Name: lipid droplet isolation for quantitative mass spectrometry analysis
Uploaded: 2017-04-17T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Lipid Droplet Isolation for Quantitative Mass Spectrometry Analysis at JoVE.com

نشكر R. Bartenschlager (جامعة هايدلبرغ) ليبني JC1، CM رايس (جامعة روكفلر) للخلايا Huh7.5، J مكلوشلان (مجلس البحوث الطبية وحدة علم الفيروسات) لبناء، T واكيتا (المعهد الوطني للJFH1 الأمراض المعدية، واليابان) لJFH1، وB وبستر ووك غرين (معهد جلادستون لعلم الفيروسات والمناعة) ليبني مراسل HCVcc. وأيد هذا العمل من جانب صناديق من DFG (HE 6889 / 2-1 (EH)، INST 337 / 15-1 2013، وINST 337 / 16-1 2013 (HS)). ويدعم معهد هاينريش بيت، معهد ليبنيز لعلم الفيروسات التجريبي من قبل الحرة ومدينة هامبورغ ووزارة الصحة الاتحادية. وكان الممولين أي دور في تصميم الدراسة وجمع البيانات وتحليلها، قرار نشر، أو في الإعداد للمخطوطة.

1. إعداد وسائل الإعلام عن مستقرة النظائر وسمها مع الأحماض الأمينية في الثقافة الخليوي (SILAC) ملاحظة: هنا، والكميات كيت SILAC البروتين - DMEM تستكمل مع 50 ملغ من 13 C 6 L-أرجينين، حمض الهيدروكلوريك كانت تستخدم لوضع العلامات SILAC. يتم ...

