Name: lipid droplet isolation for quantitative mass spectrometry analysis
Uploaded: 2017-04-17T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Lipid Droplet Isolation for Quantitative Mass Spectrometry Analysis at JoVE.com

Vi takker R. Bartenschlager (Universitetet i Heidelberg) for JC1 konstruksjoner, CM Rice (Rockefeller University) for Huh7.5 celler, J. McLauchlan (Medical Research Council virologi Unit) for JFH1 konstruere, T. Wakita (National Institute of infeksjons~~POS=TRUNC sykdommer~~POS=HEADCOMP, Japan) for JFH1 og B. Webster og WC Greene (Gladstone Institute of Virology og immunologi) for de HCVcc reporter konstruksjoner. Dette arbeid ble støttet av midler fra DFG (HE 6889 / 2-1 (EH), INST 337 / 15-1 2013, og INST 337 / 16-1 2013 (HS)). Heinrich Pette Institute, Leibniz Institutt for eksperimentell virologi er støttet av Free og hansabyen Hamburg og Federal Ministry of Health. De organer hadde ingen rolle i studieutforming, datainnsamling og analyse, beslutning om å utgi, eller fremstillingen av manuskriptet.

1. Utarbeidelse av Media for stabile isotoper Merking med aminosyrer i cellekultur (SILAC) MERK: Her er den SILAC proteinkvantifisering Kit - DMEM supplert med 50 mg av 13 C 6 L-arginin-HCl ble brukt for SILAC merking. Den dialysert føtalt kalveserum (FCS) er forsynt med SILAC proteinkvantifisering Kit. <ol><li> Fjern 50 ml fra hver flaske med DMEM-medium og tilsett 50 ml av dialysert FCS. </li><li> Oppløs 50 mg av 13 C 6 L-lysin-2HCl og 50 mg ...

