Name: lipid droplet isolation for quantitative mass spectrometry analysis
Uploaded: 2017-04-17T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Lipid Droplet Isolation for Quantitative Mass Spectrometry Analysis at JoVE.com

Wir danken R. Bartenschlager (Universität Heidelberg) für die Jc1 Konstrukte, CM Rice (Rockefeller University) für die Huh7.5 Zellen, J. McLauchlan (Medical Research Council Virology Unit) für die JFH1 konstruieren, T. Wakita (National Institute of Infectious Diseases, Japan) für die JFH1 und B. Webster und WC Greene (Gladstone Institut für Virologie und Immunologie) für die HCVcc Reporterkonstrukte. Diese Arbeit wird durch Mittel der DFG (HE 6889 / 2-1 (EH), INST 337 / 15-1 2013 und INST 337 / 16-1 2013 (HS)) unterstützt wurde. Das Heinrich-Pette-Institut, Leibniz-Institut für Experimentelle Virologie wird von den Freien und Hansestadt Hamburg und das Bundesministerium für Gesundheit unterstützt. Die Geldgeber hatten keine Rolle in Studiendesign, Datenerhebung und Analyse, Entscheidung oder Vorbereitung des Manuskripts zu veröffentlichen.

1. Herstellung von Medien für die Markierung mit stabilen Isotopen mit Aminosäuren in Zellkultur (SILAC) HINWEIS: Hier wird das SILAC Protein Quantifizierungs Kit - DMEM , das mit 50 mg 13 C 6 L-Arginin-HCl wurde für SILAC Kennzeichnung verwendet. Die dialysierte Fetale Kälberserum (FCS) mit den SILAC Protein Quantifizierungs Kit zur Verfügung gestellt. <ol><li> Entfernen Sie 50 ml aus jeder Flasche DMEM-Medium und 50 ml dialysiertes FCS. </li><li> Man löst 50 m...