<ol>
	<li>Thiam, A. R., Farese, R. V., Walther, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biophysics+and+cell+biology+of+lipid+droplets.">The biophysics and cell biology of lipid droplets.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (12), 775-786 (2013).</li><li>Welte, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+roles+for+lipid+droplets.">Expanding roles for lipid droplets.</a> Curr Biol. 25 (11), R470-R481 (2015).</li><li>Brasaemle, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thematic+review+series:+adipocyte+biology.+The+perilipin+family+of+structural+lipid+droplet+proteins:+stabilization+of+lipid+droplets+and+control+of+lipolysis.">Thematic review series: adipocyte biology. The perilipin family of structural lipid droplet proteins: stabilization of lipid droplets and control of lipolysis.</a> J Lipid Res. 48 (12), 2547-2559 (2007).</li><li>Choudhary, V., Ojha, N., Golden, A., Prinz, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+family+of+proteins+facilitates+nascent+lipid+droplet+budding+from+the+ER.">A conserved family of proteins facilitates nascent lipid droplet budding from the ER.</a> J Cell Biol. 211 (2), 261-271 (2015).</li><li>Kory, N., Farese, R. V., Walther, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Fat:+Mechanisms+of+Protein+Localization+to+Lipid+Droplets.">Targeting Fat: Mechanisms of Protein Localization to Lipid Droplets.</a> Trends Cell Biol. 26 (7), 535-546 (2016).</li><li>Hashemi, H. F., Goodman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+life+cycle+of+lipid+droplets.">The life cycle of lipid droplets.</a> Curr Opin Cell Biol. 33, 119-124 (2015).</li><li>Gao, Q., Goodman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lipid+droplet-a+well-connected+organelle.">The lipid droplet-a well-connected organelle.</a> Front Cell Dev Biol. 3, 49 (2015).</li><li>Herker, E., Ott, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+role+of+lipid+droplets+in+host/pathogen+interactions.">Emerging role of lipid droplets in host/pathogen interactions.</a> J Biol Chem. 287 (4), 2280-2287 (2012).</li><li>Wedemeyer, H., Dore, G. J., Ward, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimates+on+HCV+disease+burden+worldwide+-+filling+the+gaps.">Estimates on HCV disease burden worldwide - filling the gaps.</a> J Viral Hepat. 22 Suppl 1, 1-5 (2015).</li><li>Paul, D., Madan, V., Bartenschlager, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatitis+C+virus+RNA+replication+and+assembly:+living+on+the+fat+of+the+land.">Hepatitis C virus RNA replication and assembly: living on the fat of the land.</a> Cell Host Microbe. 16 (5), 569-579 (2014).</li><li>Lindenbach, B. D., Rice, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ins+and+outs+of+hepatitis+C+virus+entry+and+assembly.">The ins and outs of hepatitis C virus entry and assembly.</a> Nat Rev Microbiol. 11 (10), 688-700 (2013).</li><li>Barba, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatitis+C+virus+core+protein+shows+a+cytoplasmic+localization+and+associates+to+cellular+lipid+storage+droplets.">Hepatitis C virus core protein shows a cytoplasmic localization and associates to cellular lipid storage droplets.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (4), 1200-1205 (1997).</li><li>Shi, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatitis+C+virus+NS5A+colocalizes+with+the+core+protein+on+lipid+droplets+and+interacts+with+apolipoproteins.">Hepatitis C virus NS5A colocalizes with the core protein on lipid droplets and interacts with apolipoproteins.</a> Virology. 292 (2), 198-210 (2002).</li><li>Herker, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+hepatitis+C+virus+particle+formation+requires+diacylglycerol+acyltransferase-1.">Efficient hepatitis C virus particle formation requires diacylglycerol acyltransferase-1.</a> Nat Med. 16 (11), 1295-1298 (2010).</li><li>Camus, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diacylglycerol+acyltransferase-1+localizes+hepatitis+C+virus+NS5A+protein+to+lipid+droplets+and+enhances+NS5A+interaction+with+the+viral+capsid+core.">Diacylglycerol acyltransferase-1 localizes hepatitis C virus NS5A protein to lipid droplets and enhances NS5A interaction with the viral capsid core.</a> J Biol Chem. 288 (14), 9915-9923 (2013).</li><li>Miyanari, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lipid+droplet+is+an+important+organelle+for+hepatitis+C+virus+production.">The lipid droplet is an important organelle for hepatitis C virus production.</a> Nat Cell Biol. 9 (9), 1089-1097 (2007).</li><li>Boulant, S., Targett-Adams, P., McLauchlan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disrupting+the+association+of+hepatitis+C+virus+core+protein+with+lipid+droplets+correlates+with+a+loss+in+production+of+infectious+virus.">Disrupting the association of hepatitis C virus core protein with lipid droplets correlates with a loss in production of infectious virus.</a> J Gen Virol. 88 (Pt 8), 2204-2213 (2007).</li><li>Vogt, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplet-binding+protein+TIP47+regulates+hepatitis+C+Virus+RNA+replication+through+interaction+with+the+viral+NS5A+protein.">Lipid droplet-binding protein TIP47 regulates hepatitis C Virus RNA replication through interaction with the viral NS5A protein.</a> PLoS Pathog. 9 (4), e1003302 (2013).</li><li>Ploen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TIP47+plays+a+crucial+role+in+the+life+cycle+of+hepatitis+C+virus.">TIP47 plays a crucial role in the life cycle of hepatitis C virus.</a> J Hepatol. 58 (6), 1081-1088 (2013).</li><li>Ploen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TIP47+is+associated+with+the+hepatitis+C+virus+and+its+interaction+with+Rab9+is+required+for+release+of+viral+particles.">TIP47 is associated with the hepatitis C virus and its interaction with Rab9 is required for release of viral particles.</a> Eur J Cell Biol. 92 (12), 374-382 (2013).</li><li>Rosch, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Lipid+Droplet+Proteome+Analysis+Identifies+Annexin+A3+as+a+Cofactor+for+HCV+Particle+Production.">Quantitative Lipid Droplet Proteome Analysis Identifies Annexin A3 as a Cofactor for HCV Particle Production.</a> Cell Rep. 16 (12), 3219-3231 (2016).</li><li>Kwiatkowski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+extraction+of+proteins+from+tissues+using+desorption+by+impulsive+vibrational+excitation.">Ultrafast extraction of proteins from tissues using desorption by impulsive vibrational excitation.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 54 (1), 285-288 (2015).</li><li>Webster, B., Ott, M., Greene, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evasion+of+superinfection+exclusion+and+elimination+of+primary+viral+RNA+by+an+adapted+strain+of+hepatitis+C+virus.">Evasion of superinfection exclusion and elimination of primary viral RNA by an adapted strain of hepatitis C virus.</a> J Virol. 87 (24), 13354-13369 (2013).</li><li>Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-gel+digestion+for+mass+spectrometric+characterization+of+proteins+and+proteomes.">In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes.</a> Nat Protoc. 1 (6), 2856-2860 (2006).</li><li>Ting, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normalization+and+statistical+analysis+of+quantitative+proteomics+data+generated+by+metabolic+labeling.">Normalization and statistical analysis of quantitative proteomics data generated by metabolic labeling.</a> Mol Cell Proteomics. 8 (10), 2227-2242 (2009).</li><li>Brasaemle, D. L., Dolios, G., Shapiro, L., Wang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+proteins+associated+with+lipid+droplets+of+basal+and+lipolytically+stimulated+3T3-L1+adipocytes.">Proteomic analysis of proteins associated with lipid droplets of basal and lipolytically stimulated 3T3-L1 adipocytes.</a> J Biol Chem. 279 (45), 46835-46842 (2004).</li><li>Tingting, P., Caiyun, F., Zhigang, Y., Pengyuan, Y., Zhenghong, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subproteomic+analysis+of+the+cellular+proteins+associated+with+the+3'+untranslated+region+of+the+hepatitis+C+virus+genome+in+human+liver+cells.">Subproteomic analysis of the cellular proteins associated with the 3' untranslated region of the hepatitis C virus genome in human liver cells.</a> Biochem Biophys Res Commun. 347 (3), 683-691 (2006).</li><li>Ariumi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DDX3+DEAD-box+RNA+helicase+is+required+for+hepatitis+C+virus+RNA+replication.">DDX3 DEAD-box RNA helicase is required for hepatitis C virus RNA replication.</a> J Virol. 81 (24), 13922-13926 (2007).</li><li>Weinlich, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IGF2BP1+enhances+HCV+IRES-mediated+translation+initiation+via+the+3'UTR.">IGF2BP1 enhances HCV IRES-mediated translation initiation via the 3'UTR.</a> RNA. 15 (8), 1528-1542 (2009).</li></ol>

