Name: using a fluorescent pcr-capillary gel electrophoresis technique to genotype crispr/cas9-mediated knockout mutants in a high-throughput format
Uploaded: 2017-04-08T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using a Fluorescent PCR-capillary Gel Electrophoresis Technique to Genotype CRISPR/Cas9-mediated Knockout Mutants in a High-throughput Format at JoVE.com

فإن الكتاب أود أن أشكر السيدة تان شي مين، السيدة هيلين اونج، والدكتور زاو يي لمساعدة مع التجارب الشعرية الكهربائي للهلام. وأيد هذا العمل من قبل NMRC / IRG منح NMRC / 1314/2011 وزارة التربية والتعليم AcRF المستوى 2 منحة صندوق MOE2011-T2-1-051.

1. الحصول على كريسبر / استهدفت Cas9-النسخ وحيدة الخلية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلايا البذور HEPG2 على طبق من 6 جيدا في 500،000 الخلايا لكل بئر في 2 مل من المضادات الحيوية خالية Dulbecco لتعديل النسر المتوسطة (DMEM) تستكمل مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS). احتضان لمدة 24...

<ol>
	<li>Chang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/cas9,+a+novel+genomic+tool+to+knock+down+microRNA+in+vitro+and+in+vivo.">CRISPR/cas9, a novel genomic tool to knock down microRNA in vitro and in vivo.</a> Sci. Rep. 6, 22312 (2016).</li><li>O'Connell, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmable+RNA+recognition+and+cleavage+by+CRISPR/Cas9.">Programmable RNA recognition and cleavage by CRISPR/Cas9.</a> Nature. 516, 263-266 (2014).</li><li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+nicking+by+RNA-guided+CRISPR+Cas9+for+enhanced+genome+editing+specificity.">Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity.</a> Cell. 154, 1380-1389 (2013).</li><li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nat. Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li><li>Perez, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+HIV-1+resistance+in+CD4++T+cells+by+genome+editing+using+zinc-finger+nucleases.">Establishment of HIV-1 resistance in CD4+ T cells by genome editing using zinc-finger nucleases.</a> Nat. Biotechnol. 26, 808-816 (2008).</li><li>Santiago, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+knockout+in+mammalian+cells+by+using+engineered+zinc-finger+nucleases.">Targeted gene knockout in mammalian cells by using engineered zinc-finger nucleases.</a> P. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 5809-5814 (2008).</li><li>Sung, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knockout+mice+created+by+TALEN-mediated+gene+targeting.">Knockout mice created by TALEN-mediated gene targeting.</a> Nat. Biotechnol. 31, 23-24 (2013).</li><li>Shalem, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+CRISPR-Cas9+knockout+screening+in+human+cells.">Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells.</a> Science. 343, 84-87 (2014).</li><li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+of+a+CRISPR/Cas9+library+for+functional+genomics+in+human+cells.">High-throughput screening of a CRISPR/Cas9 library for functional genomics in human cells.</a> Nature. 509, 487-491 (2014).</li><li>Guschin, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+general+assay+for+monitoring+endogenous+gene+modification.">A rapid and general assay for monitoring endogenous gene modification.</a> Methods Mol. Biol. 649, 247-256 (2010).</li><li>Kim, H. J., Lee, H. J., Kim, H., Cho, S. W., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+genome+editing+in+human+cells+with+zinc+finger+nucleases+constructed+via+modular+assembly.">Targeted genome editing in human cells with zinc finger nucleases constructed via modular assembly.</a> Genome Res. 19, 1279-1288 (2009).</li><li>Ramlee, M. K., Yan, T., Cheung, A. M., Chuah, C. T., Li, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+genotyping+of+CRISPR/Cas9-mediated+mutants+using+fluorescent+PCR-capillary+gel+electrophoresis.">High-throughput genotyping of CRISPR/Cas9-mediated mutants using fluorescent PCR-capillary gel electrophoresis.</a> Sci. Rep. 5, 15587 (2015).</li><li>Liu, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+Responses+of+Stem+Cells+to+Telomere+Uncapping-A+Potential+Strategy+to+Improve+the+Safety+of+Cell+Therapy.">Distinct Responses of Stem Cells to Telomere Uncapping-A Potential Strategy to Improve the Safety of Cell Therapy.</a> Stem cells. 34, 2471-2484 (2016).</li><li>Doench, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+design+of+highly+active+sgRNAs+for+CRISPR-Cas9-mediated+gene+inactivation.">Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation.</a> Nat. Biotechnol. 32, 1262-1267 (2014).</li><li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+essential+genes+in+the+human+genome.">Identification and characterization of essential genes in the human genome.</a> Science. 350, 1096-1101 (2015).</li><li>Sanjana, N. E., Shalem, O., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+vectors+and+genome-wide+libraries+for+CRISPR+screening.">Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening.</a> Nat. Methods. 11, 783-784 (2014).</li><li>Urnov, F. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+endogenous+human+gene+correction+using+designed+zinc-finger+nucleases.">Highly efficient endogenous human gene correction using designed zinc-finger nucleases.</a> Nature. 435, 646-651 (2005).</li><li>Kim, H., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+genome+engineering+with+programmable+nucleases.">A guide to genome engineering with programmable nucleases.</a> Nat. Rev. Genet. 15, 321-334 (2014).</li><li>Dahlem, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+methods+for+generating+and+detecting+locus-specific+mutations+induced+with+TALENs+in+the+zebrafish+genome.">Simple methods for generating and detecting locus-specific mutations induced with TALENs in the zebrafish genome.</a> PLoS Genet. 8, e1002861 (2012).</li><li>Thomas, H. R., Percival, S. M., Yoder, B. K., Parant, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+genome+editing+and+phenotyping+facilitated+by+high+resolution+melting+curve+analysis.">High-throughput genome editing and phenotyping facilitated by high resolution melting curve analysis.</a> PLoS One. 9, 114632 (2014).</li><li>Kim, J. M., Kim, D., Kim, S., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotyping+with+CRISPR-Cas-derived+RNA-guided+endonucleases.">Genotyping with CRISPR-Cas-derived RNA-guided endonucleases.</a> Nat. Commun. 5, 3157 (2014).</li></ol>

