Name: using a fluorescent pcr-capillary gel electrophoresis technique to genotype crispr/cas9-mediated knockout mutants in a high-throughput format
Uploaded: 2017-04-08T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using a Fluorescent PCR-capillary Gel Electrophoresis Technique to Genotype CRISPR/Cas9-mediated Knockout Mutants in a High-throughput Format at JoVE.com

De auteurs danken mevrouw Tan Shi Min, mevrouw Helen Ong, en Dr. Zhao Yi voor het helpen met de capillaire gelelektroforese experimenten. Dit werk werd ondersteund door NMRC / IRG verlenen NMRC / 1314/2011 en MOE ACRF Tier 2 Fund subsidie ​​MOE2011-T2-1-051.

1. Het verkrijgen van CRISPR / Cas9-gerichte Single-cell Clones <ol><li> Zaad HepG2-cellen op een plaat met 6 putjes bij 500.000 cellen per putje in 2 ml antibiotica-vrij Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS). Incubeer gedurende 24 uur bij 37 ° C en 5% CO2. </li><li> Transfecteren cellen met plasmide co-expressie Cas9 en specifieke sgRNA tegen het gen van belang onder toepassing van een geschikt transfectiereagens volgens de instructies van de fabrikant. <b...

<ol>
	<li>Chang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/cas9,+a+novel+genomic+tool+to+knock+down+microRNA+in+vitro+and+in+vivo.">CRISPR/cas9, a novel genomic tool to knock down microRNA in vitro and in vivo.</a> Sci. Rep. 6, 22312 (2016).</li><li>O'Connell, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmable+RNA+recognition+and+cleavage+by+CRISPR/Cas9.">Programmable RNA recognition and cleavage by CRISPR/Cas9.</a> Nature. 516, 263-266 (2014).</li><li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+nicking+by+RNA-guided+CRISPR+Cas9+for+enhanced+genome+editing+specificity.">Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity.</a> Cell. 154, 1380-1389 (2013).</li><li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nat. Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li><li>Perez, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+HIV-1+resistance+in+CD4++T+cells+by+genome+editing+using+zinc-finger+nucleases.">Establishment of HIV-1 resistance in CD4+ T cells by genome editing using zinc-finger nucleases.</a> Nat. Biotechnol. 26, 808-816 (2008).</li><li>Santiago, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+knockout+in+mammalian+cells+by+using+engineered+zinc-finger+nucleases.">Targeted gene knockout in mammalian cells by using engineered zinc-finger nucleases.</a> P. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 5809-5814 (2008).</li><li>Sung, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knockout+mice+created+by+TALEN-mediated+gene+targeting.">Knockout mice created by TALEN-mediated gene targeting.</a> Nat. Biotechnol. 31, 23-24 (2013).</li><li>Shalem, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+CRISPR-Cas9+knockout+screening+in+human+cells.">Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells.</a> Science. 343, 84-87 (2014).</li><li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+of+a+CRISPR/Cas9+library+for+functional+genomics+in+human+cells.">High-throughput screening of a CRISPR/Cas9 library for functional genomics in human cells.</a> Nature. 509, 487-491 (2014).</li><li>Guschin, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+general+assay+for+monitoring+endogenous+gene+modification.">A rapid and general assay for monitoring endogenous gene modification.</a> Methods Mol. Biol. 649, 247-256 (2010).</li><li>Kim, H. J., Lee, H. J., Kim, H., Cho, S. W., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+genome+editing+in+human+cells+with+zinc+finger+nucleases+constructed+via+modular+assembly.">Targeted genome editing in human cells with zinc finger nucleases constructed via modular assembly.</a> Genome Res. 19, 1279-1288 (2009).</li><li>Ramlee, M. K., Yan, T., Cheung, A. M., Chuah, C. T., Li, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+genotyping+of+CRISPR/Cas9-mediated+mutants+using+fluorescent+PCR-capillary+gel+electrophoresis.">High-throughput genotyping of CRISPR/Cas9-mediated mutants using fluorescent PCR-capillary gel electrophoresis.</a> Sci. Rep. 5, 15587 (2015).</li><li>Liu, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+Responses+of+Stem+Cells+to+Telomere+Uncapping-A+Potential+Strategy+to+Improve+the+Safety+of+Cell+Therapy.">Distinct Responses of Stem Cells to Telomere Uncapping-A Potential Strategy to Improve the Safety of Cell Therapy.</a> Stem cells. 34, 2471-2484 (2016).</li><li>Doench, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+design+of+highly+active+sgRNAs+for+CRISPR-Cas9-mediated+gene+inactivation.">Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation.</a> Nat. Biotechnol. 32, 1262-1267 (2014).</li><li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+essential+genes+in+the+human+genome.">Identification and characterization of essential genes in the human genome.</a> Science. 350, 1096-1101 (2015).</li><li>Sanjana, N. E., Shalem, O., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+vectors+and+genome-wide+libraries+for+CRISPR+screening.">Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening.</a> Nat. Methods. 11, 783-784 (2014).</li><li>Urnov, F. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+endogenous+human+gene+correction+using+designed+zinc-finger+nucleases.">Highly efficient endogenous human gene correction using designed zinc-finger nucleases.</a> Nature. 435, 646-651 (2005).</li><li>Kim, H., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+genome+engineering+with+programmable+nucleases.">A guide to genome engineering with programmable nucleases.</a> Nat. Rev. Genet. 15, 321-334 (2014).</li><li>Dahlem, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+methods+for+generating+and+detecting+locus-specific+mutations+induced+with+TALENs+in+the+zebrafish+genome.">Simple methods for generating and detecting locus-specific mutations induced with TALENs in the zebrafish genome.</a> PLoS Genet. 8, e1002861 (2012).</li><li>Thomas, H. R., Percival, S. M., Yoder, B. K., Parant, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+genome+editing+and+phenotyping+facilitated+by+high+resolution+melting+curve+analysis.">High-throughput genome editing and phenotyping facilitated by high resolution melting curve analysis.</a> PLoS One. 9, 114632 (2014).</li><li>Kim, J. M., Kim, D., Kim, S., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotyping+with+CRISPR-Cas-derived+RNA-guided+endonucleases.">Genotyping with CRISPR-Cas-derived RNA-guided endonucleases.</a> Nat. Commun. 5, 3157 (2014).</li></ol>

