Name: multi-layer cortical ca2+ imaging in freely moving mice with prism probes and miniaturized fluorescence microscopy
Uploaded: 2017-06-13T12:30:00
Duration: 10 min 35 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multi-layer Cortical Ca2+ Imaging in Freely Moving Mice with Prism Probes and Miniaturized Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Yazarlar, Howard Hughes Tıp Enstitüsünün Janelia Araştırma Kampüsü&#39;ndeki Genetik Olarak Kodlanmış Nöronal Gösterge ve Efekt (GENIE) Projesinden V. Jayaraman, DS Kim, LL Looger ve K. Svoboda&#39;ya, AAV1-GCaMP6f&#39;nin cömert bağışlarından dolayı teşekkür etmek istiyorlar Pennsylvania Üniversitesi Vektörel Çekirdek. Ayrıca, konform mikroskopi hizmetleri için NIH NS069375 tarafından desteklenen Stanford Üniversitesi&#39;ndeki A. Olson ve Neuroscience Mikroskopi Çekirdeğine teşekkür etmek istiyorlar.

<ol>
	<li>McConnell, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+decision-making+in+the+mammalian+cerebral+cortex.">Development and decision-making in the mammalian cerebral cortex.</a> Brain Res. 472 (1), 1-23 (1988).</li><li>Kwon, S. E., Yang, H., Minamisawa, G., O'Connor, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensory+and+decision-related+activity+propagate+in+a+cortical+feedback+loop+during+touch+perception.">Sensory and decision-related activity propagate in a cortical feedback loop during touch perception.</a> Nat. Neurosci. 19 (9), 1243-1249 (2016).</li><li>Miller, E. K., Cohen, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrative+theory+of+prefrontal+cortex+function.">An integrative theory of prefrontal cortex function.</a> Annu. Rev. Neurosci. 24, 167-202 (2001).</li><li>Bailey, M. R., Simpson, E. H., Balsam, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+substrates+underlying+effort,+time,+and+risk-based+decision+making+in+motivated+behavior.">Neural substrates underlying effort, time, and risk-based decision making in motivated behavior.</a> Neurobiol. Learn. Mem. 133, 233-256 (2016).</li><li>Dehaene, S., Changeux, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reward-dependent+learning+in+neuronal+networks+for+planning+and+decision+making.">Reward-dependent learning in neuronal networks for planning and decision making.</a> Prog. Brain Res. 126, 217-229 (2000).</li><li>Ferenczi, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prefrontal+cortical+regulation+of+brainwide+circuit+dynamics+and+reward-related+behavior.">Prefrontal cortical regulation of brainwide circuit dynamics and reward-related behavior.</a> Science. 351 (6268), aac9698 (2016).</li><li>Anomal, R. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+Processing+in+the+Primary+Auditory+Cortex+of+an+Animal+Model+of+Autism.">Impaired Processing in the Primary Auditory Cortex of an Animal Model of Autism.</a> Front. Sys. Neurosci. 9, 158 (2015).</li><li>Pauls, D. L., Abramovitch, A., Rauch, S. L., Geller, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obsessive-compulsive+disorder:+an+integrative+genetic+and+neurobiological+perspective.">Obsessive-compulsive disorder: an integrative genetic and neurobiological perspective.</a> Nat. Rev. Neurosci. 15 (6), 410-424 (2014).</li><li>Ziv, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+dynamics+of+CA1+hippocampal+place+codes.">Long-term dynamics of CA1 hippocampal place codes.</a> Nat. Neurosci. 16 (3), 264-266 (2013).</li><li>Jennings, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+hypothalamic+network+dynamics+for+appetitive+and+consummatory+behaviors.">Visualizing hypothalamic network dynamics for appetitive and consummatory behaviors.</a> Cell. 160 (3), 516-527 (2015).</li><li>Betley, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurons+for+hunger+and+thirst+transmit+a+negative-valence+teaching+signal.">Neurons for hunger and thirst transmit a negative-valence teaching signal.</a> Nature. 521 (7551), 180-185 (2015).</li><li>Sun, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+speed+dependence+of+entorhinal+island+and+ocean+cells,+including+respective+grid+cells.">Distinct speed dependence of entorhinal island and ocean cells, including respective grid cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 112 (30), 9466-9471 (2015).</li><li>Kitamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entorhinal+Cortical+Ocean+Cells+Encode+Specific+Contexts+and+Drive+Context-Specific+Fear+Memory.">Entorhinal Cortical Ocean Cells Encode Specific Contexts and Drive Context-Specific Fear Memory.</a> Neuron. 87 (6), 1317-1331 (2015).</li><li>Pinto, L., Dan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-Type-Specific+Activity+in+Prefrontal+Cortex+during+Goal-Directed+Behavior.">Cell-Type-Specific Activity in Prefrontal Cortex during Goal-Directed Behavior.</a> Neuron. 87 (2), 437-450 (2015).</li><li>Cox, J., Pinto, L., Dan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+imaging+of+sleep-wake+related+neuronal+activity+in+the+dorsal+pons.">Calcium imaging of sleep-wake related neuronal activity in the dorsal pons.</a> Nat. Comm. 7, 10763 (2016).