<ol>
	<li>Thiam, A. R., Farese, R. V., Walther, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biophysics+and+cell+biology+of+lipid+droplets.">The biophysics and cell biology of lipid droplets.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (12), 775-786 (2013).</li><li>Welte, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+roles+for+lipid+droplets.">Expanding roles for lipid droplets.</a> Curr Biol. 25 (11), R470-R481 (2015).</li><li>Brasaemle, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thematic+review+series:+adipocyte+biology.+The+perilipin+family+of+structural+lipid+droplet+proteins:+stabilization+of+lipid+droplets+and+control+of+lipolysis.">Thematic review series: adipocyte biology. The perilipin family of structural lipid droplet proteins: stabilization of lipid droplets and control of lipolysis.</a> J Lipid Res. 48 (12), 2547-2559 (2007).</li><li>Choudhary, V., Ojha, N., Golden, A., Prinz, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+family+of+proteins+facilitates+nascent+lipid+droplet+budding+from+the+ER.">A conserved family of proteins facilitates nascent lipid droplet budding from the ER.</a> J Cell Biol. 211 (2), 261-271 (2015).</li><li>Kory, N., Farese, R. V., Walther, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Fat:+Mechanisms+of+Protein+Localization+to+Lipid+Droplets.">Targeting Fat: Mechanisms of Protein Localization to Lipid Droplets.</a> Trends Cell Biol. 26 (7), 535-546 (2016).</li><li>Hashemi, H. F., Goodman, J. 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T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatitis+C+virus+NS5A+colocalizes+with+the+core+protein+on+lipid+droplets+and+interacts+with+apolipoproteins.">Hepatitis C virus NS5A colocalizes with the core protein on lipid droplets and interacts with apolipoproteins.</a> Virology. 292 (2), 198-210 (2002).</li><li>Herker, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+hepatitis+C+virus+particle+formation+requires+diacylglycerol+acyltransferase-1.">Efficient hepatitis C virus particle formation requires diacylglycerol acyltransferase-1.</a> Nat Med. 16 (11), 1295-1298 (2010).</li><li>Camus, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diacylglycerol+acyltransferase-1+localizes+hepatitis+C+virus+NS5A+protein+to+lipid+droplets+and+enhances+NS5A+interaction+with+the+viral+capsid+core.">Diacylglycerol acyltransferase-1 localizes hepatitis C virus NS5A protein to lipid droplets and enhances NS5A interaction with the viral capsid core.</a> J Biol Chem. 288 (14), 9915-9923 (2013).</li><li>Miyanari, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lipid+droplet+is+an+important+organelle+for+hepatitis+C+virus+production.">The lipid droplet is an important organelle for hepatitis C virus production.</a> Nat Cell Biol. 9 (9), 1089-1097 (2007).</li><li>Boulant, S., Targett-Adams, P., McLauchlan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disrupting+the+association+of+hepatitis+C+virus+core+protein+with+lipid+droplets+correlates+with+a+loss+in+production+of+infectious+virus.">Disrupting the association of hepatitis C virus core protein with lipid droplets correlates with a loss in production of infectious virus.</a> J Gen Virol. 88 (Pt 8), 2204-2213 (2007).</li><li>Vogt, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplet-binding+protein+TIP47+regulates+hepatitis+C+Virus+RNA+replication+through+interaction+with+the+viral+NS5A+protein.">Lipid droplet-binding protein TIP47 regulates hepatitis C Virus RNA replication through interaction with the viral NS5A protein.</a> PLoS Pathog. 9 (4), e1003302 (2013).</li><li>Ploen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TIP47+plays+a+crucial+role+in+the+life+cycle+of+hepatitis+C+virus.">TIP47 plays a crucial role in the life cycle of hepatitis C virus.</a> J Hepatol. 58 (6), 1081-1088 (2013).</li><li>Ploen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TIP47+is+associated+with+the+hepatitis+C+virus+and+its+interaction+with+Rab9+is+required+for+release+of+viral+particles.">TIP47 is associated with the hepatitis C virus and its interaction with Rab9 is required for release of viral particles.</a> Eur J Cell Biol. 92 (12), 374-382 (2013).</li><li>Rosch, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Lipid+Droplet+Proteome+Analysis+Identifies+Annexin+A3+as+a+Cofactor+for+HCV+Particle+Production.">Quantitative Lipid Droplet Proteome Analysis Identifies Annexin A3 as a Cofactor for HCV Particle Production.</a> Cell Rep. 16 (12), 3219-3231 (2016).</li><li>Kwiatkowski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+extraction+of+proteins+from+tissues+using+desorption+by+impulsive+vibrational+excitation.">Ultrafast extraction of proteins from tissues using desorption by impulsive vibrational excitation.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 54 (1), 285-288 (2015).</li><li>Webster, B., Ott, M., Greene, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evasion+of+superinfection+exclusion+and+elimination+of+primary+viral+RNA+by+an+adapted+strain+of+hepatitis+C+virus.">Evasion of superinfection exclusion and elimination of primary viral RNA by an adapted strain of hepatitis C virus.</a> J Virol. 87 (24), 13354-13369 (2013).</li><li>Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-gel+digestion+for+mass+spectrometric+characterization+of+proteins+and+proteomes.">In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes.</a> Nat Protoc. 1 (6), 2856-2860 (2006).</li><li>Ting, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normalization+and+statistical+analysis+of+quantitative+proteomics+data+generated+by+metabolic+labeling.">Normalization and statistical analysis of quantitative proteomics data generated by metabolic labeling.</a> Mol Cell Proteomics. 8 (10), 2227-2242 (2009).</li><li>Brasaemle, D. L., Dolios, G., Shapiro, L., Wang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+proteins+associated+with+lipid+droplets+of+basal+and+lipolytically+stimulated+3T3-L1+adipocytes.">Proteomic analysis of proteins associated with lipid droplets of basal and lipolytically stimulated 3T3-L1 adipocytes.</a> J Biol Chem. 279 (45), 46835-46842 (2004).</li><li>Tingting, P., Caiyun, F., Zhigang, Y., Pengyuan, Y., Zhenghong, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subproteomic+analysis+of+the+cellular+proteins+associated+with+the+3'+untranslated+region+of+the+hepatitis+C+virus+genome+in+human+liver+cells.">Subproteomic analysis of the cellular proteins associated with the 3' untranslated region of the hepatitis C virus genome in human liver cells.</a> Biochem Biophys Res Commun. 347 (3), 683-691 (2006).</li><li>Ariumi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DDX3+DEAD-box+RNA+helicase+is+required+for+hepatitis+C+virus+RNA+replication.">DDX3 DEAD-box RNA helicase is required for hepatitis C virus RNA replication.</a> J Virol. 81 (24), 13922-13926 (2007).</li><li>Weinlich, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IGF2BP1+enhances+HCV+IRES-mediated+translation+initiation+via+the+3'UTR.">IGF2BP1 enhances HCV IRES-mediated translation initiation via the 3'UTR.</a> RNA. 15 (8), 1528-1542 (2009).</li></ol>