Het uitspelen van een specifiek gen in een model cellijn keuze heeft routine voor het ophelderen van de rol die het gen speelt in die specifieke cellulaire context te worden. In feite, verschillende genoom-brede schermen zijn beschikbaar die de CRISPR / Cas9 systeem vrijwel alle bekende menselijke genen gericht in het genoom 14, 15, 16. Met deze grote schermen (of zelfs kleine targeting van individuele genen van belang), is het...

Reverse genetische benaderingen zijn toegestaan ​​wetenschappers om de effecten van specifieke veranderingen ontrafelen in het genoom van de cel of het hele organisme. Bijvoorbeeld kan de expressie van een bepaald gen worden verzwakt door gen knockdown 1, 2 (partiële reductie) of gen knockout 3, 4 (complete ablatie) om het effect dat dit heeft op de functie van de cel of het bepalen ontwikkeling van het organisme. Genknockout experimenten gemakkelijker omdat de introductie van sequentiespecifieke programmeerbare nucleasen, zoals zinkvinger nucleasen (ZFNs) en transcriptie activator-achtige effector nucleasen (talens) worden. Echter, de relatief recente karakterisering van de geclusterde regelmatig afgewisseld korte palindroom repeat (CRISPR) / Cas9 systeem is het zeer eenvoudig voor elk laboratorium de hele wereld om gen uit te voeren gemaakte knockout experimenten. In wezen is de CRISPR / Cas9 bestaat uit twee essentiële componenten-één hulplijn RNA (sgRNA), die herkent en bindt via basis complementariteit met een specifieke sequentie in het genoom, en een endonuclease genoemd Cas9. Na de specifieke binding en werking van het sgRNA-Cas9 complex op genomisch DNA is dubbelstrengs splitsing van DNA. Dit op zijn beurt activeert de DNA-schade reactiemechanisme in de cel, die vervolgens via de niet-homologe-end-joining (NHEJ) of homologe recombinatie (HR) banen wordt hersteld. Aangezien de NHEJ herstelmechanisme (maar niet de HR mechanisme) resulteert vaak in de willekeurige insertie of deletie van nucleotiden op de plaats van reparatie, waardoor insertie / deletie (indel) mutaties, kan dit leiden tot het leesraam van een exon te verschuiven. Dit kan vervolgens leiden tot de knock-out van het gen door vroegtijdige terminatie van translatie en-nonsense gemedieerde verval 5, 6,7. Ondanks het gemak verschaft door de invoering van de CRISPR / Cas9 systeem kloppen van een gen, genotypering klonen van doelcellen loopt stuk, vooral in een high-throughput instelling 8, 9. Bestaande technieken ofwel enige hinder inherente beperkingen of financieel kostbaar. Bijvoorbeeld, de inspecteur of T7E1 assay, welke een enzymatische test die mismatches detecteert DNA duplexen 10, niet in staat onderscheid te maken tussen wildtype klonen en homozygote mutanten (klonen waarvan de allelen identiek gemuteerd) aangezien deze klonen identieke allelen en derhalve geen mismatches aanwezig in de DNA-sequentie 11. Bovendien, het gebruik van Sanger sequentiebepaling, die wordt beschouwd als de gouden standaard voor het genotyperen van mutante klonen, in een hoge-doorvoer opstelling is ongewenst vanwege de hoge kosten. Hier presenteren we een detailed protocol van de fluorescente PCR-capillaire gelelektroforese techniek, die de beperkingen van de andere bestaande genotyperingstechnieken kan omzeilen en is vooral nuttig bij het uitvoeren van een high-throughput screen van nuclease-gemedieerde knockout klonen. Deze methode is technisch eenvoudig uit te voeren en bespaart tijd en kosten.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1548">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:401px;">HEPG2 cells</td>
			<td style="width:196px;">ATCC</td>
			<td style="width:135px;">HB-8065</td>
			<td style="width:816px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HyClone Dulbecco&#39;s Modified Eagles Medium (DMEM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SH30022.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HyClone Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SV30160.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pSpCas9(BB)-2A-GFP plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>PX458</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Lipofectamine 2000</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11668027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15400054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HyClone Water, Molecular Biology Grade</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>SH30538.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CRISPR sgRNA insert oligonucleotide (sense)</td>
			<td>AITbiotech</td>
			<td>None</td>
			<td>Sequence: 5&#39;-CACCGCTAACCTTTCAGCCTGCCTA-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CRISPR sgRNA insert oligonucleotide (anti-sense)</td>