أصبح يطرق من جين معين في خط خلية نموذج الاختيار روتين لتوضيح الدور الذي الجين يلعب في هذا السياق الخلوي معين. في الواقع، العديد من الشاشات على نطاق الجينوم متوفرة حاليا التي تستخدم كريسبر / نظام Cas9 لاستهداف الجينات البشرية تقريبا جميع المعروفة في الجينوم 14</...

وقد سمحت النهج الوراثية العكسية العلماء لتوضيح آثار التعديلات المحددة في الجينوم على الخلية أو الكائن الحي كله. على سبيل المثال، والتعبير عن جين معين يمكن أن تكون مخففة من الجينات ضربة قاضية 1 و 2 (تخفيض جزئي) أو تعطيل مورثة 3 و 4 (الاجتثاث الكامل) من أجل تحديد تأثير ذلك على وظيفة الخلية أو على تطور الكائن الحي. أصبحت التجارب الجينات خروج المغلوب من الأسهل منذ بدء nucleases برمجة تسلسل معين، مثل nucleases الزنك الاصبع (ZFNs) والنسخ مثل المنشط nucleases المستجيب (TALENs). ومع ذلك، فإن توصيف حديث نسبيا من تجميع تتخللها بانتظام تكرار المتناوب قصيرة (كريسبر) / جعلت نظام Cas9 من السهل للغاية بالنسبة لأي مختبر في جميع أنحاء العالم لأداء جنرالالبريد التجارب خروج المغلوب. في جوهرها، ويتكون النظام / Cas9 كريسبر من عنصرين واحد الأساسية RNA واحد دليل (sgRNA)، الذي يعترف ويربط طريق التكامل قاعدة لتسلسل معين في الجينوم، ونوكلياز داخلية تسمى Cas9. في أعقاب إجراءات محددة ملزمة ومجمع sgRNA-Cas9 على الحمض النووي الجيني هو الانقسام المزدوج حبلا من الحمض النووي. وهذا، بدوره، يؤدي آلية استجابة الحمض النووي من التلف في الخلايا، والتي يتم إصلاح في وقت لاحق عن طريق (HR) مسارات (NHEJ)، الانضمام نهاية أو إعادة التركيب مثلي غير المتجانسة. منذ آلية NHEJ إصلاح (ولكن ليس آلية HR) غالبا ما يؤدي إلى إدخال عشوائي أو الحذف من النيوكليوتيدات في موقع إصلاح، مما أدى إلى إدراج / حذف (INDEL) الطفرات، فإنه قد يتسبب في إطار القراءة من اكسون للتحول. وهذا قد يؤدي ثم في دور الستة عشر من الجينات بسبب الإنهاء المبكر الترجمة وبوساطة هراء تسوس 5، 6،7. وعلى الرغم من الراحة التي يوفرها تطبيق نظام / Cas9 كريسبر في ضرب الجينات، والتنميط الجيني لاستنساخ الخلايا المستهدفة لا يزال يمثل عنق الزجاجة، وخاصة في تحديد 8 و 9 والإنتاجية العالية. التقنيات الموجودة إما يعانون القيود المتأصلة الكبرى أو هي مكلفة ماليا. على سبيل المثال، مساح أو T7E1 الفحص، وهو فحص الأنزيمية التي يكشف عدم التطابق في DNA دوبلكسات 10، غير قادر على التمييز بين الحيوانات المستنسخة wildtype والمسوخ متماثل (استنساخ الذي الأليلات وتحور مماثل)، لأن هذه الحيوانات المستنسخة لها الأليلات متطابقة وبالتالي لا تقدم عدم التطابق في تسلسل الحمض النووي (11). وبالإضافة إلى ذلك، فإن استخدام سانجر تسلسل، والتي تعتبر المعيار الذهبي في التنميط الجيني استنساخ متحولة، في إعداد الإنتاجية العالية غير مرغوب فيه بسبب التكلفة العالية. هنا، نقدم ديتبروتوكول ailed تقنية هلام الكهربائي-PCR الشعرية الفلورسنت، والتي يمكن الالتفاف على القيود المفروضة على تقنيات التنميط الجيني الأخرى القائمة وغير مفيدة بشكل خاص في أداء شاشة عالية الإنتاجية من الحيوانات المستنسخة خروج المغلوب بوساطة نوكلياز. وهذه طريقة بسيطة من الناحية الفنية لأداء ويوفر الوقت والتكلفة.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1548">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:401px;">HEPG2 cells</td>
			<td style="width:196px;">ATCC</td>
			<td style="width:135px;">HB-8065</td>
