Name: lipid droplet isolation for quantitative mass spectrometry analysis
Uploaded: 2017-04-17T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Lipid Droplet Isolation for Quantitative Mass Spectrometry Analysis at JoVE.com

Vi tackar R. Bartenschlager (University of Heidelberg) för JC1 konstruktioner, CM Rice (Rockefeller University) för Huh7.5 celler, J. McLauchlan (Medical Research Council Virology Unit) för JFH1 bygga, T. Wakita (National Institute of infektions~~POS=TRUNC sjukdomar~~POS=HEADCOMP, Japan) för JFH1, och B. Webster och WC Greene (Gladstone Institute of Virology and Immunology) för de HCVcc reporterkonstruktioner. Detta arbete stöddes av medel från DFG (HE 6889 / 2-1 (EH), Inst 337 / 15-1 2013 och INST 337 / 16-1 2013 (HS)). Heinrich Pette Institute, Leibniz Institute for Experimental Virology stöds av Free och hansastaden Hamburg och den federala hälsoministeriet. Finansiärerna hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut att publicera, eller beredning av manuskriptet.

1. Framställning av Media for Stable Isotope Märkning med Aminosyror i Cell Culture (SILAC) OBS: Här, den SILAC Protein Kvantifiering Kit - DMEM kompletterat med 50 mg av 13 C 6 L-arginin-HCl användes för SILAC märkning. Den dialyserade fetalt kalvserum (FCS) är försedd med den SILAC Protein Kvantifiering Kit. <ol><li> Avlägsna 50 ml från varje flaska DMEM-medium och tillsätt 50 ml av dialyserad FCS. </li><li> Lös upp 50 mg av 13 C 6 ...