Hier beschreiben wir ein Protokoll Lipidtröpfchen für quantitative Lipidtröpfchen Proteomanalyse zu isolieren, die An- und Abreicherung von Proteinen mit Lipidtröpfchen unter verschiedenen Kulturbedingungen, wie virale Infektionen zu vergleichen. bezogen auf das Gesamtspitzenintensitäten Als alternatives Verfahren kann die Proteomanalyse mit markierungsfreien Quantifizierungen durchgeführt werden. Dieses Verfahren hat keine dynamische Bereichsbegrenzung und vermeidet metabolische Probleme. Der Vorteil des SILAC An...

<html> Lipidtröpfchen sind sehr dynamisch cytoplasmatischen (und nuklear) Zellorganellen , bestehend aus einem Kern aus neutralen Lipiden (Triglyceriden (TG) und Cholesterinester (CE)) durch eine Monoschicht von Phospholipiden mit eingebetteten Proteinen 1 umschlossen. Alle Zelltypen produzieren Lipidtröpfchen, aber sie unterscheiden sich in Größe, Lipidzusammensetzung und Protein Dekoration. Lipidtröpfchen erfüllen verschiedene Funktionen, unter anderem als Energie und Membranvorläufer Reservoire oder als Proteinablagerungen. Darüber hinaus wird durch die Aufnahme von Lipiden, schützen sie Zellen vor Lipotoxizität, Trenn Lipide als Signalmoleküle, und sind in den Proteinabbau und endoplasmatischen Retikulum (ER) 2 Stressantworten beteiligt. Als solche bindet eine Vielzahl von Proteinen an Lipidtröpfchen und regelt ihre Generation, Abbau, handelt, und die Interaktion mit anderen Organellen. Unter ihnen sind die perilipin Familie von bona fide Lipidtröpfchen bindende Proteine (PLIN1-5)f &quot;&gt; 3. Lipidtropfen Biogenese beginnt wahrscheinlich am IHN, in dem ER-resident Enzyme die Synthese von Neutrallipiden katalysieren , die innerhalb der Membran - Doppelschicht ansammeln, eine Linse aus neutralen Lipiden gebildet wird , ein Verfahren , das in letzter Zeit in Hefe gut 4 sichtbar gemacht wurde. Membran Biegen und erhöhter Phosphatidsäure und Diacylglycerin Ebenen werden dann gedacht Proteine in Phospholipid - Biosynthese, wie die gleichzeitige Synthese der Kern neutralen Lipiden und Phospholipiden die Abschirmung für Lipidtröpfchenerzeugung 5 erforderlich beteiligt zu gewinnen. Enzyme beherbergen Transmembran- Domänen, die an der ER residieren katalysieren diesen Prozess. Expansion zu großen Lipidtröpfchen erfordert die Aktivität einer anderen Klasse von Lipid-synthetisierende Enzyme, die eine amphipathische Helix Hafen und kann somit aus dem ER zum Lipidtröpfchen reisen. Die Mobilisierung von Lipiden aus Lipidtröpfchen erfolgt durch die lokale Aktivierung des Triglyceride und Diacylglycerin Lipasen adipose Triglycerid - Lipase (ATGL) und hormonsensitive Lipase (HSL) , oder durch verschiedene Wege autophagischen wie Makro- und microlipophagy oder Chaperon-vermittelte autophagy 6. Lipidtröpfchen der Interaktion mit anderen Zellorganellen, wie Mitochondrien (zur beta-Oxidation und Lipid - Synthese) und ER (für die Lipid - Synthese und Proteintransport), sondern auch mit Lysosomen, Endosomen und den durch intrazelluläre Bakterien 7 induzierten Vakuolen. Tatsächlich Bakterien, Viren, Parasiten und sogar Ziellipidtröpfchen für die Replikation und Persistenz, darunter HCV 8. HCV - Infektion ist eine der führenden Ursachen für Leberbedingte Morbidität und Mortalität weltweit, 9 für etwa 0,5 Millionen Todesfälle pro Jahr ausmacht. Die tatsächliche Zahl der HCV-Infektionen ist nicht bekannt, aber die jüngsten Schätzungen deuten darauf hin, dass 130-150000000 Menschen chronisch infiziert sind. kein vaccine existiert, aber die kürzlich genehmigten direkt wirkenden antiviralen Medikamente therapeutische Reaktionen drastisch erhöhen im Vergleich zur Standard-Interferon-basierten Therapie. Doch weltweit wird wahrscheinlich die Behandlung von Patienten beschränkt werden aufgrund der extrem hohen Kosten der neuen Therapeutika. Etwa die Hälfte aller Menschen chronisch mit HCV entwickeln Fettlebererkrankung (Steatose) infiziert sind, eine durch die übermäßige Ansammlung von Fetttröpfchen in Hepatozyten gekennzeichnet ist. Intriguingly, Lipidtröpfchen entstanden auch als vital Zellorganellen für die HCV - Replikation, mutmaßlich viral als Montagestellen dienenden 10, 11. In HCV-infizierten Zellen, der virale Proteinkern und NS5A lokalisieren zu Lipidtröpfchen in einem Prozess, der auf Triglycerid - Biosynthese - 12, als Inhibitoren der Diacylglycerol - Acyltransferase-1 (DGAT1) beeinträchtigt Handel Lipidtröpfchen und nachfolgenden HCV Partikelproduktion hängt </sup&gt;, 13, 14, 15. Darüber hinaus können Mutationen in den Lipidtröpfchen-Bindungsdomänen von entweder Kern oder NS5A unterdrücken HCV - Anordnung 16, 17 auf . Kern und NS5A dann alle anderen viralen Proteine rekrutieren, sowie virale RNA - Replikationskomplexe zu Membranen eng mit Lipid assoziierten