<ol>
	<li>Thiam, A. R., Farese, R. V., Walther, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biophysics+and+cell+biology+of+lipid+droplets.">The biophysics and cell biology of lipid droplets.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (12), 775-786 (2013).</li><li>Welte, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+roles+for+lipid+droplets.">Expanding roles for lipid droplets.</a> Curr Biol. 25 (11), R470-R481 (2015).</li><li>Brasaemle, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thematic+review+series:+adipocyte+biology.+The+perilipin+family+of+structural+lipid+droplet+proteins:+stabilization+of+lipid+droplets+and+control+of+lipolysis.">Thematic review series: adipocyte biology. The perilipin family of structural lipid droplet proteins: stabilization of lipid droplets and control of lipolysis.</a> J Lipid Res. 48 (12), 2547-2559 (2007).</li><li>Choudhary, V., Ojha, N., Golden, A., Prinz, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+family+of+proteins+facilitates+nascent+lipid+droplet+budding+from+the+ER.">A conserved family of proteins facilitates nascent lipid droplet budding from the ER.</a> J Cell Biol. 211 (2), 261-271 (2015).</li><li>Kory, N., Farese, R. V., Walther, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Fat:+Mechanisms+of+Protein+Localization+to+Lipid+Droplets.">Targeting Fat: Mechanisms of Protein Localization to Lipid Droplets.</a> Trends Cell Biol. 26 (7), 535-546 (2016).</li><li>Hashemi, H. F., Goodman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+life+cycle+of+lipid+droplets.">The life cycle of lipid droplets.</a> Curr Opin Cell Biol. 33, 119-124 (2015).</li><li>Gao, Q., Goodman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lipid+droplet-a+well-connected+organelle.">The lipid droplet-a well-connected organelle.</a> Front Cell Dev Biol. 3, 49 (2015).</li><li>Herker, E., Ott, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+role+of+lipid+droplets+in+host/pathogen+interactions.">Emerging role of lipid droplets in host/pathogen interactions.</a> J Biol Chem. 287 (4), 2280-2287 (2012).</li><li>Wedemeyer, H., Dore, G. J., Ward, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimates+on+HCV+disease+burden+worldwide+-+filling+the+gaps.">Estimates on HCV disease burden worldwide - filling the gaps.</a> J Viral Hepat. 22 Suppl 1, 1-5 (2015).</li><li>Paul, D., Madan, V., Bartenschlager, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatitis+C+virus+RNA+replication+and+assembly:+living+on+the+fat+of+the+land.">Hepatitis C virus RNA replication and assembly: living on the fat of the land.</a> Cell Host Microbe. 16 (5), 569-579 (2014).</li><li>Lindenbach, B. D., Rice, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ins+and+outs+of+hepatitis+C+virus+entry+and+assembly.">The ins and outs of hepatitis C virus entry and assembly.</a> Nat Rev Microbiol. 11 (10), 688-700 (2013).</li><li>Barba, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatitis+C+virus+core+protein+shows+a+cytoplasmic+localization+and+associates+to+cellular+lipid+storage+droplets.">Hepatitis C virus core protein shows a cytoplasmic localization and associates to cellular lipid storage droplets.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (4), 1200-1205 (1997).</li><li>Shi, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatitis+C+virus+NS5A+colocalizes+with+the+core+protein+on+lipid+droplets+and+interacts+with+apolipoproteins.">Hepatitis C virus NS5A colocalizes with the core protein on lipid droplets and interacts with apolipoproteins.</a> Virology. 292 (2), 198-210 (2002).</li><li>Herker, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+hepatitis+C+virus+particle+formation+requires+diacylglycerol+acyltransferase-1.">Efficient hepatitis C virus particle formation requires diacylglycerol acyltransferase-1.</a> Nat Med. 16 (11), 1295-1298 (2010).</li><li>Camus, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diacylglycerol+acyltransferase-1+localizes+hepatitis+C+virus+NS5A+protein+to+lipid+droplets+and+enhances+NS5A+interaction+with+the+viral+capsid+core.">Diacylglycerol acyltransferase-1 localizes hepatitis C virus NS5A protein to lipid droplets and enhances NS5A interaction with the viral capsid core.</a> J Biol Chem. 288 (14), 9915-9923 (2013).</li><li>Miyanari, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lipid+droplet+is+an+important+organelle+for+hepatitis+C+virus+production.">The lipid droplet is an important organelle for hepatitis C virus production.