<ol>
	<li>Thiam, A. R., Farese, R. V., Walther, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biophysics+and+cell+biology+of+lipid+droplets.">The biophysics and cell biology of lipid droplets.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (12), 775-786 (2013).</li><li>Welte, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+roles+for+lipid+droplets.">Expanding roles for lipid droplets.</a> Curr Biol. 25 (11), R470-R481 (2015).</li><li>Brasaemle, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thematic+review+series:+adipocyte+biology.+The+perilipin+family+of+structural+lipid+droplet+proteins:+stabilization+of+lipid+droplets+and+control+of+lipolysis.">Thematic review series: adipocyte biology. The perilipin family of structural lipid droplet proteins: stabilization of lipid droplets and control of lipolysis.</a> J Lipid Res. 48 (12), 2547-2559 (2007).</li><li>Choudhary, V., Ojha, N., Golden, A., Prinz, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+family+of+proteins+facilitates+nascent+lipid+droplet+budding+from+the+ER.">A conserved family of proteins facilitates nascent lipid droplet budding from the ER.</a> J Cell Biol. 211 (2), 261-271 (2015).</li><li>Kory, N., Farese, R. V., Walther, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Fat:+Mechanisms+of+Protein+Localization+to+Lipid+Droplets.">Targeting Fat: Mechanisms of Protein Localization to Lipid Droplets.</a> Trends Cell Biol. 26 (7), 535-546 (2016).</li><li>Hashemi, H. F., Goodman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+life+cycle+of+lipid+droplets.">The life cycle of lipid droplets.</a> Curr Opin Cell Biol. 33, 119-124 (2015).</li><li>Gao, Q., Goodman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lipid+droplet-a+well-connected+organelle.">The lipid droplet-a well-connected organelle.</a> Front Cell Dev Biol. 3, 49 (2015).</li><li>Herker, E., Ott, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+role+of+lipid+droplets+in+host/pathogen+interactions.">Emerging role of lipid droplets in host/pathogen interactions.</a> J Biol Chem. 287 (4), 2280-2287 (2012).</li><li>Wedemeyer, H., Dore, G. J., Ward, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimates+on+HCV+disease+burden+worldwide+-+filling+the+gaps.">Estimates on HCV disease burden worldwide - filling the gaps.</a> J Viral Hepat. 22 Suppl 1, 1-5 (2015).</li><li>Paul, D., Madan, V., Bartenschlager, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatitis+C+virus+RNA+replication+and+assembly:+living+on+the+fat+of+the+land.">Hepatitis C virus RNA replication and assembly: living on the fat of the land.</a> Cell Host Microbe. 16 (5), 569-579 (2014).</li><li>Lindenbach, B. D., Rice, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ins+and+outs+of+hepatitis+C+virus+entry+and+assembly.">The ins and outs of hepatitis C virus entry and assembly.</a> Nat Rev Microbiol. 11 (10), 688-700 (2013).</li><li>Barba, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatitis+C+virus+core+protein+shows+a+cytoplasmic+localization+and+associates+to+cellular+lipid+storage+droplets.">Hepatitis C virus core protein shows a cytoplasmic localization and associates to cellular lipid storage droplets.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (4), 1200-1205 (1997).</li><li>Shi, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatitis+C+virus+NS5A+colocalizes+with+the+core+protein+on+lipid+droplets+and+interacts+with+apolipoproteins.">Hepatitis C virus NS5A colocalizes with the core protein on lipid droplets and interacts with apolipoproteins.</a> Virology. 292 (2), 198-210 (2002).</li><li>Herker, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+hepatitis+C+virus+particle+formation+requires+diacylglycerol+acyltransferase-1.">Efficient hepatitis C virus particle formation requires diacylglycerol acyltransferase-1.</a> Nat Med. 16 (11), 1295-1298 (2010).</li><li>Camus, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diacylglycerol+acyltransferase-1+localizes+hepatitis+C+virus+NS5A+protein+to+lipid+droplets+and+enhances+NS5A+interaction+with+the+viral+capsid+core.">Diacylglycerol acyltransferase-1 localizes hepatitis C virus NS5A protein to lipid droplets and enhances NS5A interaction with the viral capsid core.</a> J Biol Chem. 288 (14), 9915-9923 (2013).</li><li>Miyanari, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lipid+droplet+is+an+important+organelle+for+hepatitis+C+virus+production.">The lipid droplet is an important organelle for hepatitis C virus production.