</li><li>Resendez, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+cortical,+subcortical+and+deep+brain+neural+circuit+dynamics+during+naturalistic+mammalian+behavior+with+head-mounted+microscopes+and+chronically+implanted+lenses.">Visualization of cortical, subcortical and deep brain neural circuit dynamics during naturalistic mammalian behavior with head-mounted microscopes and chronically implanted lenses.</a> Nat. Protoc. 11 (3), 566-597 (2016).</li><li>Hooks, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+cortical+and+thalamic+input+to+pyramidal+neurons+in+mouse+motor+cortex.">Organization of cortical and thalamic input to pyramidal neurons in mouse motor cortex.</a> The J. Neurosci. 33 (2), 748-760 (2013).</li><li>Masamizu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+distinct+layer-specific+dynamics+of+cortical+ensembles+during+learning+of+a+motor+task.">Two distinct layer-specific dynamics of cortical ensembles during learning of a motor task.</a> Nat. Neurosci. 17 (7), 987-994 (2014).</li><li>Rowland, D. C., Moser, M. -. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+cortical+modules+to+memories.">From cortical modules to memories.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 24 (1), 22-27 (2014).</li><li>Ghosh, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Miniaturized+integration+of+a+fluorescence+microscope.">Miniaturized integration of a fluorescence microscope.</a> Nat. Methods. 8 (10), 871-878 (2011).</li><li>Mukamel, E. A., Nimmerjahn, A., Schnitzer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+analysis+of+cellular+signals+from+large-scale+calcium+imaging+data.">Automated analysis of cellular signals from large-scale calcium imaging data.</a> Neuron. 63 (6), 747-760 (2009).</li><li>Andermann, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+cellular+imaging+of+entire+cortical+columns+in+awake+mice+using+microprisms.">Chronic cellular imaging of entire cortical columns in awake mice using microprisms.</a> Neuron. 80 (4), 900-913 (2013).</li><li>Goldey, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removable+cranial+windows+for+long-term+imaging+in+awake+mice.">Removable cranial windows for long-term imaging in awake mice.</a> Nat. Protoc. 9 (11), 2515-2538 (2014).</li><li>Chia, T. H., Levene, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+deep+cortical+layers+using+a+microprism.">In vivo imaging of deep cortical layers using a microprism.</a> J. Vis. Exp. (30), (2009).</li><li>Chia, T. H., Levene, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microprisms+for+in+vivo+multilayer+cortical+imaging.">Microprisms for in vivo multilayer cortical imaging.</a> J. Neurophysiol. 102 (2), 1310-1314 (2009).</li><li>Chia, T. H., Levene, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-layer+in+vivo+imaging+of+neocortex+using+a+microprism.">Multi-layer in vivo imaging of neocortex using a microprism.</a> Cold Spring Harb. Protoc. 2010 (8), (2010).</li><li>Low, R. J., Gu, Y., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+resolution+optical+access+to+brain+regions+in+fissures:+imaging+medial+prefrontal+cortex+and+grid+cells+in+entorhinal+cortex.">Cellular resolution optical access to brain regions in fissures: imaging medial prefrontal cortex and grid cells in entorhinal cortex.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 111 (52), 18739-18744 (2014).</li><li>Zeisel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+structure.+Cell+types+in+the+mouse+cortex+and+hippocampus+revealed+by+single-cell+RNA-seq.">Brain structure. Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq.</a> Science. 347 (6226), 1138-1142 (2015).</li><li>Hawrylycz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inferring+cortical+function+in+the+mouse+visual+system+through+large-scale+systems+neuroscience.">Inferring cortical function in the mouse visual system through large-scale systems neuroscience.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 113 (27), 7337-7344 (2016).</li><li>Petrof, I., Viaene, A. N., Sherman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+the+primary+somatosensory+cortex+projection+to+the+primary+motor+cortex+in+the+mouse.">Properties of the primary somatosensory cortex projection to the primary motor cortex in the mouse.</a> J. Neurophysiol. 113 (7), 2400-2407 (2015).</li><li>Aronoff, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-range+connectivity+of+mouse+primary+somatosensory+barrel+cortex.">Long-range connectivity of mouse primary somatosensory barrel cortex.</a> Euro. J. Neurosci. 31 (12), 2221-2233 (2010).</li><li>Rogan, S. C., Roth, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remote+control+of+neuronal+signaling.">Remote control of neuronal signaling.</a> Pharma. Rev. 63 (2), 291-315 (2011).</li><li>Berdyyeva, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zolpidem+reduces+hippocampal+neuronal+activity+in+freely+behaving+mice:+a+large+scale+calcium+imaging+study+with+miniaturized+fluorescence+microscope.">Zolpidem reduces hippocampal neuronal activity in freely behaving mice: a large scale calcium imaging study with miniaturized fluorescence microscope.</a> PloS One. 9 (11), e112068 (2014).</li></ol>

Yazarlar, gazetenin politikasını okudular ve aşağıdaki rekabet uyuşmazlıklarına sahip oldular: SG, SO ve VC&#39;nin Inscopix&#39;te ücretli çalışanları var.

