Name: using a fluorescent pcr-capillary gel electrophoresis technique to genotype crispr/cas9-mediated knockout mutants in a high-throughput format
Uploaded: 2017-04-08T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using a Fluorescent PCR-capillary Gel Electrophoresis Technique to Genotype CRISPR/Cas9-mediated Knockout Mutants in a High-throughput Format at JoVE.com

המחברים מבקשים להודות לגב &#39;טאן שי מינימום, הגב&#39; הלן אונג, וד&quot;ר זאו יי שעזר עם ניסויי ג&#39;ל אלקטרופורזה נימים. עבודה זו נתמכה על ידי NMRC / IRG להעניק NMRC / 1314/2011 ו מענק קרן Tier 2 משרד החינוך AcRF MOE2011-T2-1-051.

1. קבלת קריספר / Cas9 במיקוד המשובטים מתא בודד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי זרע HEPG2 על צלחת 6-היטב על 500,000 תאים לכל היטב 2 מ&quot;ל של מדיום הנשר ללא אנטיביוטיקה Modified של Dulbecco (DMEM) בתוספת 10% בסרום שור העובר (FBS). דגירה של 24 שעות ב 37 ° C ו 5% CO 2. </li><li style=";tex...

<ol>
	<li>Chang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/cas9,+a+novel+genomic+tool+to+knock+down+microRNA+in+vitro+and+in+vivo.">CRISPR/cas9, a novel genomic tool to knock down microRNA in vitro and in vivo.</a> Sci. Rep. 6, 22312 (2016).</li><li>O'Connell, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmable+RNA+recognition+and+cleavage+by+CRISPR/Cas9.">Programmable RNA recognition and cleavage by CRISPR/Cas9.</a> Nature. 516, 263-266 (2014).</li><li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+nicking+by+RNA-guided+CRISPR+Cas9+for+enhanced+genome+editing+specificity.">Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity.</a> Cell. 154, 1380-1389 (2013).</li><li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nat. Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li><li>Perez, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+HIV-1+resistance+in+CD4++T+cells+by+genome+editing+using+zinc-finger+nucleases.">Establishment of HIV-1 resistance in CD4+ T cells by genome editing using zinc-finger nucleases.</a> Nat. Biotechnol. 26, 808-816 (2008).</li><li>Santiago, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+knockout+in+mammalian+cells+by+using+engineered+zinc-finger+nucleases.">Targeted gene knockout in mammalian cells by using engineered zinc-finger nucleases.</a> P. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 5809-5814 (2008).</li><li>Sung, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knockout+mice+created+by+TALEN-mediated+gene+targeting.">Knockout mice created by TALEN-mediated gene targeting.</a> Nat. Biotechnol. 31, 23-24 (2013).</li><li>Shalem, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+CRISPR-Cas9+knockout+screening+in+human+cells.">Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells.</a> Science. 343, 84-87 (2014).</li><li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+of+a+CRISPR/Cas9+library+for+functional+genomics+in+human+cells.">High-throughput screening of a CRISPR/Cas9 library for functional genomics in human cells.</a> Nature. 509, 487-491 (2014).</li><li>Guschin, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+general+assay+for+monitoring+endogenous+gene+modification.">A rapid and general assay for monitoring endogenous gene modification.</a> Methods Mol. Biol. 649, 247-256 (2010).</li><li>Kim, H. J., Lee, H. J., Kim, H., Cho, S. W., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+genome+editing+in+human+cells+with+zinc+finger+nucleases+constructed+via+modular+assembly.">Targeted genome editing in human cells with zinc finger nucleases constructed via modular assembly.</a> Genome Res. 19, 1279-1288 (2009).</li><li>Ramlee, M. K., Yan, T., Cheung, A. M., Chuah, C. T., Li, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+genotyping+of+CRISPR/Cas9-mediated+mutants+using+fluorescent+PCR-capillary+gel+electrophoresis.">High-throughput genotyping of CRISPR/Cas9-mediated mutants using fluorescent PCR-capillary gel electrophoresis.</a> Sci. Rep. 5, 15587 (2015).</li><li>Liu, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+Responses+of+Stem+Cells+to+Telomere+Uncapping-A+Potential+Strategy+to+Improve+the+Safety+of+Cell+Therapy.">Distinct Responses of Stem Cells to Telomere Uncapping-A Potential Strategy to Improve the Safety of Cell Therapy.</a> Stem cells. 34, 2471-2484 (2016).</li><li>Doench, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+design+of+highly+active+sgRNAs+for+CRISPR-Cas9-mediated+gene+inactivation.">Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation.</a> Nat. Biotechnol. 32, 1262-1267 (2014).</li><li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+essential+genes+in+the+human+genome.">Identification and characterization of essential genes in the human genome.</a> Science. 350, 1096-1101 (2015).</li><li>Sanjana, N. E., Shalem, O., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+vectors+and+genome-wide+libraries+for+CRISPR+screening.">Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening.</a> Nat. Methods. 11, 783-784 (2014).</li><li>Urnov, F. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+endogenous+human+gene+correction+using+designed+zinc-finger+nucleases.">Highly efficient endogenous human gene correction using designed zinc-finger nucleases.</a> Nature. 435, 646-651 (2005).</li><li>Kim, H., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+genome+engineering+with+programmable+nucleases.">A guide to genome engineering with programmable nucleases.</a> Nat. Rev. Genet. 15, 321-334 (2014).</li><li>Dahlem, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+methods+for+generating+and+detecting+locus-specific+mutations+induced+with+TALENs+in+the+zebrafish+genome.">Simple methods for generating and detecting locus-specific mutations induced with TALENs in the zebrafish genome.</a> PLoS Genet. 8, e1002861 (2012).</li><li>Thomas, H. R., Percival, S. M., Yoder, B. K., Parant, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+genome+editing+and+phenotyping+facilitated+by+high+resolution+melting+curve+analysis.">High-throughput genome editing and phenotyping facilitated by high resolution melting curve analysis.</a> PLoS One. 9, 114632 (2014).</li><li>Kim, J. M., Kim, D., Kim, S., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotyping+with+CRISPR-Cas-derived+RNA-guided+endonucleases.">Genotyping with CRISPR-Cas-derived RNA-guided endonucleases.</a> Nat. Commun. 5, 3157 (2014).</li></ol>