</a> Nat Cell Biol. 9 (9), 1089-1097 (2007).</li><li>Boulant, S., Targett-Adams, P., McLauchlan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disrupting+the+association+of+hepatitis+C+virus+core+protein+with+lipid+droplets+correlates+with+a+loss+in+production+of+infectious+virus.">Disrupting the association of hepatitis C virus core protein with lipid droplets correlates with a loss in production of infectious virus.</a> J Gen Virol. 88 (Pt 8), 2204-2213 (2007).</li><li>Vogt, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplet-binding+protein+TIP47+regulates+hepatitis+C+Virus+RNA+replication+through+interaction+with+the+viral+NS5A+protein.">Lipid droplet-binding protein TIP47 regulates hepatitis C Virus RNA replication through interaction with the viral NS5A protein.</a> PLoS Pathog. 9 (4), e1003302 (2013).</li><li>Ploen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TIP47+plays+a+crucial+role+in+the+life+cycle+of+hepatitis+C+virus.">TIP47 plays a crucial role in the life cycle of hepatitis C virus.</a> J Hepatol. 58 (6), 1081-1088 (2013).</li><li>Ploen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TIP47+is+associated+with+the+hepatitis+C+virus+and+its+interaction+with+Rab9+is+required+for+release+of+viral+particles.">TIP47 is associated with the hepatitis C virus and its interaction with Rab9 is required for release of viral particles.</a> Eur J Cell Biol. 92 (12), 374-382 (2013).</li><li>Rosch, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Lipid+Droplet+Proteome+Analysis+Identifies+Annexin+A3+as+a+Cofactor+for+HCV+Particle+Production.">Quantitative Lipid Droplet Proteome Analysis Identifies Annexin A3 as a Cofactor for HCV Particle Production.</a> Cell Rep. 16 (12), 3219-3231 (2016).</li><li>Kwiatkowski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+extraction+of+proteins+from+tissues+using+desorption+by+impulsive+vibrational+excitation.">Ultrafast extraction of proteins from tissues using desorption by impulsive vibrational excitation.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 54 (1), 285-288 (2015).</li><li>Webster, B., Ott, M., Greene, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evasion+of+superinfection+exclusion+and+elimination+of+primary+viral+RNA+by+an+adapted+strain+of+hepatitis+C+virus.">Evasion of superinfection exclusion and elimination of primary viral RNA by an adapted strain of hepatitis C virus.</a> J Virol. 87 (24), 13354-13369 (2013).</li><li>Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-gel+digestion+for+mass+spectrometric+characterization+of+proteins+and+proteomes.">In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes.</a> Nat Protoc. 1 (6), 2856-2860 (2006).</li><li>Ting, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normalization+and+statistical+analysis+of+quantitative+proteomics+data+generated+by+metabolic+labeling.">Normalization and statistical analysis of quantitative proteomics data generated by metabolic labeling.</a> Mol Cell Proteomics. 8 (10), 2227-2242 (2009).</li><li>Brasaemle, D. L., Dolios, G., Shapiro, L., Wang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+proteins+associated+with+lipid+droplets+of+basal+and+lipolytically+stimulated+3T3-L1+adipocytes.">Proteomic analysis of proteins associated with lipid droplets of basal and lipolytically stimulated 3T3-L1 adipocytes.</a> J Biol Chem. 279 (45), 46835-46842 (2004).</li><li>Tingting, P., Caiyun, F., Zhigang, Y., Pengyuan, Y., Zhenghong, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subproteomic+analysis+of+the+cellular+proteins+associated+with+the+3'+untranslated+region+of+the+hepatitis+C+virus+genome+in+human+liver+cells.">Subproteomic analysis of the cellular proteins associated with the 3' untranslated region of the hepatitis C virus genome in human liver cells.</a> Biochem Biophys Res Commun. 347 (3), 683-691 (2006).</li><li>Ariumi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DDX3+DEAD-box+RNA+helicase+is+required+for+hepatitis+C+virus+RNA+replication.">DDX3 DEAD-box RNA helicase is required for hepatitis C virus RNA replication.</a> J Virol. 81 (24), 13922-13926 (2007).</li><li>Weinlich, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IGF2BP1+enhances+HCV+IRES-mediated+translation+initiation+via+the+3'UTR.">IGF2BP1 enhances HCV IRES-mediated translation initiation via the 3'UTR.</a> RNA. 15 (8), 1528-1542 (2009).</li></ol>