Tröpfchen 16. Eine konzertierte Aktion aller viralen Proteine ist für die erfolgreiche Produktion von infektiösen Virusnachkommen 10, 11 erforderlich. Die Strukturproteine ​​sind Teil der Virionen und die nicht-strukturellen Proteine ​​fördern, um die Protein-Protein-Wechselwirkungen für dieses Verfahren erforderlich. Erstaunlicherweise wird die bona fide Lipidtröpfchen-bindendes Protein PLIN3 / TIP47 sowohl für HCV - RNA - Replikation erforderlich ist und die Freisetzung von Virionen 18, 19 <sup&gt; 20. Trotz dieser jüngsten Fortschritte, die mechanistischen Details, vor allem von Virus-Wirt-Interaktionen während der späten Stadien der HCV-Replikation, bleiben schlecht definiert, und die genaue Funktion der Lipidtröpfchen ist nicht bekannt. Hier beschreiben wir ein Verfahren Lipidtröpfchen für die quantitative Massenspektrometrie assoziierter Proteine ​​zu isolieren. Mit dieser Methode fanden wir grundlegende Veränderungen in den Lipidtröpfchen Proteom während eines HCV - Infektion und identifiziert Annexin A3 als Wirt Protein , das mit Lipidtröpfchen zusammen fraktioniert und ist für eine effiziente HCV Reifung 21 erforderlich.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>SILAC Protein Quantitation Kit - DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>89983&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13C6 L-Arginine-HCl 50 mg</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>88210&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roti-Load 1</td>
			<td>Roth GmbH</td>
			<td>K929.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roti-Blue 5x-Concentrate</td>
			<td>Roth GmbH</td>
			<td>A152.2&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x SDS-Tris-Glycine - Buffer&#160;</td>
			<td>Geyer Th. GmbH &#38; Co.KG&#160;</td>
			<td>A1415,0250&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX (100x)</td>
			<td>Life Technologies GmbH&#160;</td>
			<td>350500038&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin Solution for Cell Culture</td>
			<td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH&#160;</td>
			<td>P4333-100ml&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1x Dulbeccos Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH&#160;</td>
			<td>D8537&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH&#160;</td>
			<td>T3924-100ML&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride BioChemica</td>
			<td>AppliChem GmbH</td>
			<td>A1149,1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Ultrapure&#160;&#160;</td>
			<td>AppliChem GmbH</td>
			<td>A1086,5000A&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA BioChemica</td>
			<td>AppliChem GmbH</td>
			<td>A1103,0250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail 5ml</td>
			<td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH&#160;</td>
			<td>P8340-5ML&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-Sucrose BioChemica</td>
			<td>AppliChem GmbH</td>
			<td>A3935,1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid 37% pure Ph. Eur., NF</td>
			<td>AppliChem GmbH</td>
			<td>A0625</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC Protein Assay&#160;</td>
			<td>Bio-Rad Laboratoris GmbH&#160;</td>
			<td>500-0116&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>AppliChem GmbH</td>
			<td>151339</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS Ultrapure</td>
			<td>AppliChem GmbH</td>
			<td>A1112</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>AppliChem GmbH</td>
			<td>A2331</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol&#160;</td>
			<td>AppliChem GmbH</td>
			<td>A4338</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blasticidin</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>ant-bl-1&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride&#160;</td>
			<td>AppliChem GmbH</td>
			<td>A1039</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethanesulfonyl Fluoride&#160;</td>
			<td>AppliChem GmbH</td>
			<td>A0999</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH&#160;</td>
			<td>221309</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dipotassium Hydrogenphosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH&#160;</td>
			<td>P3786&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT&#160;</td>
			<td>AppliChem GmbH</td>
			<td>A2948</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1694</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TWEEN 20</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A4974</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonfat dried milk powder</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A0830</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-ADFP/ ADRP&#160;</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab52355</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M6PRB1/TIP47 100&#181;g&#160;</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab47639</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calreticulin, pAb 200 &#181;g</td>