הדפיקות מתוך גן ספציפי בקו תא מודל של בחירה הפכו לשגרת הבהרת התפקיד כי הגן מתנגן כי בהקשר הסלולר בפרט. למעשה, מספר מסכי הגנום זמינים כרגע המשתמשים במערכת קריספר / Cas9 למקד כמעט כל גנים אנושיים הידועים בגנום 14, 15, 16. עם מ?...

גישות גנטיות הפוכות אפשרו למדענים להבהיר את ההשפעות של שינויים ספציפיים בגנום על התא או אורגניזם שלם. לדוגמא, הביטוי של גן מסוים יכול להיות נחלש ידי גן מציאת 1, 2 (הפחתה חלקית) או נוקאאוט גנטי 3, 4 (אבלציה שלם) כדי לקבוע את ההשפעה שיש לכך על הפונקציה של התא או על התפתחות האורגניזם. ג&#39;ין ניסויים בנוקאאוט הפכו קלים יותר מאז כניסתה של nucleases לתכנות ספציפי ברצף, כגון nucleases אצבע אבץ (ZFNs) ו nucleases מפעיל דמוי מפעיל שעתוק (TALENs). עם זאת, האפיון היחסי האחרון של התקבץ וביניהם חוזר palindromic קצר בקביעות (קריספר) / מערכת Cas9 עשה את זה קל מאוד עבור כל מעבדה ברחבי העולם לבצע genניסויים בנוקאאוט דואר. בעיקרו של דבר, המערכת קריספר / Cas9 מורכב משני רכיבים-A חיוני RNA מדריך יחיד (sgRNA), אשר מכיר נקשר באמצעות השלמה הבסיס רצף מסוים בגנום, וכן endonuclease שנקרא Cas9. מה שבא אחרי מחייב פעולה מסוימת של מורכבות sgRNA-Cas9 על הדנ&quot;א הגנומי הוא מחשוף פעמיים גדיל של דנ&quot;א. זה, בתורו, מפעיל את מנגנון תגובת ניזק DNA בתא, אשר תוקן לאחר מכן באמצעות הצטרפותו קצה שאינם הומולוגיים (NHEJ) או הומולוגי המסלולים (HR). היות ומנגנון תיקון NHEJ (אבל לא את מנגנון HR) לעתים קרובות תוצאות ההחדרה האקראית או המחיקה של נוקלאוטידים באתר של תיקון, וכתוצאה מכך מוטציות החדרה / מחיקה (indel), הוא עלול לגרום מסגרת הקריאה של אקסון להעביר. מצב זה יכול לגרום נוק אאוט של הגן עקב סיום מוקדם של התרגום וריקבון בתיווך שטויות 5, 6,7. למרות הנוחות המוענקת על ידי כניסתה של מערכת קריספר / Cas9 ב שחסל גן, גנוטיפ של שיבוטים של תאים ממוקדים נותר צוואר בקבוק, במיוחד תפוקה גבוהה הגדרה 8, 9. טכניקות קיימות או סובלות מגבלות מובנות גדולות או הם יקרים כלכליים. לדוגמה, assay שמאי T7E1, המהווה assay האנזימטית שמזהה חוסר התאמה ב- DNA דופלקסים 10, הוא לא מסוגל להבחין בין שיבוטים wildtype מוטנטים הומוזיגוטים (שיבוטים אשר אללים הם מוטציה זהה), שכן יש שיבוטים אלה אללים זהים ובכך לא מציג חוסר התאמה ב- DNA הרצף שלהם 11. בנוסף, שימוש רצף סנגר, הנחשב את תקן זהב genotyping שיבוטי מוטציה, או בהתקנת תפוקה גבוהה אינו רצוי בשל עלותו הגבוהה. כאן, אנו מציגים Detפרוטוקול שמציק של טכניקת אלקטרופורזה PCR-נימי ג&#39;ל ניאון, אשר יכולה לעקוף את המגבלות של הטכניקות גנוטיפ קיימות האחרות, והוא שימושי במיוחד בביצוע מסך תפוקה גבוהה של שיבוטים בנוקאאוט בתיווך nuclease. שיטה זו היא טכנית פשוטה לביצוע, חוסך זמן ועלות.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1548">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:401px;">HEPG2 cells</td>
			<td style="width:196px;">ATCC</td>
			<td style="width:135px;">HB-8065</td>
			<td style="width:816px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HyClone Dulbecco&#39;s Modified Eagles Medium (DMEM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SH30022.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HyClone Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SV30160.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pSpCas9(BB)-2A-GFP plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>PX458</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Lipofectamine 2000</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11668027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15400054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HyClone Water, Molecular Biology Grade</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>SH30538.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CRISPR sgRNA insert oligonucleotide (sense)</td>
			<td>AITbiotech</td>
			<td>None</td>
			<td>Sequence: 5&#39;-CACCGCTAACCTTTCAGCCTGCCTA-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CRISPR sgRNA insert oligonucleotide (anti-sense)</td>
			<td>AITbiotech</td>
			<td>None</td>
			<td>Sequence: 5&#39;-AAACTAGGCAGGCTGAAAGGTTAGC-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Unlabeled PCR amplification forward primer</td>
			<td>AITbiotech</td>
			<td>None</td>
			<td>Sequence: 5&#39;-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3&#39;; this primer is also used to sequence PCR amplified alleles</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">6-FAM-labeled fluorescent PCR forward primer</td>
			<td>AITbiotech</td>
			<td>None</td>
			<td>Sequence: 5&#39;-6-FAM-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEX-labeled fluorescent PCR forward primer</td>
			<td>AITbiotech</td>
			<td>None</td>
			<td>Sequence: 5&#39;-HEX-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Unlabeled PCR reverse primer</td>
			<td>AITbiotech</td>
			<td>None</td>
			<td>Sequence: 5&#39;-CCTCTTCCAAGTCTGCTTATGT-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Taq PCR Core Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>201223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hi-Di Formamide</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4311320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GeneScan 500 LIZ Dye Size Standard</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4322682</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4306737</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">3500xL Genetic Analyzer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4405633</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">3500 Series 2 program</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4476988</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gene Mapper 5 program</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4475073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gentra Puregene Cell Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>1045696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A9282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NAP1L1 Antibody (N-term)</td>
			<td>Abgent</td>
			<td>AP1920b</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nuclear Matrix Protein p84 antibody [5E10]</td>
			<td>GeneTex</td>
			<td>GTX70220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>111-035-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Peroxidase AffiniPure Sheep Anti-Mouse IgG</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>515-035-003</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using a fluorescent pcr-capillary gel electrophoresis technique to genotype crispr/cas9-mediated knockout mutants in a high-throughput format