			<td>AITbiotech</td>
			<td>None</td>
			<td>Sequence: 5&#39;-AAACTAGGCAGGCTGAAAGGTTAGC-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Unlabeled PCR amplification forward primer</td>
			<td>AITbiotech</td>
			<td>None</td>
			<td>Sequence: 5&#39;-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3&#39;; this primer is also used to sequence PCR amplified alleles</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">6-FAM-labeled fluorescent PCR forward primer</td>
			<td>AITbiotech</td>
			<td>None</td>
			<td>Sequence: 5&#39;-6-FAM-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEX-labeled fluorescent PCR forward primer</td>
			<td>AITbiotech</td>
			<td>None</td>
			<td>Sequence: 5&#39;-HEX-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Unlabeled PCR reverse primer</td>
			<td>AITbiotech</td>
			<td>None</td>
			<td>Sequence: 5&#39;-CCTCTTCCAAGTCTGCTTATGT-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Taq PCR Core Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>201223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hi-Di Formamide</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4311320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GeneScan 500 LIZ Dye Size Standard</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4322682</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4306737</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">3500xL Genetic Analyzer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4405633</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">3500 Series 2 program</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4476988</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gene Mapper 5 program</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4475073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gentra Puregene Cell Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>1045696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A9282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NAP1L1 Antibody (N-term)</td>
			<td>Abgent</td>
			<td>AP1920b</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nuclear Matrix Protein p84 antibody [5E10]</td>
			<td>GeneTex</td>
			<td>GTX70220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>111-035-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Peroxidase AffiniPure Sheep Anti-Mouse IgG</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>515-035-003</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using a fluorescent pcr-capillary gel electrophoresis technique to genotype crispr/cas9-mediated knockout mutants in a high-throughput format

De ontwikkeling van programmeerbare genoom-editing tools is het gebruik van reverse genetics om de rol van specifieke genoomsequenties spelen in het functioneren van cellen en hele organismen te begrijpen vergemakkelijkt. Deze oorzaak is enorm geholpen door de recente invoering van de CRISPR / Cas9 systeem een ​​veelzijdige tool waarmee onderzoekers het genoom en transcriptoom manipuleren om, onder andere, knock-out, knock down, of knock in genen in een gerichte manier. Ten behoeve van kloppen van een gen, CRISPR / Cas9 gemedieerde dubbelstrengsbreuken werven de niet-homologe-DNA-end verbinden herstelweg de leesraamverschuivingsinducerende veroorzaken insertie of deletie van nucleotiden te introduceren in de rust plaats. Echter kan een individuele geleider RNA ongewenste off-target veroorzaken, en deze uit te sluiten, het gebruik van meervoudige geleider RNAs nodig. Deze veelheid aan doelen betekent ook dat een hoog volume screening van klonen vereist, wat op zijn beurt roept de toepassing van een efdoende high-throughput techniek om de knock-out klonen genotype. Huidige genotyperingstechnieken ofwel lijden aan inherente beperkingen of maakt hoge kosten, vandaar waardoor ze ongeschikt zijn voor high-throughput doeleinden. Hier hebben we gedetailleerd protocol voor het gebruik van fluorescente PCR, die genomisch DNA gebruikt uit ruw cellysaat als sjabloon en oplossen van de PCR-fragmenten via capillaire gelelektroforese. Deze techniek is nauwkeurig genoeg om een ​​basenpaar verschil tussen fragmenten differentiëren en derhalve toereikend is dat de aanwezigheid of afwezigheid van een frameshift in de coderende sequentie van het doelgen. Deze nauwkeurige kennis effectief verzet zich tegen de noodzaak van een bevestigende sequencing stap en stelt gebruikers in staat om tijd en kosten te besparen in het proces. Bovendien is deze techniek bewezen veelzijdig genotypering diverse zoogdiercellen uit verschillende weefsels oorsprong doelwit van gids-RNA&#39;s tegen talrijke genen, zoals hier en elders getoond.