Uyanıklık davranışı sırasında nöral devre aktivitesini anlamak, sağlık ve hastalıkta beyin fonksiyonunu etkin bir şekilde incelemek için gerekli olan hayati bir nevrofizyolojik araştırmanın seviyesidir. Korteks uyanık davranış bağlamında çalışmak için özellikle önemli bir bölgedir çünkü birçok hayati duyu, bilişsel ve yürütücü işlevlerde önemli rol oynar 28 , 29 . Korteksin korteksdeki temel işlevsel birimi olduğu düşünülür ve kortikal hücrelerin popülasyon düzeyindeki aktivitelerinin sütundaki fiziksel konumlarına göre farklılık gösterdiği bilinir. Örneğin, somatosensoryal korteksteki katmanlardaki 2/3 katmanlı eksitatör nöronlar öncelikle diğer neokortikal bölgelere yönelir ve diğer korteks ağlarını 30 modüle eder, buna karşın daha derin tabakalardaki hücreler esas olarak talamus 31 gibi kortikal bölgelere yansıtılır. Yüz etkinliklerinin kaydedilmesiÖnceden belirlenmiş kortikal hücrelerin eş zamanlı olarak serbestçe davrandıklarında farklı lamina boyunca aynı anda ve güvenilir şekilde kortikal bilgi akışı konusundaki anlayışımızı ilerleteceğini ve kortikal sütunların gerçek zamanlı davranışsal bilgi ve görevle ilişkili zamana bağlı bilgi ile daha ince fonksiyonel diseksiyona izin verdiğini, ölçekler. Bu seviyedeki sinir devresi verilerini toplamak, serbestçe davranıyor konularda (veya istenen baş-sabit konular) büyük ölçekli Ca 2+ görüntülemeyi gerçekleştirmek için etkin ve düzenli bir minyatür mikroskop platformu kullanılarak mümkün hale gelir. Genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergeleri ile hücre tipi spesifik hedeflemeyi etkinleştirmek ve kronik implante edilmiş bir prizma probu tarafından sağlanan çok katmanlı bir görüş alanını görüntülerken kullanılan bu protokol, pek çok olası uygulama arasında bir vaka araştırmıştır: farelerde somatosensoriyel kortikal işlemedeki laminar farklılıkların gözlenmesi Fiziksel olarak yeni bir cisim ile etkileşimde bulunur ( Şekil 5 ).Bu, uyanıkken çoklu korteks tabakalarını çalışma özgürlüğü içinde davranan bu tür hücre tipine özgü, in vivo yaklaşımın ilk prosedürel örneğidir ve aktif beyindeki laminer yapıları anlamak için mevcut deneysel yöntemlerin spektrumunu genişletir. Bu tekniğin prizma probu tarafından sağlanan periskopik görüş alanı, doğrudan ilgi alanına doğru doku korunması istenildiğinde diğer beyin yapılarına uygulanabilir. Örneğin, CA3 görüntüleme, hipokampal fonksiyonun kesintiye uğramadan başarılabilir. Ca 2+ aktivitesini görüntüleme için Prism probuna dayalı yaklaşım, bir mikro prizmanın kortekse fiziksel olarak yerleştirilmesini ve kalıcı bir şekilde implantasyonunu gerektirir; bu, lens probunun yerleştirildiği bir kortikal lezyonun yaratılmasına denktir. Bu, apikal dendritlerin ve süreçlerin kesilmesi de dahil olmak üzere, lokal sinirsel devrelerde bozulmalara neden olabilir. TOnun prosedürü aynı zamanda bölgedeki glial hücrelerin ilk kez aktivasyonuna neden olur, ancak bunun prizma yüzünden yaklaşık 150 mikron dokuya lokalize edilmesi ve beynin iyileşmesi sonrasında düşmesi beklenir22. Deney planlanırken bu tekniğin normal devre anatomisini ve / veya hayvanların davranışını etkileyip etkilemeyeceğini düşünmek çok önemlidir. Davranışsal kontrol grupları her zaman karıştırılarak deneysel sonuç üretebilecek temel davranışlarda önemli bir değişiklik olmadığından emin olunması için yürütülmelidir. Sinirsel farmakolojik manipülasyona sahip bu minyatür mobil Ca 2+ görüntüleme tekniğini, çeşitli bilişsel, sosyal, motor veya intrinsik davranış parametrelerini kullanarak ve diğer fizyolojik ölçümlerle birleştirerek sinirsel devrelerin davranış ve sinyaldeki işlevsel rollerini anlamaya odaklanan çalışmaları derinleştirebilir ve zenginleştirebilir Işleme 32 . Bastırma veya aktiviteİlaçlar tarafından modüle edilen bazı yolların ationu, bu teknolojiyi kullanarak kolayca incelenebilen ilişkili davranışları etkileyebilir 33 . Kalsiyum göstergesinin hedeflemesini değiştirerek farklı hücre türlerine dalmak, başka güçlü ve kullanışlı bir uygulamadır ve çeşitli sinirsel devre sorularını çözmek için birçok deneysel araç kombinasyonuna olanak tanır.