هنا، نحن تصف بروتوكول لعزل قطرات الدهون لتحليل الدهون قطرات بروتيوم الكمي لمقارنة التخصيب واستنزاف البروتينات المرتبطة قطرات الدهون في ظل ظروف ثقافة متنوعة، مثل الالتهابات الفيروسية. كطريقة بديلة، يمكن إجراء تحليل بروتيوم مع quantifications خالية من التسمية على أساس مجم?...

<html> قطرات الدهون هي غاية الحيوية هيولي (والنووية) عضيات الخلية تتكون من مجموعة أساسية من الدهون المحايدة (الدهون الثلاثية (TG) والكوليسترول استر (CE)) محاطة أحادي الطبقة من الدهون الفوسفاتية مع البروتينات جزءا لا يتجزأ 1. جميع أنواع الخلايا تنتج قطرات الدهون، ولكنها تختلف في الحجم والتكوين الدهون، والديكور البروتين. قطرات الدهون الوفاء وظائف متنوعة، بما في ذلك منصب الطاقة والسلائف غشاء الخزانات أو ودائع البروتين. وبالإضافة إلى ذلك، من خلال امتصاص الدهون، وأنها تحمي الخلايا من lipotoxicity، والدهون الإفراج كما يشير الجزيئات، ويشاركون في تدهور البروتين والشبكة الإندوبلازمية (ER) استجابات التوتر 2. على هذا النحو، ومجموعة من البروتينات ربط قطرات الدهون ويحكم جيلهم، وتدهور، والاتجار، والتفاعل مع العضيات الأخرى. ومن بين هذه الأسرة perilipin من البروتينات الدهنية قطرة ملزمة الحسنة النية (PLIN1-5)و &quot;&gt; 3. الدهون قطرات نشوء حيوي المرجح يبدأ في ER، حيث تحفيز الانزيمات-ER المقيمين تركيب الدهون المحايدة التي تتراكم داخل طبقة ثنائية الغشاء، وتشكيل عدسة الدهون المحايدة، وهي العملية التي كانت تصور في الآونة الأخيرة بشكل جيد في الخميرة 4. ثم ويعتقد أن غشاء الانحناء وارتفاع مستويات حمض ومادة ال diacylglycerol الفسفاتيديك لجذب البروتينات المشاركة في التركيب الحيوي فوسفورية، وتركيب وقت واحد من الدهون المحايدة الأساسية والدهون الفوسفاتية التدريع مطلوب لتوليد الدهون قطرات 5. الانزيمات إيواء المجالات عبر الغشاء الذي يقيم في ER تحفيز هذه العملية. التوسع إلى قطرات الدهون الكبيرة يتطلب النشاط من فئة مختلفة من الإنزيمات تجميع الدهون التي تؤوي على الحلزون متقابلة الزمر وبالتالي يمكن السفر من ER إلى قطرات الدهون. تعبئة الدهون من قطرات الدهون يحدث من خلال تفعيل المحلي للtriglyceridه ومادة ال diacylglycerol الليباز الليباز الدهنية الدهون الثلاثية (ATGL) وهرمون الليباز حساسة (HSL) أو عن طريق مسارات ذاتية البلعمة مختلفة، مثل الاقتصاد الكلي والاقتصاد microlipophagy أو الالتهام الذاتي 6 الوصيفة بوساطة. قطرات الدهون تتفاعل مع العضيات الخلوية الأخرى، مثل الميتوكوندريا (لبيتا للأكسدة والتوليف الدهن) وER (لتخليق الدهون والاتجار البروتين)، ولكن أيضا مع الجسيمات الحالة، الإندوسومات، والفجوات الناجمة عن البكتيريا داخل الخلايا 7. في الواقع البكتيريا والفيروسات والطفيليات حتى تستهدف قطرات الدهون للنسخ المتماثل والمثابرة، من بينها HCV 8. فيروس التهاب الكبد الوبائي هو أحد الأسباب الرئيسية للمراضة ذات الصلة الكبد والوفاة في جميع أنحاء العالم، وهو ما يمثل حوالي 0.5 مليون حالة وفاة سنويا 9. العدد الحقيقي للإصابات HCV غير معروف، ولكن تشير التقديرات الأخيرة التي 130-150٬000٬000 الناس مصابون بشكل مزمن. لا VACCINيوجد الإلكترونية، ولكن تمت الموافقة عليه مؤخرا مضادات الفيروسات المفعول المباشر زيادة كبيرة الاستجابات العلاجية مقارنة مع العلاج القائم على فيروسات القياسية. ومع ذلك، في جميع أنحاء العالم، من المرجح أن يقتصر علاج المرضى بسبب التكاليف الباهظة للعلاجات جديدة. ما يقرب من نصف جميع الأفراد المصابين المزمنين مع HCV تطوير مرض الكبد الدهني (تنكس دهني)، وهي حالة تتميز التراكم المفرط للقطرات الدهون في خلايا الكبد. ومن المثير للاهتمام، ظهرت قطرات الدهون أيضا العضيات الخلوية كما الحيوية للنسخ المتماثل HCV، خدمة مزعومة كمواقع التجمع الفيروسية 10، 11. في الخلايا المصابة HCV، جوهر البروتين الفيروسي وNS5A توطين لقطرات الدهون في عملية تعتمد على مكونات الدهون الثلاثية، ومثبطات مادة ال diacylglycerol ناقلة الأسيل-1 (DGAT1) يضعف الاتجار إلى قطرات الدهون وHCV لاحق إنتاج الجسيمات 12 </sup&gt; و 13 و 14 و 15. وبالإضافة إلى ذلك، والطفرات في الدهون المجالات ملزم قطرة إما الأساسية أو NS5A قمع HCV التجمع 16 و 17. الأساسية وNS5A ثم تجنيد جميع البروتينات الفيروسية الأخرى، وكذلك المجمعات تكرار RNA الفيروسي، إلى الأغشية المرتبطة بشكل وثيق مع دهن قطرات 16. مطلوب إجراءات متضافرة من جميع البروتينات الفيروسية لإنتاج الناجح للسلالة الفيروسية المعدية 10 و 11. البروتينات الهيكلية هي جزء من virions، والبروتينات غير الهيكلية تعزيز التفاعلات البروتين البروتين المطلوبة لهذه العملية. ومن المثير للاهتمام، يطلب من حسن النية الدهون ملزم قطرة البروتين PLIN3 / TIP47 لكل من تكرار RNA HCV وإطلاق سراح virions 18 و 19 <suص&gt; 20. وعلى الرغم من هذه التطورات الأخيرة، وتفاصيل الآلية، وخاصة من التفاعلات الفيروسات المضيف أثناء المراحل المتأخرة من تكرار HCV، لا تزال غير محددة، وظيفة محددة من قطرات الدهون غير معروف. هنا، نحن تصف طريقة لعزل قطرات الدهون لقياس الطيف الكتلي الكمي من البروتينات المرتبطة بها. باستخدام هذا الأسلوب، وجدنا تغيرات عميقة في بروتيوم الدهون الحبرية خلال فيروس التهاب الكبد الوبائي، وحددت A3 annexin كما بروتين المضيف الذي مع قطرات الدهون-fractionates التعاون ومطلوب لHCV كفاءة نضوج 21.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>SILAC Protein Quantitation Kit - DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>89983&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13C6 L-Arginine-HCl 50 mg</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>88210&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roti-Load 1</td>