De fluorescente PCR-capillaire gelelektroforese techniek beschreven wordt verwacht toepasbaar op elk getarget gebied in het genoom worden in vrijwel elke cellijn die vatbaar is voor vreemd DNA afgifte. We hebben eerder de toepassing ervan aangetoond door zich te richten drie genen in een colorectale kanker cellijn 12. Hier tonen we de werkzaamheid in genotypering van een hepatocellulair carcinoom cellijn, HEPG2, gericht, met een CRISPR / Cas9 te bouwen tegen de Pr...

Watch this Scientific Journal Video about Using a Fluorescent PCR-capillary Gel Electrophoresis Technique to Genotype CRISPR/Cas9-mediated Knockout Mutants in a High-throughput Format at JoVE.com

Using a Fluorescent PCR-capillary Gel Electrophoresis Technique to Genotype CRISPR/Cas9-mediated Knockout Mutants in a High-throughput Format

Genotypering techniek beschreven voor koppeling fluorescent polymerasekettingreactie (PCR) met capillaire gelelektroforese, maakt genotypering van nuclease-gemedieerde knockout klonen. Het omzeilt beperkingen geconfronteerd met andere genotyperingstechnieken en kosteneffectiever is dan sequencing methoden.

Gebruikmaking van een fluorescentie PCR-capillaire gelelektroforese techniek voor CRISPR Genotype / Cas9-gemedieerde knockout mutanten in een High-throughput Format

The development of programmable genome-editing tools has facilitated the use of reverse genetics to understand the roles specific genomic sequences play ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Perturbations of Circulating miRNAs in Irritable Bowel Syndrome Detected Using a Multiplexed High-throughput Gene Expression Platform

Verstoringen van circulerende miRNAs in het prikkelbare darm syndroom gedetecteerd met een multiplexverzending High-throughput genexpressie Platform

The gene expression platform assay allows for robust and highly reproducible quantification of the expression of up to 800 transcripts (mRNA or miRNAs) in ...

High-Throughput Robotically Assisted Isolation of Temperature-sensitive Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii

High-Throughput Robotically Assisted Isolation of Temperature-sensitive Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii

High-throughput Robotisch Assisted Isolatie van temperatuurgevoelige Lethal Mutants in<em&gt; Chlamydomonas reinhardtii</em

Systematic identification and characterization of genetic perturbations have proven useful to decipher gene function and cellular pathways. However, the ...

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

Selectieafhankelijke en onafhankelijke generatie van CRISPR / Cas9-gemedieerde Gene Knockouts in zoogdiercellen

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

Generatie van inheemse chromatine Immunoprecipitation Sequencing bibliotheken nucleosoom dichtheid p.a.

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

G2-seq: A High Throughput Sequencing-based Technique for Identifying Late Replicating Regions of the Genome

G2-seq: Een High Throughput Sequencing gebaseerde techniek voor het identificeren van laat repliceren regio's van het genoom

Numerous techniques have been developed to follow the progress of DNA replication through the S phase of the cell cycle. Most of these techniques have ...

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

Robuuste DNA isolatie en High-throughput Sequencing bibliotheek bouw voor Herbarium Specimens

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-gemedieerde gerichte integratie In Vivo met behulp van een homologie-gemedieerde einde deelname aan gebaseerde strategie

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells

Een Protocol voor de productie van Integrase-deficiënte lentivirale vectoren voor CRISPR/Cas9-gemedieerde Gene knock-out in cellen verdelen

Lentiviral vectors are an ideal choice for delivering gene-editing components to cells due to their capacity for stably transducing a broad range of cells ...

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

High-throughput identificatie van synergetische Drug combinaties door de overlapping2 methode

Although antimicrobial drugs have dramatically increased the lifespan and quality of life in the 20th century, antimicrobial resistance threatens our ...

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

Een snelle en Facile pijpleiding voor het genereren van Genomic punt mutanten in C. elegans met behulp van CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

The clustered regularly interspersed palindromic repeats (CRISPR)-CRISPR-associated protein 9 (Cas9) prokaryotic adaptive immune defense system has been ...