</a> Nat Cell Biol. 9 (9), 1089-1097 (2007).</li><li>Boulant, S., Targett-Adams, P., McLauchlan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disrupting+the+association+of+hepatitis+C+virus+core+protein+with+lipid+droplets+correlates+with+a+loss+in+production+of+infectious+virus.">Disrupting the association of hepatitis C virus core protein with lipid droplets correlates with a loss in production of infectious virus.</a> J Gen Virol. 88 (Pt 8), 2204-2213 (2007).</li><li>Vogt, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplet-binding+protein+TIP47+regulates+hepatitis+C+Virus+RNA+replication+through+interaction+with+the+viral+NS5A+protein.">Lipid droplet-binding protein TIP47 regulates hepatitis C Virus RNA replication through interaction with the viral NS5A protein.</a> PLoS Pathog. 9 (4), e1003302 (2013).</li><li>Ploen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TIP47+plays+a+crucial+role+in+the+life+cycle+of+hepatitis+C+virus.">TIP47 plays a crucial role in the life cycle of hepatitis C virus.</a> J Hepatol. 58 (6), 1081-1088 (2013).</li><li>Ploen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TIP47+is+associated+with+the+hepatitis+C+virus+and+its+interaction+with+Rab9+is+required+for+release+of+viral+particles.">TIP47 is associated with the hepatitis C virus and its interaction with Rab9 is required for release of viral particles.</a> Eur J Cell Biol. 92 (12), 374-382 (2013).</li><li>Rosch, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Lipid+Droplet+Proteome+Analysis+Identifies+Annexin+A3+as+a+Cofactor+for+HCV+Particle+Production.">Quantitative Lipid Droplet Proteome Analysis Identifies Annexin A3 as a Cofactor for HCV Particle Production.</a> Cell Rep. 16 (12), 3219-3231 (2016).</li><li>Kwiatkowski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+extraction+of+proteins+from+tissues+using+desorption+by+impulsive+vibrational+excitation.">Ultrafast extraction of proteins from tissues using desorption by impulsive vibrational excitation.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 54 (1), 285-288 (2015).</li><li>Webster, B., Ott, M., Greene, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evasion+of+superinfection+exclusion+and+elimination+of+primary+viral+RNA+by+an+adapted+strain+of+hepatitis+C+virus.">Evasion of superinfection exclusion and elimination of primary viral RNA by an adapted strain of hepatitis C virus.</a> J Virol. 87 (24), 13354-13369 (2013).</li><li>Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-gel+digestion+for+mass+spectrometric+characterization+of+proteins+and+proteomes.">In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes.</a> Nat Protoc. 1 (6), 2856-2860 (2006).</li><li>Ting, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normalization+and+statistical+analysis+of+quantitative+proteomics+data+generated+by+metabolic+labeling.">Normalization and statistical analysis of quantitative proteomics data generated by metabolic labeling.</a> Mol Cell Proteomics. 8 (10), 2227-2242 (2009).</li><li>Brasaemle, D. L., Dolios, G., Shapiro, L., Wang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+proteins+associated+with+lipid+droplets+of+basal+and+lipolytically+stimulated+3T3-L1+adipocytes.">Proteomic analysis of proteins associated with lipid droplets of basal and lipolytically stimulated 3T3-L1 adipocytes.</a> J Biol Chem. 279 (45), 46835-46842 (2004).</li><li>Tingting, P., Caiyun, F., Zhigang, Y., Pengyuan, Y., Zhenghong, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subproteomic+analysis+of+the+cellular+proteins+associated+with+the+3'+untranslated+region+of+the+hepatitis+C+virus+genome+in+human+liver+cells.">Subproteomic analysis of the cellular proteins associated with the 3' untranslated region of the hepatitis C virus genome in human liver cells.</a> Biochem Biophys Res Commun. 347 (3), 683-691 (2006).</li><li>Ariumi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DDX3+DEAD-box+RNA+helicase+is+required+for+hepatitis+C+virus+RNA+replication.">DDX3 DEAD-box RNA helicase is required for hepatitis C virus RNA replication.</a> J Virol. 81 (24), 13922-13926 (2007).</li><li>Weinlich, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IGF2BP1+enhances+HCV+IRES-mediated+translation+initiation+via+the+3'UTR.">IGF2BP1 enhances HCV IRES-mediated translation initiation via the 3'UTR.</a> RNA. 15 (8), 1528-1542 (2009).</li></ol>