			<td style="width:816px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HyClone Dulbecco&#39;s Modified Eagles Medium (DMEM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SH30022.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HyClone Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SV30160.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pSpCas9(BB)-2A-GFP plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>PX458</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Lipofectamine 2000</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11668027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15400054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HyClone Water, Molecular Biology Grade</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>SH30538.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CRISPR sgRNA insert oligonucleotide (sense)</td>
			<td>AITbiotech</td>
			<td>None</td>
			<td>Sequence: 5&#39;-CACCGCTAACCTTTCAGCCTGCCTA-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CRISPR sgRNA insert oligonucleotide (anti-sense)</td>
			<td>AITbiotech</td>
			<td>None</td>
			<td>Sequence: 5&#39;-AAACTAGGCAGGCTGAAAGGTTAGC-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Unlabeled PCR amplification forward primer</td>
			<td>AITbiotech</td>
			<td>None</td>
			<td>Sequence: 5&#39;-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3&#39;; this primer is also used to sequence PCR amplified alleles</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">6-FAM-labeled fluorescent PCR forward primer</td>
			<td>AITbiotech</td>
			<td>None</td>
			<td>Sequence: 5&#39;-6-FAM-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEX-labeled fluorescent PCR forward primer</td>
			<td>AITbiotech</td>
			<td>None</td>
			<td>Sequence: 5&#39;-HEX-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Unlabeled PCR reverse primer</td>
			<td>AITbiotech</td>
			<td>None</td>
			<td>Sequence: 5&#39;-CCTCTTCCAAGTCTGCTTATGT-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Taq PCR Core Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>201223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hi-Di Formamide</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4311320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GeneScan 500 LIZ Dye Size Standard</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4322682</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4306737</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">3500xL Genetic Analyzer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4405633</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">3500 Series 2 program</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4476988</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gene Mapper 5 program</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4475073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gentra Puregene Cell Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>1045696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A9282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NAP1L1 Antibody (N-term)</td>
			<td>Abgent</td>
			<td>AP1920b</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nuclear Matrix Protein p84 antibody [5E10]</td>
			<td>GeneTex</td>
			<td>GTX70220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>111-035-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Peroxidase AffiniPure Sheep Anti-Mouse IgG</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>515-035-003</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using a fluorescent pcr-capillary gel electrophoresis technique to genotype crispr/cas9-mediated knockout mutants in a high-throughput format