			<td>Roth GmbH</td>
			<td>K929.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roti-Blue 5x-Concentrate</td>
			<td>Roth GmbH</td>
			<td>A152.2&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x SDS-Tris-Glycine - Buffer&#160;</td>
			<td>Geyer Th. GmbH &#38; Co.KG&#160;</td>
			<td>A1415,0250&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX (100x)</td>
			<td>Life Technologies GmbH&#160;</td>
			<td>350500038&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin Solution for Cell Culture</td>
			<td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH&#160;</td>
			<td>P4333-100ml&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1x Dulbeccos Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH&#160;</td>
			<td>D8537&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH&#160;</td>
			<td>T3924-100ML&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride BioChemica</td>
			<td>AppliChem GmbH</td>
			<td>A1149,1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Ultrapure&#160;&#160;</td>
			<td>AppliChem GmbH</td>
			<td>A1086,5000A&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA BioChemica</td>
			<td>AppliChem GmbH</td>
			<td>A1103,0250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail 5ml</td>
			<td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH&#160;</td>
			<td>P8340-5ML&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-Sucrose BioChemica</td>
			<td>AppliChem GmbH</td>
			<td>A3935,1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid 37% pure Ph. Eur., NF</td>
			<td>AppliChem GmbH</td>
			<td>A0625</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC Protein Assay&#160;</td>
			<td>Bio-Rad Laboratoris GmbH&#160;</td>
			<td>500-0116&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>AppliChem GmbH</td>
			<td>151339</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS Ultrapure</td>
			<td>AppliChem GmbH</td>
			<td>A1112</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>AppliChem GmbH</td>
			<td>A2331</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol&#160;</td>
			<td>AppliChem GmbH</td>
			<td>A4338</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blasticidin</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>ant-bl-1&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride&#160;</td>
			<td>AppliChem GmbH</td>
			<td>A1039</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethanesulfonyl Fluoride&#160;</td>
			<td>AppliChem GmbH</td>
			<td>A0999</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH&#160;</td>
			<td>221309</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dipotassium Hydrogenphosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH&#160;</td>
			<td>P3786&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT&#160;</td>
			<td>AppliChem GmbH</td>
			<td>A2948</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1694</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TWEEN 20</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A4974</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonfat dried milk powder</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A0830</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-ADFP/ ADRP&#160;</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab52355</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M6PRB1/TIP47 100&#181;g&#160;</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab47639</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calreticulin, pAb 200 &#181;g</td>
			<td>Enzo Life Science GmbH&#160;</td>
			<td>ADI-SPA-600-F&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-&#223;-Tubulin&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH&#160;</td>