Her beskriver vi en protokoll for å isolere lipiddråper for kvantitativ oljedråpe proteomanalyse å sammenligne anrikning og nedbryting av proteiner forbundet med lipiddråper under forskjellige dyrkningsbetingelser, som for eksempel virusinfeksjoner. Som en alternativ fremgangsmåte, kan den proteomanalyse utføres med etikettfritt kvantifisering basert på totale toppintensiteter. Denne metoden har noen dynamisk område og unngår begrensning metabolske problemer. Fordelen med den SILAC tilnærmingen er at prøvene...

<html> Lipiddråper er høydynamiske cytoplasmatiske (og atom) celleorganeller som består av en kjerne av nøytrale lipider (triglyserider (TG) og kolesterolester (CE)) omsluttet av et monolag av fosfolipider med innlagte proteiner 1. Alle celletyper produsere lipiddråper, men de varierer i størrelse, lipidsammensetning, og protein dekorasjon. Lipiddråper oppfylle forskjellige funksjoner, blant annet tjener som energi- og membran forløper-reservoarer eller som proteinavsetninger. I tillegg, gjennom opptak av lipider, beskytte de celler fra lipotoxicity, frigjørings lipider som signalmolekyler, og er involvert i proteinnedbrytning og endoplasmatisk retikulum (ER) stressresponser 2. Som sådan en rekke proteiner som binder seg til lipiddråper og styrer deres generasjon, degradering, handel, og interaksjon med andre organeller. Blant dem er perilipin familie av bona fide oljedråpe-bindende proteiner (PLIN1-5)f &quot;&gt; 3. Oljedråpe biogenese sannsynligvis starter i ER, hvor ER-resident enzymer som katalyserer syntesen av nøytrale lipider som akkumuleres inne i membranbilaget, danner en linse av nøytrale lipider, en prosess som nylig ble visualisert pent i gjær 4. Membran bøying og forhøyede fosfatidsyre og diacylglycerol nivåer er da tenkt å tiltrekke proteiner involvert i fosfolipid-biosyntese, som simultan syntese av kjerne nøytrale lipider og fosfolipider skjerming er nødvendig for oljedråpe generasjon 5. Enzymer som rommer transmembranområdene som befinner seg ved den ER katalysere denne prosessen. Ekspansjon av store lipiddråper krever aktiviteten til en annen klasse av lipid-syntetiserende som havn en amfipatisk heliks og kan således bevege seg fra ER til lipiddråper. Mobilisering av lipider fra lipiddråper skjer gjennom lokal aktivering av triglyceride og diacylglycerol lipaser adipose triglycerid lipase (ATGL) og hormonsensitive lipase (HSL) eller ved hjelp av forskjellige autophagic reaksjonsveier, slik som makro- og microlipophagy eller anstand-mediert autophagy 6. Lipiddråper kommunisere med andre cellulære organeller, så som mitokondrier (for beta-oksidasjon og lipid syntese) og ER (for lipid syntese og protein handel), men også med lysosomer, endosomer, og vakuoler indusert av intracellulære bakterier 7. Faktisk bakterier, virus, parasitter og til og med å målrette lipiddråper for replikasjon og utholdenhet, blant dem HCV 8. HCV-infeksjon er en av de viktigste årsakene til leverrelaterte sykelighet og dødelighet over hele verden, og står for om lag 0,5 millioner dødsfall per år ni. Den sanne antall HCV infeksjoner er ukjent, men nyere anslag tyder på at 130 - 150 millioner mennesker er kronisk infisert. Ingen vaccine eksisterer, men nylig godkjent direkte-virkende antivirale dramatisk øke terapeutiske respons sammenlignet med den standard interferon-baserte terapi. Men på verdensbasis, behandling av pasienter vil trolig bli begrenset på grunn av den ekstremt høye kostnader for nye behandlingsformer. Omtrent halvparten av alle personer kronisk infisert med HCV utvikler fettleversykdom (steatose), en tilstand som kjennetegnes ved overdreven akkumulering av fettdråper i hepatocytter. Intriguingly, lipiddråper også utviklet seg til viktige cellulære organ for HCV-replikasjon, putatively tjener som virale montasjesider 10, 11. I HCV-infiserte celler, virusproteinet kjerne og NS5A lokalisere til lipiddråper i en prosess som er avhengig av triglycerid-biosyntese, som inhibitorer av diacylglycerol-acyltransferase-1 (DGAT1) svekke handelen til lipiddråper og påfølgende HCV framstilling av partikkelen 12 </sup&gt;, 13, 14, 15. I tillegg har mutasjoner i oljedråpe-bindende domener av enten kjernen eller NS5A undertrykke HCV sammenstillingen 16, 17. Kjerne og NS5A deretter rekruttere alle andre virale proteiner, så vel som virale RNA-replikasjonskomplekser, til membraner tett forbundet med lipiddråper 16. En felles virkning av alle virale proteiner nødvendig for en vellykket produksjon av infeksiøs virusavkom 10, 11. De strukturelle proteiner er en del av virioner, og de ikke-strukturelle proteiner fremmer protein-proteininteraksjoner som er nødvendige for denne fremgangsmåten. Intriguingly er bona fide oljedråpe-bindende protein PLIN3 / TIP47 som kreves for både HCV-RNA-replikasjon og frigjøring av virioner 18, 19 <sup&gt;, 20. Til tross for disse nylige fremskritt, de mekanistiske detaljer, spesielt av virus-vert interaksjoner i løpet av de sene stadier av HCV-replikasjon, forblir dårlig definert, og den nøyaktige funksjon av de lipiddråper er ukjent. Her beskriver vi en fremgangsmåte for å isolere lipiddråper for kvantitativ massespektrometri av assosierte proteiner. Ved hjelp av denne metode, fant vi dyptgående endringer i oljedråpe proteome i løpet av HCV infeksjon og identifisert annexin A3 som er vert-protein som ko-fraksjonerer med lipiddråper og er nødvendig for effektiv HCV-modning 21.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>SILAC Protein Quantitation Kit - DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>89983&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13C6 L-Arginine-HCl 50 mg</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>88210&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roti-Load 1</td>
			<td>Roth GmbH</td>
			<td>K929.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roti-Blue 5x-Concentrate</td>
			<td>Roth GmbH</td>
			<td>A152.2&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x SDS-Tris-Glycine - Buffer&#160;</td>
			<td>Geyer Th. GmbH &#38; Co.KG&#160;</td>
			<td>A1415,0250&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX (100x)</td>
			<td>Life Technologies GmbH&#160;</td>
			<td>350500038&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin Solution for Cell Culture</td>
			<td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH&#160;</td>
			<td>P4333-100ml&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1x Dulbeccos Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH&#160;</td>
			<td>D8537&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH&#160;</td>
			<td>T3924-100ML&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride BioChemica</td>
			<td>AppliChem GmbH</td>
			<td>A1149,1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Ultrapure&#160;&#160;</td>
			<td>AppliChem GmbH</td>
			<td>A1086,5000A&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA BioChemica</td>