Här beskriver vi ett protokoll för att isolera lipiddroppar för kvantitativ lipiddroppe proteomanalys att jämföra anrikning och utarmning av proteiner associerade med lipiddroppar enligt olika odlingsbetingelser, såsom virala infektioner. Som en alternativ metod, kan den proteomanalys utföras med märkningsfria kvantifieringar baserade på totala toppintensiteter. Denna metod har ingen dynamisk begränsning område och undviker metaboliska problem. Fördelen med SILAC tillvägagångssätt är att proverna poolas ...

<html> Lipiddroppar är högdynamiska cytoplasmatiska (och nukleära) cellorganeller som består av en kärna av neutrala lipider (triglycerider (TG) och kolesterolester (CE)) inneslutet av ett monoskikt av fosfolipider med inbäddade proteiner 1. Alla celltyper producerar lipiddroppar, men de varierar i storlek, lipidkomposition och protein dekoration. Lipiddroppar uppfylla olika funktioner, inklusive tjänar som energi- och membranbildande reservoarer eller som proteinavlagringar. Dessutom, genom upptaget av lipider, skydda de celler från lipotoxicitet, släpp lipider som signalmolekyler, och är inblandade i proteinnedbrytning och endoplasmatiska nätverket (ER) stressresponser 2. Som sådan, en mängd proteiner binder till lipiddroppar och styra deras generation, nedbrytning, trafficking, och interaktion med andra organeller. Bland dem är den perilipin familjen av bona fide lipiddroppe bindande proteiner (PLIN1-5)f &quot;&gt; 3. Lipiddroppe biogenes sannolikt börjar vid ER, där ER-resident enzymer katalyserar syntesen av neutrala lipider som ackumuleras inuti membrandubbelskikt, som bildar en lins av neutrala lipider, en process som nyligen visualiserades snyggt i jäst 4. Membran böjning och förhöjda fosfatidinsyra och diacylglycerol nivåer sedan tänkt att locka proteiner involverade i fosfolipid-biosyntesen, såsom den samtidiga syntesen av de centrala neutrala lipider och avskärmnings fosfolipider krävs för lipiddroppe generation 5. Enzymer som härbärgerar transmembrandomäner som bor vid ER katalyserar denna process. Expansionen till stora lipiddroppar kräver aktiviteten av en annan klass av lipid-syntetiserande enzymer som härbärgerar en amfipatisk helix och kan sålunda reser från ER till lipiddroppar. Mobiliseringen av lipider från lipiddroppar sker genom den lokala aktiveringen av triglyceride och diacylglycerol lipaser adipös triglyceridlipas (ATGL) och hormonkänsligt lipas (HSL) eller genom olika autophagic reaktionsvägar, såsom makro- och microlipophagy eller kaperonet medierad autophagy 6. Lipiddroppar interagera med andra cellulära organeller, såsom mitokondrier (för beta-oxidation och lipidsyntes) och ER (för lipidsyntes och protein trafficking), men också med lysosomer, endosomer och de vakuoler som induceras av intracellulära bakterier 7. I själva verket bakterier, virus och även parasiter rikta lipiddropparna för replikering och uthållighet, bland dem HCV 8. HCV-infektion är en av de viktigaste orsakerna till leverrelaterad sjuklighet och dödlighet i världen, står för ungefär 0,5 miljoner dödsfall per år 9. Det verkliga antalet HCV-infektioner är okänd, men de senaste uppskattningar tyder på att 130 - 150 miljoner människor är kroniskt infekterade. Ingen vaccine finns, men den nyligen godkända direktverkande antivirala läkemedel ökar terapeutiska svar dramatiskt jämfört med standardinterferonbaserad behandling. Men över hela världen, för behandling av patienter kommer sannolikt att begränsas på grund av de extremt höga kostnaderna för nya läkemedel. Ungefär hälften av alla personer kroniskt infekterade med HCV utvecklar fettlever (leversteatos), ett tillstånd som kännetecknas av överdriven ansamling av lipiddroppar i hepatocyter. Intriguingly, lipiddroppar framkom också som vitala cellulära organeller för HCV-replikation, förmodat tjänstgör som virala monteringsställen 10, 11. I HCV-infekterade celler, det virala proteinkärnan och NS5A lokalisera till lipiddroppar i en process som är beroende av triglycerid biosyntes, som inhibitorer av diacylglycerol-acyltransferas-1 (DGAT1) försämra trafficking till lipiddroppar och efterföljande HCV partikelproduktion 12 </sup&gt;, 13, 14, 15. Dessutom mutationer i lipid droppbindande domäner av antingen kärnan eller NS5A trycka HCV aggregatet 16, 17. Kärnan och NS5A sedan rekrytera alla andra virala proteiner, såväl som virala RNA-replikationskomplex, till membran närstående lipiddroppar 16. Krävs En samordnad verkan av alla virala proteiner för framgångsrik produktion av infektiös viral avkomma 10, 11. De strukturella proteinerna är en del av virionerna, och de icke-strukturella proteinerna främja protein-proteininteraktioner som krävs för denna process. Intriguingly är bona fide lipiddroppe-bindande protein PLIN3 / TIP47 krävs för både HCV RNA-replikation och frisättning av virioner 18, 19 <sup&gt;, 20. Trots dessa nya framsteg, de mekanistiska detaljerna, särskilt av virusvärdinteraktioner under sena stadier av HCV-replikation, förblir dåligt definierad och den exakta funktion lipiddropparna är okänd. Här beskriver vi en metod för att isolera lipiddroppar för kvantitativ masspektrometri av associerade proteiner. Användning av denna metod fann vi djupgående förändringar i lipiddroppe proteomet under HCV-infektion och identifierad annexin A3 som ett värdprotein som co-fraktionerar med lipiddroppar och krävs för effektiv HCV mognad 21.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>SILAC Protein Quantitation Kit - DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>89983&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13C6 L-Arginine-HCl 50 mg</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>88210&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roti-Load 1</td>
			<td>Roth GmbH</td>
			<td>K929.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roti-Blue 5x-Concentrate</td>
			<td>Roth GmbH</td>
			<td>A152.2&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x SDS-Tris-Glycine - Buffer&#160;</td>
			<td>Geyer Th. GmbH &#38; Co.KG&#160;</td>
			<td>A1415,0250&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX (100x)</td>
			<td>Life Technologies GmbH&#160;</td>
			<td>350500038&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin Solution for Cell Culture</td>
			<td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH&#160;</td>
			<td>P4333-100ml&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1x Dulbeccos Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH&#160;</td>
			<td>D8537&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH&#160;</td>
			<td>T3924-100ML&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride BioChemica</td>
			<td>AppliChem GmbH</td>
			<td>A1149,1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Ultrapure&#160;&#160;</td>
			<td>AppliChem GmbH</td>
			<td>A1086,5000A&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA BioChemica</td>