			<td>T6074 200&#181;l &#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute</td>
			<td>Geyer Th. GmbH &#38; Co.KG&#160;</td>
			<td>A3678,0250 &#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-MnSOD</td>
			<td>Enzo Life Science GmbH&#160;</td>
			<td>ADI-SOD-110-F</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse HRP</td>
			<td>Thermo Fisher Pierce</td>
			<td>32430</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit HRP</td>
			<td>Thermo Fisher&#160; Pierce</td>
			<td>32460</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham Hyperfilm ECL</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28906836</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lumi-Light Western Blotting Substrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH&#160;</td>
			<td>12015196001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 Well Cell Culture Plate</td>
			<td>Greiner Bio-One GmbH&#160;</td>
			<td>655 180&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terumo Syringe 1 ml</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>SS-01T</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtropur BT 50, 500 ml, 0.45 &#181;m&#160;</td>
			<td>SARSTEDT&#160;</td>
			<td>83.1823.100&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN TGX Precast Gels, Any kD resolving gel</td>
			<td>Bio-Rad Laboratoris GmbH&#160;</td>
			<td>456-9034&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 Well Cell Culture Plate</td>
			<td>Greiner Bio-One GmbH&#160;</td>
			<td>657160&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dishes Nunclon 150/20&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific GmbH&#160;</td>
			<td>10098720 - 168381&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Scraper</td>
			<td>neoLab Migge GmbH&#160;</td>
			<td>C-8120&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube, 50 ml</td>
			<td>Greiner Bio-One GmbH&#160;</td>
			<td>227261&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SafeSeal Tube RNase-free&#160;</td>
			<td>SARSTEDT&#160;</td>
			<td>72.706.400&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra Clear Centrifuge Tubes 11 x 60 mm</td>
			<td>Beckman Coulter GmbH&#160;</td>
			<td>344062&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suction Needles</td>
			<td>Transcodent</td>
			<td>6482</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosphere Fil. Tip 1000&#160;</td>
			<td>SARSTEDT&#160;</td>
			<td>70.762.211&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosphere Fil. Tip 200</td>
			<td>SARSTEDT&#160;</td>
			<td>70.760.211&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosphere Fil. Tip 10</td>
			<td>SARSTEDT&#160;</td>
			<td>70.1130.210&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce Tissue Grinder</td>
			<td>Fisher Scientific GmbH&#160;</td>
			<td>11883722</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pestles For Dounce All-Glass Tissue Grinders</td>
			<td>Fisher Scientific GmbH&#160;</td>
			<td>10389444</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbitrap Fusion</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson Sonifier 450</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer comfort, with Thermoblock 1.5 ml</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5355&#160;000.127</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN Tetra Cell, Mini Trans-Blot Module, and PowerPac Basic Power Supply,&#160;</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>165-8033</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN 3 Multi-Casting Chamber</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>165-4110</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerPac HC Power Supply</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>164-5052</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima L-90K</td>
			<td>Beckman Coulter GmbH&#160;</td>
			<td>365670</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW 60 Ti Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter GmbH&#160;</td>
			<td>335649</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infinite M1000 PRO</td>
			<td>Tecan</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lipid droplet isolation for quantitative mass spectrometry analysis