Korteks dikkat, duyusal algılama ve yukarıdan aşağıya doğru bilişsel kontrol 1 , 2 , 3&#39;ten motivasyon, ödül ve bağımlılık yolları 4 , 5&#39;e kadar bir çok karmaşık zihinsel ve davranışsal işlevin önemli bir oyuncusu. İşlevinin altında yatan hesaplama süreçlerini anlamak, birçok zihinsel ve davranışsal bozukluğun daha iyi klinik anlayışını sağlamak için önemli bir hedeftir. Birçok psikiyatrik hastalık kuramı, kortikal sinirsel devre disfonksiyonu ya da discoordinasyonun şizofreni 6 , otizm 7 ya da obsesif-kompülsif bozukluk gibi koşulların ayırıcı özelliklerinden biri olan bilişsel ve davranışsal anormallikler altında yattığı fikrinin etrafında toplanmaktadır. Böylece, toplum düzeyinde sinir aktivitesi verileri co eldeEşzamanlı davranışsal bilgi bağlamında rtical devreler çok önemlidir ve ideal olarak ince sinirsel devre diseksiyonu için spesifik hücre tiplerini hedef alabilir. İmplante edilebilir gradyan refraktif indeks (GRIN) mikrolensiyonlarıyla birlikte küçültülmüş mikroskoplar, korteks 14 , 15 , 16 da dahil olmak üzere olası beyin bölgelerinden 9 , 10 , 11 , 12 , 13 çeşitliliğinden serbestçe hareket eden şartlar altında nöronal topluluklara optik erişim sağlar. Genetik olarak kodlanmış kalsiyum indikatörleriyle birleştirilmiş bir mobil mikroskopi sistemi kullanarak birçok beyin bölgesindeki 9 günde haftada yüzlerce nöronun bulunduğu aynı hücresel popülasyonun tutarlı şekilde görüntülenmesi sağlanır veGenetik olarak viral vektör veya transjenik teknikler kullanılarak spesifik hücre tiplerini hedef almıştır. Korteks&#39;in farklı fonksiyonları desteklediği ve hücrelerin kortikal tabakasında 17 , 18 , 19 bulunan yerlerine bağlı olarak farklı beyin bölgelerine bağlandığı bilinmektedir, uyanık davrandıkları konularda eşzamanlı çok katmanlı sinirsel aktivite elde etmekle ilgileniyoruz. Burada korteksi çok katmanlı bir görünüm sunan implante edilmiş bir prizma probu ile eşleştirilmiş olan minyatür flüoresan mikroskop 20&#39;yi kullanarak günlerce serbestçe farları davrandıkça yüzlerce floresan etiketli nöronun nasıl görüntüleneceğini göstermektedir ( Şekil 1 ). Burada kullanılan prizma probu iki ayrı GRIN lensinden oluşur: bir prizma ve bir silindirik röle lensi ( Şekil 1 ). Mikroskoptaki ışık, flüoresan etiketliProbların prizma bölümünün hipotenüsünden yansıyan prizma probunun görüntüleme yüzü boyunca yer alan hücreler. Hücrelerden yayılan ışık aynı zamanda prizmanın hipotenüsünü yansıtır, mikroskopun amacı aracılığıyla toplanır ve mikroskopta sensöre ulaşır. Bu prosedürde kullanılan prizma probu standart stereotaksik ekipmanlarla kolay kullanım için uyarlanmıştır. Minyatür floresans mikroskopu 20 , tek hücreli çözünürlükte nöronal popülasyonlarda aksiyon potansiyelinden uyarılmış Ca 2+ geçişlerini saptar ve bu hücreler özellikle Ca 2+&#39; ya duyarlı genetik olarak kodlanmış fluoresan göstergelerle etiketlenir. Bu protokolde, viral bir vektöre (AAV1.CaMKII.GCaMP6f.WPRE.SV40) kodlanmış Ca 2+ göstergesi enjekte ediyoruz, bir prizma probu yerleştiriyoruz, mikroskopu taktıktan sonra, birden çok gün somatosensoriyel (S1 arka bacak) nöral aktivite verilerini elde ediyoruz Bir hayvandan maruz kalmaD) serbest araştırmalar sırasında yeni nesne yüzeylerine bırakın ( Şekil 2 ).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Neurostar Motorized 
			Ultra Precise Small Animal Stereotaxic Instrument</td>
			<td>Kopf</td>