			<td>AppliChem GmbH</td>
			<td>A1103,0250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail 5ml</td>
			<td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH&#160;</td>
			<td>P8340-5ML&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-Sucrose BioChemica</td>
			<td>AppliChem GmbH</td>
			<td>A3935,1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid 37% pure Ph. Eur., NF</td>
			<td>AppliChem GmbH</td>
			<td>A0625</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC Protein Assay&#160;</td>
			<td>Bio-Rad Laboratoris GmbH&#160;</td>
			<td>500-0116&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>AppliChem GmbH</td>
			<td>151339</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS Ultrapure</td>
			<td>AppliChem GmbH</td>
			<td>A1112</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>AppliChem GmbH</td>
			<td>A2331</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol&#160;</td>
			<td>AppliChem GmbH</td>
			<td>A4338</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blasticidin</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>ant-bl-1&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride&#160;</td>
			<td>AppliChem GmbH</td>
			<td>A1039</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethanesulfonyl Fluoride&#160;</td>
			<td>AppliChem GmbH</td>
			<td>A0999</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH&#160;</td>
			<td>221309</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dipotassium Hydrogenphosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH&#160;</td>
			<td>P3786&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT&#160;</td>
			<td>AppliChem GmbH</td>
			<td>A2948</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1694</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TWEEN 20</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A4974</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonfat dried milk powder</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A0830</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-ADFP/ ADRP&#160;</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab52355</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M6PRB1/TIP47 100&#181;g&#160;</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab47639</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calreticulin, pAb 200 &#181;g</td>
			<td>Enzo Life Science GmbH&#160;</td>
			<td>ADI-SPA-600-F&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-&#223;-Tubulin&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH&#160;</td>
			<td>T6074 200&#181;l &#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute</td>
			<td>Geyer Th. GmbH &#38; Co.KG&#160;</td>
			<td>A3678,0250 &#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-MnSOD</td>
			<td>Enzo Life Science GmbH&#160;</td>
			<td>ADI-SOD-110-F</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse HRP</td>
			<td>Thermo Fisher Pierce</td>
			<td>32430</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit HRP</td>
			<td>Thermo Fisher&#160; Pierce</td>
			<td>32460</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham Hyperfilm ECL</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28906836</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lumi-Light Western Blotting Substrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH&#160;</td>
			<td>12015196001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 Well Cell Culture Plate</td>
			<td>Greiner Bio-One GmbH&#160;</td>
			<td>655 180&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terumo Syringe 1 ml</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>SS-01T</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtropur BT 50, 500 ml, 0.45 &#181;m&#160;</td>
			<td>SARSTEDT&#160;</td>
			<td>83.1823.100&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN TGX Precast Gels, Any kD resolving gel</td>
			<td>Bio-Rad Laboratoris GmbH&#160;</td>
			<td>456-9034&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 Well Cell Culture Plate</td>
			<td>Greiner Bio-One GmbH&#160;</td>
			<td>657160&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dishes Nunclon 150/20&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific GmbH&#160;</td>
			<td>10098720 - 168381&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Scraper</td>
			<td>neoLab Migge GmbH&#160;</td>
			<td>C-8120&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube, 50 ml</td>
			<td>Greiner Bio-One GmbH&#160;</td>
			<td>227261&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SafeSeal Tube RNase-free&#160;</td>
			<td>SARSTEDT&#160;</td>
			<td>72.706.400&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra Clear Centrifuge Tubes 11 x 60 mm</td>
			<td>Beckman Coulter GmbH&#160;</td>
			<td>344062&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suction Needles</td>
			<td>Transcodent</td>
			<td>6482</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosphere Fil. Tip 1000&#160;</td>
			<td>SARSTEDT&#160;</td>
			<td>70.762.211&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosphere Fil. Tip 200</td>
			<td>SARSTEDT&#160;</td>
			<td>70.760.211&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosphere Fil. Tip 10</td>
			<td>SARSTEDT&#160;</td>
			<td>70.1130.210&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce Tissue Grinder</td>
			<td>Fisher Scientific GmbH&#160;</td>
			<td>11883722</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pestles For Dounce All-Glass Tissue Grinders</td>
			<td>Fisher Scientific GmbH&#160;</td>
			<td>10389444</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbitrap Fusion</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson Sonifier 450</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer comfort, with Thermoblock 1.5 ml</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5355&#160;000.127</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN Tetra Cell, Mini Trans-Blot Module, and PowerPac Basic Power Supply,&#160;</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>165-8033</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN 3 Multi-Casting Chamber</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>165-4110</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerPac HC Power Supply</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>164-5052</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima L-90K</td>
			<td>Beckman Coulter GmbH&#160;</td>
			<td>365670</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW 60 Ti Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter GmbH&#160;</td>
			<td>335649</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infinite M1000 PRO</td>
			<td>Tecan</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lipid droplet isolation for quantitative mass spectrometry analysis