وقد سهلت تطوير أدوات الجينوم التحرير للبرمجة باستخدام علم الوراثة العكسية لفهم الأدوار تلعب تسلسل الجينوم محددة في عمل الخلايا والكائنات كلها. تم عرض هذه القضية بمساعدة بجسامة الأخذ في الآونة الأخيرة من كريسبر / نظام واحد Cas9 أداة متعددة الاستعمالات التي تسمح للباحثين لمعالجة الجينوم وTranscriptome على ل، من بين أمور أخرى، ضرب بها، تدق إلى أسفل، أو تدق في الجينات في المستهدفة الطريقة. لغرض ضرب الجينات، كريسبر / Cas9 بوساطة فواصل المزدوج حبلا توظيف غير مثلي، الانضمام نهاية DNA إصلاح مسار لتقديم الإدراج يسبب انزياح الإطار أو الحذف من النيوكليوتيدات في موقع الشوط الاول. ومع ذلك، RNA دليل الفردية قد يسبب آثار غير مرغوب فيها بعيدا عن الهدف، وحكم هذه خارج، واستخدام الرنا دليل متعددة ضروري. هذا التعدد من الأهداف يعني أيضا أن هناك حاجة إلى فحص كبيرة الحجم من الحيوانات المستنسخة، وهذا بدوره يطرح استخدام وسيلة EFficient تقنية عالية الإنتاجية إلى التركيب الوراثي استنساخ خروج المغلوب. تقنيات التنميط الجيني الحالية إما تعاني من القيود المتأصلة أو تكبد تكلفة عالية، وبالتالي جعلها غير صالحة للأغراض الإنتاجية العالية. هنا، ونحن بالتفصيل بروتوكول لاستخدام الفلورسنت PCR، والذي يستخدم الحمض النووي الجيني من الخلايا المحللة الخام كقالب، ومن ثم حل شظايا PCR عن طريق الكهربائي للهلام الشعرية. هذه التقنية دقيقة بما فيه الكفاية للتمييز فارق واحد قاعدة الزوج بين شظايا وكافية في إشارة إلى وجود أو عدم وجود انزياح الإطار في تسلسل ترميز الجين المستهدف بالتالي. هذه المعرفة الدقيقة يستبعد بالفعل الحاجة إلى خطوة تأكيدية التسلسل ويسمح للمستخدمين لتوفير الوقت والتكلفة في هذه العملية. وعلاوة على ذلك، وقد أثبتت هذه التقنية لتكون مرنة في التنميط الجيني خلايا الثدييات مختلفة من أصول الأنسجة المختلفة التي تستهدفها الرنا دليل ضد العديد من الجينات، كما هو موضح هنا وفي أماكن أخرى.

ومن المتوقع تقنية هلام الكهربائي-PCR الشعرية الفلورسنت وصفها هنا إلى أن تنطبق على أي منطقة يمكن استهدافها في الجينوم في الواقع أي خط الخلية التي هي قابلة للتسليم DNA الأجانب. لقد أثبتنا سابقا تطبيقه من خلال استهداف ثلاثة جينات في خط خلية سرطان القولون ...