			<td>Enzo Life Science GmbH&#160;</td>
			<td>ADI-SPA-600-F&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-&#223;-Tubulin&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH&#160;</td>
			<td>T6074 200&#181;l &#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute</td>
			<td>Geyer Th. GmbH &#38; Co.KG&#160;</td>
			<td>A3678,0250 &#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-MnSOD</td>
			<td>Enzo Life Science GmbH&#160;</td>
			<td>ADI-SOD-110-F</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse HRP</td>
			<td>Thermo Fisher Pierce</td>
			<td>32430</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit HRP</td>
			<td>Thermo Fisher&#160; Pierce</td>
			<td>32460</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham Hyperfilm ECL</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28906836</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lumi-Light Western Blotting Substrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH&#160;</td>
			<td>12015196001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 Well Cell Culture Plate</td>
			<td>Greiner Bio-One GmbH&#160;</td>
			<td>655 180&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terumo Syringe 1 ml</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>SS-01T</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtropur BT 50, 500 ml, 0.45 &#181;m&#160;</td>
			<td>SARSTEDT&#160;</td>
			<td>83.1823.100&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN TGX Precast Gels, Any kD resolving gel</td>
			<td>Bio-Rad Laboratoris GmbH&#160;</td>
			<td>456-9034&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 Well Cell Culture Plate</td>
			<td>Greiner Bio-One GmbH&#160;</td>
			<td>657160&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dishes Nunclon 150/20&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific GmbH&#160;</td>
			<td>10098720 - 168381&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Scraper</td>
			<td>neoLab Migge GmbH&#160;</td>
			<td>C-8120&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube, 50 ml</td>
			<td>Greiner Bio-One GmbH&#160;</td>
			<td>227261&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SafeSeal Tube RNase-free&#160;</td>
			<td>SARSTEDT&#160;</td>
			<td>72.706.400&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra Clear Centrifuge Tubes 11 x 60 mm</td>
			<td>Beckman Coulter GmbH&#160;</td>
			<td>344062&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suction Needles</td>
			<td>Transcodent</td>
			<td>6482</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosphere Fil. Tip 1000&#160;</td>
			<td>SARSTEDT&#160;</td>
			<td>70.762.211&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosphere Fil. Tip 200</td>
			<td>SARSTEDT&#160;</td>
			<td>70.760.211&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosphere Fil. Tip 10</td>
			<td>SARSTEDT&#160;</td>
			<td>70.1130.210&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce Tissue Grinder</td>
			<td>Fisher Scientific GmbH&#160;</td>
			<td>11883722</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pestles For Dounce All-Glass Tissue Grinders</td>
			<td>Fisher Scientific GmbH&#160;</td>
			<td>10389444</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbitrap Fusion</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson Sonifier 450</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer comfort, with Thermoblock 1.5 ml</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5355&#160;000.127</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN Tetra Cell, Mini Trans-Blot Module, and PowerPac Basic Power Supply,&#160;</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>165-8033</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN 3 Multi-Casting Chamber</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>165-4110</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerPac HC Power Supply</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>164-5052</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima L-90K</td>
			<td>Beckman Coulter GmbH&#160;</td>
			<td>365670</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW 60 Ti Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter GmbH&#160;</td>
			<td>335649</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infinite M1000 PRO</td>
			<td>Tecan</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lipid droplet isolation for quantitative mass spectrometry analysis