Lipiddroppar är avgörande för replikation av en mängd olika patogener, framförallt den hepatit C-virus (HCV), som det förmodade stället hos virion morfogenes. Kvantitativ lipiddroppe proteomanalys kan användas för att identifiera proteiner som lokaliserar till eller är förskjutna från lipiddroppar under betingelser såsom virusinfektioner. Här beskriver vi ett protokoll som har använts med framgång för att karakterisera förändringar i lipiddroppe proteomet efter infektion med HCV. Vi använder stabila isotopen Märkning med Aminosyror i Cell Culture (SILAC) och därmed märka den kompletta proteomet av en population av celler med &quot;tunga&quot; aminosyror för att kvantifiera proteiner genom masspektrometri. För lipiddroppe isolering, är de två cellpopulationer (dvs. HCV-infekterade / &quot;lätta&quot; aminosyror och oinfekterade kontroll / &quot;tunga&quot; aminosyror) blandades 1: 1 och lyserades mekaniskt i hypoton buffert. Efter avlägsnande av kärnor och cell debris genom låghastighetscentrifugering, är lipid droppassocierade proteiner anrikas genom två efterföljande ultracentrifugeringssteg följt av tre tvättningssteg i isoton buffert. Renheten hos de lipid-dropp fraktionerna analyseras genom Western blotting med antikroppar som känner igen olika subcellulära utrymmen. Lipid droppassocierade proteiner separeras sedan genom SDS-polyakrylamidgelelektrofores (SDS-PAGE) följt av Coomassie-färgning. Efter tryptisk digere peptiderna kvantifierades med vätskekromatografi-elektrosprayjonisering-tandemmasspektrometri (LC-ESI-MS / MS). Med denna metod, identifierade vi proteiner som rekryteras till lipiddropparna vid HCV-infektion som kan tyda pro- eller antivirala värdfaktorer. Vår metod kan tillämpas på en mängd olika celler och odlingsbetingelser, såsom infektion med patogener, miljöstress, eller läkemedelsbehandling.