Watch this Scientific Journal Video about Using a Fluorescent PCR-capillary Gel Electrophoresis Technique to Genotype CRISPR/Cas9-mediated Knockout Mutants in a High-throughput Format at JoVE.com

Using a Fluorescent PCR-capillary Gel Electrophoresis Technique to Genotype CRISPR/Cas9-mediated Knockout Mutants in a High-throughput Format

تقنية التنميط الجيني هو موضح هنا، والتي الأزواج الفلورسنت تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) لالشعرية الكهربائي للهلام، ويسمح لالتنميط الجيني الإنتاجية العالية من الحيوانات المستنسخة خروج المغلوب بوساطة نوكلياز. انها تلتف القيود من خلال تقنيات التنميط الجيني أخرى واجهت وهو أكثر فعالية من حيث التكلفة من الطرق التسلسل.

باستخدام تقنية PCR-نيون الشعرية جل الكهربائي إلى التركيب الوراثي كريسبر / Cas9 بوساطة خروج المغلوب المسوخ في تنسيق عالية الإنتاجية

The development of programmable genome-editing tools has facilitated the use of reverse genetics to understand the roles specific genomic sequences play ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Perturbations of Circulating miRNAs in Irritable Bowel Syndrome Detected Using a Multiplexed High-throughput Gene Expression Platform

اضطرابات في الدورة الدموية miRNAs في متلازمة القولون العصبي التي تم اكتشافها باستخدام تعدد الإنتاجية العالية منصة التعبير الجيني

The gene expression platform assay allows for robust and highly reproducible quantification of the expression of up to 800 transcripts (mRNA or miRNAs) in ...

High-Throughput Robotically Assisted Isolation of Temperature-sensitive Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii

High-Throughput Robotically Assisted Isolation of Temperature-sensitive Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii

عالية الإنتاجية آليا عزل بمساعدة من درجة الحرارة التي تراعي القاتلة المسوخ في<em&gt; كلاميدوموناس reinhardtii</em

Systematic identification and characterization of genetic perturbations have proven useful to decipher gene function and cellular pathways. However, the ...

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

جيل يعتمد على الاختيار ومستقل من كريسبر / كاس 9 بوساطة جين نوكوتس في خلايا الثدييات

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

جيل من الكروماتين الأصلية إيمونوبريسيبيتيشن تسلسل المكتبات لتحليل كثافة نوكليوسومي

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

G2-seq: A High Throughput Sequencing-based Technique for Identifying Late Replicating Regions of the Genome

G2-seq: عالية إنتاجية على أساس تسلسل تقنية لتحديد تكرار متأخر مناطق الجينوم

Numerous techniques have been developed to follow the progress of DNA replication through the S phase of the cell cycle. Most of these techniques have ...

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

عزل الحمض النووي قوية وبناء مكتبة التسلسل الفائق للعينات دار النباتات

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

كريسبر/Cas9-بوساطة التكامل المستهدفة في فيفو استخدام استراتيجية تستند إلى الانضمام إلى التماثل بوساطة نهاية

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells

بروتوكول لإنتاج ناقلات لينتيفيرال إينتيجراسي التي تفتقر لخروج المغلوب كريسبر/Cas9-بوساطة الجينات في تقسيم الخلايا

Lentiviral vectors are an ideal choice for delivering gene-editing components to cells due to their capacity for stably transducing a broad range of cells ...

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

تحديد تركيبات المخدرات التآزر بواسطة الأسلوب2 تداخل الفائق

Although antimicrobial drugs have dramatically increased the lifespan and quality of life in the 20th century, antimicrobial resistance threatens our ...

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

السريع وخط أنابيب سهلة "توليد طفرات نقطة الجينوم" في C. ايليجانس باستخدام كريسبر/Cas9 "ريبونوكليوبروتينس"

The clustered regularly interspersed palindromic repeats (CRISPR)-CRISPR-associated protein 9 (Cas9) prokaryotic adaptive immune defense system has been ...