			<td>AppliChem GmbH</td>
			<td>A1103,0250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail 5ml</td>
			<td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH&#160;</td>
			<td>P8340-5ML&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-Sucrose BioChemica</td>
			<td>AppliChem GmbH</td>
			<td>A3935,1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid 37% pure Ph. Eur., NF</td>
			<td>AppliChem GmbH</td>
			<td>A0625</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC Protein Assay&#160;</td>
			<td>Bio-Rad Laboratoris GmbH&#160;</td>
			<td>500-0116&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>AppliChem GmbH</td>
			<td>151339</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS Ultrapure</td>
			<td>AppliChem GmbH</td>
			<td>A1112</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>AppliChem GmbH</td>
			<td>A2331</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol&#160;</td>
			<td>AppliChem GmbH</td>
			<td>A4338</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blasticidin</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>ant-bl-1&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride&#160;</td>
			<td>AppliChem GmbH</td>
			<td>A1039</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethanesulfonyl Fluoride&#160;</td>
			<td>AppliChem GmbH</td>
			<td>A0999</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH&#160;</td>
			<td>221309</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dipotassium Hydrogenphosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH&#160;</td>
			<td>P3786&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT&#160;</td>
			<td>AppliChem GmbH</td>
			<td>A2948</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1694</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TWEEN 20</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A4974</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonfat dried milk powder</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A0830</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-ADFP/ ADRP&#160;</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab52355</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M6PRB1/TIP47 100&#181;g&#160;</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab47639</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calreticulin, pAb 200 &#181;g</td>
			<td>Enzo Life Science GmbH&#160;</td>
			<td>ADI-SPA-600-F&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-&#223;-Tubulin&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH&#160;</td>
			<td>T6074 200&#181;l &#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute</td>
			<td>Geyer Th. GmbH &#38; Co.KG&#160;</td>
			<td>A3678,0250 &#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-MnSOD</td>
			<td>Enzo Life Science GmbH&#160;</td>
			<td>ADI-SOD-110-F</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse HRP</td>
			<td>Thermo Fisher Pierce</td>
			<td>32430</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit HRP</td>
			<td>Thermo Fisher&#160; Pierce</td>
			<td>32460</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham Hyperfilm ECL</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28906836</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lumi-Light Western Blotting Substrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH&#160;</td>
			<td>12015196001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 Well Cell Culture Plate</td>
			<td>Greiner Bio-One GmbH&#160;</td>
			<td>655 180&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terumo Syringe 1 ml</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>SS-01T</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtropur BT 50, 500 ml, 0.45 &#181;m&#160;</td>
			<td>SARSTEDT&#160;</td>
			<td>83.1823.100&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN TGX Precast Gels, Any kD resolving gel</td>
			<td>Bio-Rad Laboratoris GmbH&#160;</td>
			<td>456-9034&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 Well Cell Culture Plate</td>
			<td>Greiner Bio-One GmbH&#160;</td>
			<td>657160&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dishes Nunclon 150/20&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific GmbH&#160;</td>
			<td>10098720 - 168381&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Scraper</td>
			<td>neoLab Migge GmbH&#160;</td>
			<td>C-8120&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube, 50 ml</td>
			<td>Greiner Bio-One GmbH&#160;</td>
			<td>227261&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SafeSeal Tube RNase-free&#160;</td>
			<td>SARSTEDT&#160;</td>
			<td>72.706.400&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra Clear Centrifuge Tubes 11 x 60 mm</td>
			<td>Beckman Coulter GmbH&#160;</td>
			<td>344062&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suction Needles</td>
			<td>Transcodent</td>
			<td>6482</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosphere Fil. Tip 1000&#160;</td>
			<td>SARSTEDT&#160;</td>
			<td>70.762.211&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosphere Fil. Tip 200</td>
			<td>SARSTEDT&#160;</td>
			<td>70.760.211&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosphere Fil. Tip 10</td>
			<td>SARSTEDT&#160;</td>
			<td>70.1130.210&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce Tissue Grinder</td>
			<td>Fisher Scientific GmbH&#160;</td>
			<td>11883722</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pestles For Dounce All-Glass Tissue Grinders</td>
			<td>Fisher Scientific GmbH&#160;</td>
			<td>10389444</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbitrap Fusion</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson Sonifier 450</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer comfort, with Thermoblock 1.5 ml</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5355&#160;000.127</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN Tetra Cell, Mini Trans-Blot Module, and PowerPac Basic Power Supply,&#160;</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>165-8033</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN 3 Multi-Casting Chamber</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>165-4110</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerPac HC Power Supply</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>164-5052</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima L-90K</td>
			<td>Beckman Coulter GmbH&#160;</td>
			<td>365670</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW 60 Ti Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter GmbH&#160;</td>
			<td>335649</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infinite M1000 PRO</td>
			<td>Tecan</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lipid droplet isolation for quantitative mass spectrometry analysis