Lipiddroppar är avgörande för HCV-infektion som de förmodade ställen för virionsammanfogningen, men de molekylära mekanismerna för morfogenes och utträde av virioner är till stor del okända. Att identifiera nya värdberoende faktorer inblandade i denna process, utförde vi kvantitativ lipiddroppe proteomanalys av HCV-infekterade celler 21 (figur 1A). Vi etablerat ett protokoll för rening av lipiddroppar och rutinmässigt detekteras en ...

Watch this Scientific Journal Video about Lipid Droplet Isolation for Quantitative Mass Spectrometry Analysis at JoVE.com

Lipid Droplet Isolation for Quantitative Mass Spectrometry Analysis

Lipiddroppar är viktiga organeller för replikation av flera patogener, däribland hepatit C-virus (HCV). Vi beskriver ett förfarande för att isolera lipiddroppar för kvantitativ masspektrometri av associerade proteiner; den kan användas under en mängd olika tillstånd, såsom virusinfektion, miljöstress, eller läkemedelsbehandling.

Lipid Droplet Isolation för Kvantitativ masspektrometri Analys

Lipid droplets are vital to the replication of a variety of different pathogens, most prominently the Hepatitis C Virus (HCV), as the putative site of ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Tidsupplöst elektrosprayjonisering Väte-deuterium Exchange-masspektrometri för att studera Protein Structure and Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Lösa affinitetsrenat proteinkomplex av Blue Native PAGE och protein Korrelation profilering

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

A Tandem Liquid Chromatography&#8211;Mass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

A Tandem Liquid ChromatographyÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

En Tandem vätskekromatografi-masspektrometri baserad strategi för metabolit analys av<em&gt; Staphylococcus aureus</em

In an effort to thwart bacterial pathogens, hosts often limit the availability of nutrients at the site of infection. This limitation can alter the ...

Glycoproteomics of the Extracellular Matrix: A Method for Intact Glycopeptide Analysis Using Mass Spectrometry

Glycoproteomics av ​​den extracellulära matrisen: En metod för intakt glykopeptiden analys med masspektrometri

Fibrosis is a hallmark of many cardiovascular diseases and is associated with the exacerbated secretion and deposition of the extracellular matrix (ECM). ...

Proofreading and DNA Repair Assay Using Single Nucleotide Extension and MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis

Korrekturläsning och DNA reparation Assay använder Single Nucleotide förlängning och MALDI-TOF-masspektrometri.

The maintenance of the genome and its faithful replication is paramount for conserving genetic information. To assess high fidelity replication, we have ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

Nitropeptid profilering och identifiering illustrerad av angiotensin II

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Provberedning för probe electrospray jonisering Masspektrometri

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

Use of Microscale Thermophoresis to Measure Protein-Lipid Interactions

Användning av mikroskala termofores för att mäta protein-lipidinteraktioner

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Kvantitativ analys av cellulär lipidom e av Saccharomyces Cerevisiae med hjälp av flytande kromatografi tillsammans med Tandem Mass Spectrometri

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain

Oriktad flytande kromatografi-Mass Pektrometri-Baserade metabolomika analys av vetekorn

Understanding the interactions between genes, the environment and management in agricultural practice could allow more accurate prediction and management ...