			<td>Model 963SD</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereoscope</td>
			<td>Labomed</td>
			<td>Prima DNT</td>
			<td>Surgery and Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Rectal Thermistor Probe (.062&#34;/1.6mm diameter) - 1/4&#34; Jack</td>
			<td>FHC</td>
			<td>40-90-5D-02</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating Pad 5 X 12.5cm&#160;</td>
			<td>FHC</td>
			<td>40-90-2-07</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC Temperature Controller</td>
			<td>FHC</td>
			<td>40-90-8D</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsyringe Pump</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>UMP3 model; serial 155788 F110</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoFil 10&#956;L Syringe</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>NANOFIL</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 G Beveled Tip Nanofil NDL 2PK</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>NF35BV-2</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omnidrill35, 115-230V</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>503598</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Burrs for Micro Drill</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>19007-05</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nVista</td>
			<td>Inscopix</td>
			<td>100-001048</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV1.CaMKII.GCaMP6f.WPRE.SV40</td>
			<td>Penn Vector Core</td>
			<td>AV-1-PV3435</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketoprofen</td>
			<td>Victor Medical</td>
			<td>5487</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carprofen</td>
			<td>Victor Medical</td>
			<td>1699008&#160;</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Victor Medical</td>
			<td>1001054</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelfoam (Patterson Veterinary Supply Inc Gelfoam Sponge 12cmx7mm)</td>
			<td>Pfizer (Fisher Scientific)</td>
			<td>NC9841478</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5/45 forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-35</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-30</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting knives</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10055-12</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProView Implant Kit</td>
			<td>Inscopix</td>
			<td>100-000756</td>
			<td>Surgery and Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProView Prism Probe 1.0mm-Dia. ~4.3mm Length</td>
			<td>Inscopix</td>
			<td>100-000592</td>
			<td>Surgery and Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kwik-Sil adhesive pack of 2</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>KWIK-SIL</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kwik-Cast Sealant</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>KWIK-CAST</td>
			<td>Surgery and Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniature Optical Mounting Post</td>
			<td>Newport</td>
			<td>M-TSP-3</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Baseplate</td>
			<td>Inscopix</td>
			<td>BPL-2</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Baseplate Cover</td>
			<td>Inscopix</td>
			<td>BPC-2</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multi-layer cortical ca2+ imaging in freely moving mice with prism probes and miniaturized fluorescence microscopy