Lipidtröpfchen sind entscheidend für die Replikation von einer Vielzahl von verschiedenen Krankheitserregern, am deutlichsten der Hepatitis-C-Virus (HCV), als die mutmaßliche Stelle Virionmorphogenese. Quantitative Lipidtropfen Proteomanalyse kann verwendet werden, um Proteine ​​zu identifizieren, zu lokalisieren oder von Lipidtröpfchen unter Bedingungen, wie Virusinfektionen verdrängt. Hier beschreiben wir ein Protokoll, das mit HCV erfolgreich eingesetzt, um die Änderungen in den Lipidtröpfchen Proteom zu charakterisieren nach der Infektion wurde. Wir verwenden Markierung mit stabilen Isotopen mit Aminosäuren in Zellkultur (SILAC) und damit die vollständige Proteom einer Population von Zellen, die mit „schweren“ Aminosäuren bezeichnen, die die Proteine ​​durch Massenspektrometrie quantitativ zu bestimmen. Für Lipidtröpfchen Isolation, die beiden Zellpopulationen (dh HCV-infizierten / „Licht“ Aminosäuren und nicht infizierten Kontroll / „schwere“ Aminosäuren) sind 1: 1 gemischt und mechanisch in hypotonischen Puffer lysiert. Nachdem die Kerne und Zell d Entfernenebris durch Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit, Lipidtröpfchen-assoziierte Proteine ​​werden durch zwei aufeinanderfolgende Schritte Ultrazentrifugation durch drei Waschschritte in isotonischem Puffer angereichert folgte. Die Reinheit der Fraktionen wird Lipidtröpfchen durch Western-Blotting mit Antikörpern, die unterschiedlichen subzellulären Kompartimenten analysiert. Lipidtropfen-assoziierte Proteine ​​werden dann durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE), gefolgt von Coomassie-Färbung aufgetrennt. Nach tryptischen Verdaus werden die Peptide durch Flüssigchromatographie-Elektrospray-Ionisations-Tandem-Massenspektrometrie (LC-ESI-MS / MS) quantifiziert. Mit dieser Methode identifizierten wir Proteine ​​rekrutiert Lipidtröpfchen auf HCV-Infektion, die pro- oder antivirale Wirtsfaktoren darstellen könnten. Unsere Methode kann mit Krankheitserregern, Umweltstress, oder medikamentöser Behandlung zu einer Vielzahl von verschiedenen Zellen und Kulturbedingungen, wie Infektionen angewandt werden.