Lipiddråper er avgjørende for replikasjon av en rekke forskjellige patogener, mest utpreget et hepatitt C-virus (HCV), som det antatte området av virion morfogenese. Kvantitativ oljedråpe proteomanalyse kan brukes for å identifisere proteiner som lokaliserer seg til eller er forskjøvet fra lipiddråper under betingelser slik som virusinfeksjoner. Her beskriver vi en protokoll som har blitt brukt for å karakterisere endringer i lipid dråpe proteomet følgende infeksjon med HCV. Vi bruker stabile isotoper Merking med Amino Acids in Cell Culture (SILAC) og således merke den komplette proteomet av en populasjon av celler med &quot;tunge&quot; aminosyrer å kvantifisere proteinene ved hjelp av massespektrometri. For oljedråpe isolasjon, er de to cellepopulasjoner (dvs. HCV-infiserte / &quot;lette&quot; aminosyrer og uinfiserte kontroll / &quot;tunge&quot; aminosyrer) blir blandet 1: 1 og lysert mekanisk i hypoton buffer. Etter fjerning av kjerner og celle debris ved lavhastighetssentrifugering, blir oljedråpe-assosierte proteiner anriket ved to påfølgende ultra-sentrifugeringstrinn etterfulgt av tre vasketrinn i isotonisk buffer. Renheten av de oljedråpe fraksjonene blir analysert ved western blotting med antistoffer som gjenkjenner forskjellige subcellulære rom. Oljedråpe-assosierte proteiner blir deretter separert ved SDS-polyakrylamid gelelektroforese (SDS-PAGE) etterfulgt av Coomassie-farging. Etter trypsinfordøyelse blir peptidene kvantifisert ved hjelp av væske-kromatografi-elektrospray ionisering-tandem massespektrometri (LC-ESI-MS / MS). Ved hjelp av denne metode, identifiserte vi proteiner som rekrutteres til lipiddråper ved HCV-infeksjon som kan representere pro- eller antivirale vertsfaktorer. Vår fremgangsmåte kan anvendes på en rekke forskjellige celler og dyrkningsbetingelser, som for eksempel infeksjon med patogener, omgivende stress, eller medikamentell behandling.