In vivo devreler ve hücresel düzeydeki fonksiyonel görüntüleme beyindeki hareketleri anlamada kritik bir araçtır. İki fotonlu mikroskop ile fare kortikal nöronlarının yüksek çözünürlüklü görüntülemesi, korteks yapısı, fonksiyonu ve plastisite ile ilgili benzersiz bilgiler sağlamıştır. Bununla birlikte, bu çalışmalar baş sabit hayvanlarla sınırlıdır ve bu çalışma için olan davranışsal karmaşıklığı büyük ölçüde azaltır. Bu yazıda, serbestçe davranan farelerde çoklu korteks tabakaları boyunca hücresel çözünürlüğe sahip kronik floresan mikroskobu gerçekleştirmek için bir prosedür açıklanmaktadır. Birkaç gün boyunca yeni bir nesne arama görevinde bulunan fare, somatosensor korteksin çok katmanlarında yüzlerce nöronun kalsiyum dinamiklerini aynı anda görselleştirmek ve kaydetmek için implante edilmiş bir prizma probu ile birlikte entegre bir minyatür floresan mikroskop kullandık. Bu teknik, farklı davranış türlerine göre farklı hayvan türlerinde diğer beyin bölgelerine uyarlanabiliraradigms.

Burada özetlenen protokol, prizm probları kullanarak serbestçe davranan farelerde yüzlerce kortikal nörondan boyuna çok katmanlı Ca 2+ görüntülemeyi gerçekleştirmenin etkili ve etkili bir yolunu anlatmaktadır ( Şekil 1 ). Çok katmanlı kortikal görüntülemeye yönelik önceki yaklaşımlar başlıca sabit hayvanlar 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 ile sınırlandırılmıştır. Bu verilerin seviyesini özgürce davranan bir bağlamda elde edebilmek için davranış esnekliği için minyatür bir mikroskop platformu kullanıldı; Genetik olarak kodlanmış bir kalsiyum indikatörü (GCaMP6f) belirli bir hücre popülasyonunu (kortekste CAMKII + hücreleri) hedeflemek için kullanıldı; Ve bir prizma probu, kronik, çok tabakalı bir görüş alanı sağlamak için seçildi. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; Hayvanı görüntüleme için hazırlama iş akışını gösterdik. Etiketli hücrelere optik erişim sağlamak için kronik olarak bir prizma probu implante etmeden önce, uygun bir kalsiyum indikatörü kodlayan bir viral vektör kortekse enjekte edildi ( Şekil 2 , Adım 1) ( Şekil 2 , Adım 2). Görüntüleme oturumları sırasında mikroskop yerleştirilmesi için güvenli, geçici bir platform görevi gören bir taban plakası daha sonra hayvanın başının üzerine yerleştirildi ( Şekil 2 , Adım 3), çok hücreli katmanlar arasındaki kortikal aktivitenin uyanık bir davranış deneyselinde görselleştirilmesini sağladı Kurulum ( Şekil 2 , Adım 4). İstenen hücresel popülasyonun hedeflendiğinden emin olmak için, temsil eden bir fare için post-mortem bir koronal beyin bölümü, Şekil 3&#39;te prizma sondası kanalı ve görüş alanı GCaMP6f laboratuara göre işaretlenmiştirSomatosensoriyel kortekste Katman 2/3 ve 5&#39;de bulunan nöronlar. Açık alan (Gün 1), Nesnelerin Tanıtılması (Gün 2-4) ve Roman Nesnesi (Gün 5) olmak üzere üç farklı ortama maruz kaldığında uyanık sistemli görüntüleme sırasında somatosensor kortikal nöronların aktivitesi kaydedildi ( Şekil 4 ). Gün 1, fare herhangi bir nesneden yoksun bir davranış alanına yerleştirildi. 2-4. Günlerde fare, aynı iki dokusal açıdan farklı cisimler (bir jel yatağı ve bir ahşap blok) ile arenaya yerleştirildi. 5. gün, nesnelerden biri yeni bir nesneyle değiştirildi. Hayvan 5 gün boyunca her gün 20 dakika boyunca görüntülendi. Ca 2+ görüntü veri analiz yazılımı kullanılarak hücre ekstraksiyonunu takiben, hücre konumlarına karşılık gelen mekansal filtreler, mikroskop kayıt verilerinin ortalama floresan yoğunluğu projeksiyonu üzerine bindirildi( Şekil 5) . Beyaz kesikli çizgi, katmanları 2/3 ve 5 hücrelerini ayırır. Katmanların her birinden 5 hücreye karşılık gelen Ca 2+ izleri, hücrelerin ateşleme modelini iki farklı davranışsal bağlamda göstermektedir: Nesneleri Tanıma ve Roman Nesneye Maruz Kalma. Katman 2/3 hücreleri, fare yeni bir nesneye maruz kaldığı gün katman 5 hücreleriyle karşılaştırıldığında daha aktifti. Bu aynı zamanda, 1., 4. ve 5. günlerde tüm görüntü hücrelerinin eşikli ateşleme aktivitesini gösteren raster çizimlerden anlaşılmaktadır. