter (gröna blobs) och medelvärdesfluorescensintensitetsprojektion av mikroskopets inspelning genom prisma sondfältet. Gräns ​​mellan supragranulära och infragranulära skikt som indikeras av en vit streckad linje. Skalstång = 100 μm. ( B ) Kalsiumspår från fem exempel ytliga och djupa lagerceller (fylld blå och röd cElls i panel A), vilket indikerar enheter av standardavvikelse för fluorescens efter principiell och oberoende komponentanalys. Horisontell skala bar 50 s och vertikal skala bar 10 SD ( C ) Rasterplot av celler från ytliga (lager 2/3) och djupa lager (lager 5) visas över Öppna fält, Objekttifiering och Novel objektutforskning. Skalstång = 100 s. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55579/55579fig5large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Multi-layer Cortical Ca2+ Imaging in Freely Moving Mice with Prism Probes and Miniaturized Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Multi-layer Cortical Ca2+ Imaging in Freely Moving Mice with Prism Probes and Miniaturized Fluorescence Microscopy

Här presenterar vi ett förfarande för att utföra storskalig Ca 2+ -bildning med cellulär upplösning över flera kortikala skikt i fritt rörliga möss. Hundratals aktiva celler kan observeras samtidigt med ett miniatyr, huvudmonterat mikroskop kopplat till en implanterad prisma sond.

Flerskikts Cortical Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Imaging i fritt rörliga möss med prismprober och miniatyriserad fluorescensmikroskopi

In vivo circuit and cellular level functional imaging is a critical tool for understanding the brain in action. High resolution imaging of mouse cortical ...

Research

JoVE Journal

Behavior

Multi-layer Cortical Ca2+ Imaging in Freely Moving Mice with Prism Probes and Miniaturized Fluorescence Microscopy

Functional Magnetic Resonance Imaging (fMRI) with Auditory Stimulation in Songbirds

Functional Magnetic Resonance Imaging fMRI with Auditory Stimulation in Songbirds

Funktionell magnetisk resonanstomografi (fMRI) med auditiv stimulering i Songbirds

The neurobiology of birdsong, as a model for human speech, is a pronounced area of research in behavioral neuroscience. Whereas electrophysiology and ...

Long-term Potentiation of Perforant Pathway-dentate Gyrus Synapse in Freely Behaving Mice

Långsiktigt Potentiering av perforanta Pathway-gyrus dentatus Synapse i fritt uppför Möss

Studies of long-term potentiation of synaptic efficacy, an activity-dependent synaptic phenomenon having properties that make it attractive as a potential ...

Two-photon Calcium Imaging in Mice Navigating a Virtual Reality Environment

Två-foton Kalcium Imaging i möss Navigera en Virtual Reality Miljö

In recent years, two-photon imaging has become an invaluable tool in neuroscience, as it allows for chronic measurement of the activity of genetically ...

Quantitative Assessment of Cortical Auditory-tactile Processing in Children with Disabilities

Kvantitativ bedömning av kortikal Auditory-taktil bearbetning hos barn med funktionshinder

Objective and easy measurement of sensory processing is extremely difficult in nonverbal or vulnerable pediatric patients. We developed a new methodology ...

Measurement of Fronto-limbic Activity Using an Emotional Oddball Task in Children with Familial High Risk for Schizophrenia

Mätning av Fronto-limbiska aktivitet Använda en Emotional Oddball uppgift hos barn med Familial hög risk för schizofreni

Adolescence is a critical developmental period where the early symptoms of schizophrenia frequently emerge. First-degree relatives of people with ...

Flat-floored Air-lifted Platform: A New Method for Combining Behavior with Microscopy or Electrophysiology on Awake Freely Moving Rodents

Platt-golv Luft lyfte Plattform: En ny metod för att kombinera Beteende med mikroskopi eller elektrofysiologi på Awake Fritt Moving Gnagare

It is widely acknowledged that the use of general anesthetics can undermine the relevance of electrophysiological or microscopical data obtained from a ...

The Modified Hole Board - Measuring Behavior, Cognition and Social Interaction in Mice and Rats

Den modifierade Hole Board - Mätning Beteende, Kognition och social interaktion i möss och råttor

This protocol describes the modified hole board (mHB), which combines features from a traditional hole board and open field and is designed to measure ...

Simultaneous Transcranial Alternating Current Stimulation and Functional Magnetic Resonance Imaging

Samtidig transkraniell växelströmsstimulering och funktionell magnetisk resonansbildning

Transcranial alternating current stimulation (tACS) is a promising tool for noninvasive investigation of brain oscillations. TACS employs ...

Reversible Cooling-induced Deactivations to Study Cortical Contributions to Obstacle Memory in the Walking Cat

Reversibel kylning-inducerad avaktiveringar att studera kortikala bidrag till hinder minne i vandrande katt

On complex, naturalistic terrain, sensory information about an environmental obstacle can be used to rapidly adjust locomotor movements for avoidance. For ...

A Wireless, Bidirectional Interface for In Vivo Recording and Stimulation of Neural Activity in Freely Behaving Rats

A Wireless, Bidirectional Interface for In Vivo Recording and Stimulation of Neural Activity in Freely Behaving Rats

En trådlös, dubbelriktad Interface för In Vivo inspelning och stimulering av Neural aktivitet i fritt bete råtta

In vivo electrophysiology is a powerful technique to investigate the relationship between brain activity and behavior at a millisecond and micrometer ...