قطرات الدهون ضرورية لتكرار مجموعة متنوعة من مسببات الأمراض المختلفة، وأبرزها فيروس التهاب الكبد C (HCV)، والموقع المفترض التشكل الفيريون. ويمكن استخدام تحليل بروتيوم الدهون قطرات الكمي لتحديد البروتينات التي توطين أو مشردون من قطرات الدهون في ظل ظروف مثل العدوى بالفيروس. هنا، نحن تصف البروتوكول الذي تم استخدامه بنجاح لوصف التغيرات التي طرأت على بروتيوم الدهون قطرات بعد الإصابة مع HCV. نحن نستخدم مستقرة النظائر وسمها مع الأحماض الأمينية في الثقافة الخليوي (SILAC)، وبالتالي تسمية بروتيوم كاملة من السكان واحدة من الخلايا التي تحتوي على الأحماض الأمينية &quot;الثقيلة&quot; ل quantitate البروتينات التي مطياف الكتلة. لعزل الدهون قطرة، والسكان الخلية اثنين (أي / &quot;خفيفة&quot; الأحماض الأمينية المصابة HCV و / الأحماض الأمينية &quot;الثقيلة&quot; غير المصابة السيطرة) يتم خلط 1: 1 و هي lysed ميكانيكيا في المخزن منخفض التوتر. بعد إزالة النوى وخلايا دebris بانخفاض الطرد المركزي السرعة، يتم إثراء البروتينات المرتبطة قطرات الدهون من قبل اثنين من الخطوات تنبيذ فائق اللاحقة تليها ثلاث خطوات الغسيل في المخزن متساوي التوتر. ويتم تحليل نقاء الكسور قطرات الدهون التي النشاف الغربية مع الأجسام المضادة الاعتراف مقصورات التحت خلوية مختلفة. ثم يتم فصل البروتينات المرتبطة قطرات الدهون عن طريق الكهربائي للهلام SDS-بولكرلميد (SDS-PAGE)، يليه Coomassie تلطيخ. بعد زيتية هضم، وكميا الببتيدات التي اللوني التأين electrospray، جنبا إلى جنب قياس الطيف الكتلي السائل (LC-ESI-MS / MS). باستخدام هذا الأسلوب، حددنا البروتينات تجنيدهم للقطرات الدهون على فيروس التهاب الكبد الوبائي التي قد تمثل العوامل المضيفة المؤيدة أو المضادة للفيروسات. يمكن تطبيق أسلوبنا لمجموعة متنوعة من الخلايا المختلفة والظروف والثقافة، مثل العدوى مع مسببات الأمراض، والإجهاد البيئي، أو العلاج من تعاطي المخدرات.