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/55579/55579fig1.jpg" /> Şekil 1: Serbestçe hareket eden farelerde çoklu kortikal katmanların karşısındaki In Vivo Ca 2+ Görüntüleme. ( A ) Prizma prob özellikleri ve görüntüleme düzlemi gösterimi. Hipotenürün iç kısmındaki yansıtıcı kaplama, prizma probunun ekleme düzleminden 90 ° görüntüleme sağlar. Mercek cuFf, implantasyon prosedürünü düzene sokan ve implantasyon sırasında çevresel doku floresansının potansiyel olarak görüntülenmesine izin veren lens tutucusu ile bütünleşir ( B ) (i). Virüs enjeksiyon bölgesine göre prizma sondası kraniotomisinin ve bıçak kesiğinin yerleştirilmesi ve (ii) bıçak kesi ve virüs enjeksiyon bölgesine göre prizma sondasının düz tarafının konumunun gösterilmesi. ( C ) Fare korteksine yerleştirilen prizma probu vasıtasıyla tam alan içinde küçük bir alan için ışık yolunu gösteren in-vivo Ca 2+ görüntüleme düzeneğinin illüstrasyonu. ( D ) Prizma probu takılması sırasında örnek alan. Minyatür mikroskop, prizma probunu tutan lens tutucusuna tutturularak prizma probu kurulumu sırasında virüs ifadesinin kontrol edilmesine izin verir. ( E ) GCaMP6f etiketli S1 hücrelerinin çok katmanlı kortikal görüntülemesi için mikroskop ile prizma probu entegrasyonu. F Örnek alanTaban plakası kurulumu sırasında. Açık kan damarı deseni, ham görüntüde bazı hücrelerle taban plakası kurulumu sırasında görülür. Toplama yazılımı penceresinde DF / F açıldığında daha fazla hücre açıkça görülür. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55579/55579fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/55579/55579fig2.jpg" /> Şekil 2: Prizma Prob İmplantasyonu ve Mikroskop Kurulumu için İş Akışı Olaylarının Zaman Çizelgesi Gösterilen Şematik. Hafta sayısı, X ekseni üzerinde ve Y ekseni boyunca işlemlerin iş akışı adımları üzerinde gösterilir. ( A ) Aynı dorso-ventral eksende fare somatosensoriyel korteksin çok katmanlarını etiketlemek için viral enjeksiyon (AAV1.CaMKII.GCaMP6f.WPRE.SV40) gösteren grafik. ( B ) virüs enjeksiyonlarından 2 hafta sonra, bir prizma probuE, virüs enjeksiyon bölgelerine paralel olan bir eksene yerleştirilir. ( C ) Prizma probu implantasyonundan yaklaşık bir hafta sonra, hayvanın mikroskop ile ekspresyonu kontrol edilir ve bir hücre popülasyonu görülebiliyorsa kafaya bir taban plakası monte edilir. ( D ) Hayvan, daha sonra, ilgili davranışsal görevler sırasında kronik görüntüleme için hazırdır (Mouse clip art, UW-Madison Biochemistry MediaLab&#39;ın izninin ardından değiştirilmiştir). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55579/55579fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/55579/55579fig3.jpg" /> Şekil 3: Prism Probe Yerinin ve GCaMP İfadesinin Postmostem Histolojik Onaylaması. ( A ) Prizma prob yolunu gösteren ve görüntüleme tarafı bakan temsili fare beynindeki koronal kesitGCaMP6f ifade eden hücreleri (AAV1.CaMKII.GCaMP6f nöronlarda katmanlar 2/3 ve 5&#39;de ifade edilir). ( B ) DAPI için boyanmayı takiben aynı koronal beyin bölümü. Ölçek çubuğu = 250 μm ( C ) Somatosensoriyel kortekste GCaMP6f eksprese eden hücreler ışığında büyütülmüştür. Ölçek çubuğu = 100 μm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55579/55579fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4" src="/files/ftp_upload/55579/55579fig4.jpg" /> Şekil 4: Habitüasyon sırasında Fare Aktivitesi, Tanılama ve Yeni Nesne Pozlama Testi, Video Yazılımı kullanılarak Video İzlenmiştir. ( A ) 1. Gün, hayvan herhangi bir nesneden yoksun bir davranış alanına yerleştirildi (Açık Alan). ( B ) 2-4. Günlerde aynı iki dokusal açıdan farklı nesne (jel ped ve ahşap blok) arenaya yerleştirildi (Object Familiarization). ( C ) 5. günde, nesnelerden biri yeni bir nesneyle (kum kağıdı ile ahşap blok) değiştirildi (Novel Object Exposure). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55579/55579fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 5" src="/files/ftp_upload/55579/55579fig5.jpg" /> Şekil 5: Mikroskop ile Görüntülenen Temsilci Bir Farenin Somatosensor Korteksinin Yüzeysel ve Derin Katmanlarından Kalsiyum Dinamiği. ( A ) Nöronal uzaysal filtrelerin (yeşil bloklar) ve prizma tarama alanı üzerinden mikroskop kayıtlarının ortalama floresans yoğunluğu projeksiyonunun birleştirilmiş hali. Beyaz kesikli çizgi ile gösterilen supragranular ve infragranular tabakalar arasındaki sınır. Ölçek çubuğu = 100 μm. ( B ) Yüzeysel ve derin tabakalı beş örnek hücrenin (dolu mavi ve kırmızı cTemel A ve bağımsız bileşen analizini takiben floresansın standart sapması birimleri belirtir. Yatay ölçek çubuğu 50 s ve dikey ölçek çubuğu 10 SD ( C ) Açık alan, Nesne Tanıtımı ve Roman nesnesi araştırması üzerinde gösterilen yüzeysel (katmanlar 2/3) ve derin katmanlardan (katman 5) hücrelerin raster çizimi. Ölçek çubuğu = 100 s. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55579/55579fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Multi-layer Cortical Ca2+ Imaging in Freely Moving Mice with Prism Probes and Miniaturized Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Multi-layer Cortical Ca2+ Imaging in Freely Moving Mice with Prism Probes and Miniaturized Fluorescence Microscopy