Lipiddråper er avgjørende for HCV-infeksjon som de antatte områder av virion montering, men de molekylære mekanismer for morfogenese og utgang av virioner er stort sett ukjent. For å identifisere nye vert avhengighet faktorer som er involvert i den prosess, utførte vi kvantitativ oljedråpe proteomanalyse av HCV-infiserte celler 21 (figur 1A). Vi har etablert en protokoll for rensing av lipiddråper og rutinemessig påvist ved en sterk anrik...

Watch this Scientific Journal Video about Lipid Droplet Isolation for Quantitative Mass Spectrometry Analysis at JoVE.com

Lipid Droplet Isolation for Quantitative Mass Spectrometry Analysis

Lipiddråper er viktige organeller for replikasjon av flere patogener, inkludert hepatitt C-virus (HCV). Vi beskriver en metode for å isolere lipiddråper for kvantitativ massespektrometri av assosierte proteiner; den kan brukes under forskjellige forhold, for eksempel virus infeksjon, omgivende stress, eller medikamentell behandling.

Lipid Droplet Isolasjon for Quantitative massespektrometri analyse

Lipid droplets are vital to the replication of a variety of different pathogens, most prominently the Hepatitis C Virus (HCV), as the putative site of ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Time-løst elektrospray-ionisering Hydrogen-deuterium Veksling massespektrometri for å studere Protein struktur og dynamikk

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Løse affinitetsrenset protein komplekser av Blå Native PAGE og Protein korrelasjon Profiling

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

A Tandem Liquid Chromatography&#8211;Mass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

A Tandem Liquid ChromatographyÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

Et tandem-væskekromatografi-massespektrometri basert tilnærming for Metabolitt Analyse av<em&gt; Staphylococcus aureus</em

In an effort to thwart bacterial pathogens, hosts often limit the availability of nutrients at the site of infection. This limitation can alter the ...

Glycoproteomics of the Extracellular Matrix: A Method for Intact Glycopeptide Analysis Using Mass Spectrometry

Glycoproteomics av ​​den ekstracellulære matrise: En metode for Intakt glykopeptidreagens analyse ved hjelp av massespektrometri

Fibrosis is a hallmark of many cardiovascular diseases and is associated with the exacerbated secretion and deposition of the extracellular matrix (ECM). ...

Proofreading and DNA Repair Assay Using Single Nucleotide Extension and MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis

Korrekturlesing og DNA reparasjon analysen Single nukleotid forlengelse og MALDI-TOF massespektrometri analyse

The maintenance of the genome and its faithful replication is paramount for conserving genetic information. To assess high fidelity replication, we have ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

Nitropeptide profilering og identifisering illustrert av angiotensin II

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Prøve forberedelse til sonde elektrospray ionisering massespektrometri

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

Use of Microscale Thermophoresis to Measure Protein-Lipid Interactions

Bruk av mikroskala termoforese for å måle protein-lipid interaksjoner

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Kvantitativ analyse av cellulær lipidom eav saccharomyces cerevisiae ved hjelp av flytende kromatografi kombinert med tandem massespektrometri

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain

Umålrettet flytende kromatografi-massespektrometribasert metabolomikkanalyse av hvetekorn

Understanding the interactions between genes, the environment and management in agricultural practice could allow more accurate prediction and management ...