قطرات الدهون ضرورية لفيروس التهاب الكبد الوبائي مثل المواقع المفترضة التجمع الفيريون، ولكن الآليات الجزيئية من التشكل والخروج من virions غير معروفة إلى حد كبير. لتحديد عوامل التبعية المضيف جديدة تشارك في هذه العملية، أجرينا الكمي تحليل بروتيوم الدهو...

Watch this Scientific Journal Video about Lipid Droplet Isolation for Quantitative Mass Spectrometry Analysis at JoVE.com

Lipid Droplet Isolation for Quantitative Mass Spectrometry Analysis

قطرات الدهون هي عضيات مهمة لتكرار عدة مسببات الأمراض، بما في ذلك فيروس التهاب الكبد C (HCV). نحن تصف طريقة لعزل قطرات الدهون لمطياف الكتلة الكمية من البروتينات المرتبطة بها. أنها يمكن أن تستخدم في إطار مجموعة من الشروط، مثل عدوى فيروس، والإجهاد البيئي، أو العلاج من تعاطي المخدرات.

الدهون عزل القطرة عن التحليل الكمي الطيف الكتلي

Lipid droplets are vital to the replication of a variety of different pathogens, most prominently the Hepatitis C Virus (HCV), as the putative site of ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

وقت حل التأين electrospray الهيدروجين، الديوتيريوم تبادل الطيف الكتلي لدراسة بنية البروتين وديناميكية

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

حل تقارب تنقية البروتين المجمعات التي كتبها Blue الأصلية PAGE والبروتين الارتباط التنميط

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

A Tandem Liquid Chromatography&#8211;Mass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

A Tandem Liquid ChromatographyÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

النهج القائم على الطيف، جنبا إلى جنب السائل اللوني الكتلة لتحليل المستقلب من<em&gt; المكورات العنقودية الذهبية</em

In an effort to thwart bacterial pathogens, hosts often limit the availability of nutrients at the site of infection. This limitation can alter the ...

Glycoproteomics of the Extracellular Matrix: A Method for Intact Glycopeptide Analysis Using Mass Spectrometry

Glycoproteomics من مصفوفة خارج الخلية: منهج في تحليل سكري سليمة عن طريق قياس الطيف الكتلي

Fibrosis is a hallmark of many cardiovascular diseases and is associated with the exacerbated secretion and deposition of the extracellular matrix (ECM). ...

Proofreading and DNA Repair Assay Using Single Nucleotide Extension and MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis

تصحيح التجارب المطبعية ومقايسة إصلاح الحمض النووي باستخدام ملحق النوكليوتيدات واحدة واستخدام TOF تحليل الطيف الكتلي

The maintenance of the genome and its faithful replication is paramount for conserving genetic information. To assess high fidelity replication, we have ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

توصيف وتعريف الببتيد الموضحة من قبل أنجيوتنسين الثاني

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

إعداد عينة لمسبار Electrospray قياس الطيف الكتلي

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

Use of Microscale Thermophoresis to Measure Protein-Lipid Interactions

استخدام الرحلان الحراري المجهري لقياس التفاعلات بين البروتين والدهون

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

التحليل الكمي للدهون الخلوية من Saccharomyces Cerevisiae باستخدام الكروماتوغرافيا السائلة إلى جانب قياس الطيف الكتلي جنبا إلى جنب

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain

تحليل الموجات الاختزالية السائلة غير المستهدفة - قياس الطيف الشامل - Metabolomics من حبوب القمح

Understanding the interactions between genes, the environment and management in agricultural practice could allow more accurate prediction and management ...