Burada, serbest hareket eden farelerde çoklu korteks tabakaları boyunca hücresel çözünürlük ile büyük ölçekli Ca 2+ görüntülemenin gerçekleştirilmesi için bir prosedür sunuyoruz. Yüzlerce aktif hücre, implante edilmiş bir prizma probu ile birleştirilmiş minyatür, başa monte mikroskop kullanarak eş zamanlı olarak gözlemlenebilir.

Çok Katlı Kortikal Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Prizmatik Problar ve Minyatür Floresan Mikroskopi ile Serbestçe Hareketli Fare Görüntüleme

In vivo circuit and cellular level functional imaging is a critical tool for understanding the brain in action. High resolution imaging of mouse cortical ...

Research

JoVE Journal

Behavior

Multi-layer Cortical Ca2+ Imaging in Freely Moving Mice with Prism Probes and Miniaturized Fluorescence Microscopy

Functional Magnetic Resonance Imaging (fMRI) with Auditory Stimulation in Songbirds

Functional Magnetic Resonance Imaging fMRI with Auditory Stimulation in Songbirds

Songbirds İşitsel Uyarım ile Fonksiyonel Manyetik Rezonans Görüntüleme (fMRI)

The neurobiology of birdsong, as a model for human speech, is a pronounced area of research in behavioral neuroscience. Whereas electrophysiology and ...

Long-term Potentiation of Perforant Pathway-dentate Gyrus Synapse in Freely Behaving Mice

Serbestçe Fareler davranmak içinde delici yol-kıvrımlarının Synapse Uzun vadeli Potentiation

Studies of long-term potentiation of synaptic efficacy, an activity-dependent synaptic phenomenon having properties that make it attractive as a potential ...

Two-photon Calcium Imaging in Mice Navigating a Virtual Reality Environment

Sanal Gerçeklik Çevre gezinme Farelerde iki foton Kalsiyum Görüntüleme

In recent years, two-photon imaging has become an invaluable tool in neuroscience, as it allows for chronic measurement of the activity of genetically ...

Quantitative Assessment of Cortical Auditory-tactile Processing in Children with Disabilities

Engelli Çocuklarda Kortikal İşitsel-dokunsal İşleme Kantitatif Değerlendirilmesi

Objective and easy measurement of sensory processing is extremely difficult in nonverbal or vulnerable pediatric patients. We developed a new methodology ...

Measurement of Fronto-limbic Activity Using an Emotional Oddball Task in Children with Familial High Risk for Schizophrenia

Şizofreni ailesel Riskli Çocuklarda Duygusal Oddball Görev Kullanımı Fronto-limbik Faaliyet Ölçümü

Adolescence is a critical developmental period where the early symptoms of schizophrenia frequently emerge. First-degree relatives of people with ...

Flat-floored Air-lifted Platform: A New Method for Combining Behavior with Microscopy or Electrophysiology on Awake Freely Moving Rodents

Düz zeminli Hava kaldırdı Platform: Yeni Bir Yöntem Awake üzerinde Mikroskopi veya Elektrofizyoloji ile davranışı birleştiren için serbestçe Kemirgenler Hareketli

It is widely acknowledged that the use of general anesthetics can undermine the relevance of electrophysiological or microscopical data obtained from a ...

The Modified Hole Board - Measuring Behavior, Cognition and Social Interaction in Mice and Rats

Modifiye Delik Kurulu - Fareler ve Sıçanlarda Davranışı, Biliş ve Sosyal Etkileşim Ölçme

This protocol describes the modified hole board (mHB), which combines features from a traditional hole board and open field and is designed to measure ...

Simultaneous Transcranial Alternating Current Stimulation and Functional Magnetic Resonance Imaging

Eşzamanlı Transkranial Alternatif Akım Uyarma ve Fonksiyonel Manyetik Rezonans Görüntüleme

Transcranial alternating current stimulation (tACS) is a promising tool for noninvasive investigation of brain oscillations. TACS employs ...

Reversible Cooling-induced Deactivations to Study Cortical Contributions to Obstacle Memory in the Walking Cat

Kortikal katkıları engel bellek yürüyen kedi içinde çalışmaya geri dönüşümlü soğutma kaynaklı deaktivasyon

On complex, naturalistic terrain, sensory information about an environmental obstacle can be used to rapidly adjust locomotor movements for avoidance. For ...

A Wireless, Bidirectional Interface for In Vivo Recording and Stimulation of Neural Activity in Freely Behaving Rats

A Wireless, Bidirectional Interface for In Vivo Recording and Stimulation of Neural Activity in Freely Behaving Rats

Kablosuz, Vivo içinde kayıt ve fareler serbestçe davranışlar içinde sinirsel aktivite uyarılması için çift yönlü arayüzü

In vivo electrophysiology is a powerful technique to investigate the relationship between brain activity and behavior at a millisecond and micrometer ...