Lipidtröpfchen sind entscheidend für eine HCV-Infektion als die mutmaßlichen Stellen von Virionen, aber die molekularen Mechanismen der Morphogenese und Austritt von Virionen sind weitgehend unbekannt. Neue Host - Abhängigkeitsfaktoren in diesem Prozess beteiligt zu identifizieren, führten wir quantitative Lipidtröpfchen Proteomanalyse von HCV-infizierten Zellen 21 (Abbildung 1A). Wir haben ein Protokoll für die Lipidtröpfchen Reinigung un...

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Lipid Droplet Isolation for Quantitative Mass Spectrometry Analysis

Lipidtröpfchen sind wichtige Organellen für die Replikation von mehreren Erregern, einschließlich der Hepatitis C-Virus (HCV). Wir beschreiben ein Verfahren für die quantitative Lipidtröpfchen-Massenspektrometrie assoziierter Proteine ​​zu isolieren; es kann unter einer Vielzahl von Bedingungen, wie zum Beispiel Virusinfektion, Umweltstress, oder medikamentöse Behandlung verwendet werden.

Lipid Droplet Isolierung für die quantitative Massenspektrometrie-Analyse

Lipid droplets are vital to the replication of a variety of different pathogens, most prominently the Hepatitis C Virus (HCV), as the putative site of ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Zeitaufgelöste Elektrospray-Ionisations Wasserstoff-Deuterium-Austausch-Massenspektrometrie zur Struktur Protein Studium und Dynamik

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Forschung

Biochemie

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Auflösen von Affinity Purified Protein-Komplexen von Blue native PAGE und Protein Correlation Profilieren

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

A Tandem Liquid Chromatography&#8211;Mass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

A Tandem Liquid ChromatographyÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

Ein Tandem-Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie-basierter Ansatz zur Analyse von Metabolit<em&gt; Staphylococcus aureus</em

In an effort to thwart bacterial pathogens, hosts often limit the availability of nutrients at the site of infection. This limitation can alter the ...

Glycoproteomics of the Extracellular Matrix: A Method for Intact Glycopeptide Analysis Using Mass Spectrometry

Glycoproteomics der extrazellulären Matrix: eine Methode zur Intact Glycopeptidthioestern Analyse unter Verwendung von Massenspektrometrie

Fibrosis is a hallmark of many cardiovascular diseases and is associated with the exacerbated secretion and deposition of the extracellular matrix (ECM). ...

Proofreading and DNA Repair Assay Using Single Nucleotide Extension and MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis

Korrekturlesen und DNA-Reparatur-Assay mit Einzel-Nukleotid-Erweiterung und MALDI-TOF Massenspektrometrie-Analyse

The maintenance of the genome and its faithful replication is paramount for conserving genetic information. To assess high fidelity replication, we have ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

Nitropeptid Profilierung und Identifikation illustriert von Angiotensin II

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Probenvorbereitung für Probe Elektrospray-Ionen-Massenspektrometrie

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

Use of Microscale Thermophoresis to Measure Protein-Lipid Interactions

Einsatz der mikroskaligen Thermophorese zur Messung von Protein-Lipid-Wechselwirkungen

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analyse des Zelllipidoms von Saccharomyces Cerevisiae mit Flüssigchromatographie gekoppelt mit Tandem-Massenspektrometrie

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain

Ungezielte Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie-basierte Metabolomik-Analyse von Weizengetreide

Understanding the interactions between genes, the environment and management in agricultural practice could allow more accurate prediction and management ...