פיתוחם של כלים הגנום עריכה לתכנות יש להקל את השימוש של גנטיקה הפוכה כדי להבין את תפקידי רצפים גנומיים ספציפיים לשחק בתפקוד של תאים ואורגניזמים כולו. הגורם הזה כבר סייע מאוד על ידי הקדמה האחרונה של קריספר / מערכת-a Cas9 כלי תכליתי המאפשר לחוקרים כדי לתפעל את הגנום transcriptome כדי, בין שאר, לדפוק, להפיל, או לדפוק בגנים בתוך ממוקד דֶרֶך. לצורך לדפוק גן, קריספר / Cas9 בתיווך הפסקות פעמי גדיל לגייס את מסלול תיקון DNA שאינו הומולוגי שהצטרף-סוף להציג החדרה או מחיקת frameshift-גרימת נוקלאוטידים באתר ההפסקה. עם זאת, RNA מדריך פרט עלול לגרום תופעות מחוץ היעד רצויים, ועל מנת לשלול אלה, שימוש RNAs מדריך המרובה הכרחי. ריבוי זה של מטרות גם אומר הקרנה בנפח גבוה של שיבוטים נדרש, אשר בתורו מעלה את השימוש EFficient טכניקת תפוקה גבוהה כדי גנוטיפ השיבוטים בנוקאאוט. טכניקות גנוטיפ נוכחיות או סובלות מגבלות מובנות או לגרום לעלות גבוהה, ולכן טיווחו אותם מתאימים למטרות תפוקה גבוהה. כאן, פרט לנו את הפרוטוקול לשימוש פלורסנט PCR, אשר משתמש DNA הגנומי של תא lysate הגולמי כתבנית, ולאחר מכן לפתור את שברי PCR באמצעות ג&#39;ל אלקטרופורזה נימים. טכניקה זו היא מדויקת מספיק כדי לבדל הבדל בסיס-זוג אחד בין שבר ולכן היא מתאימה המעידה על הנוכחות או היעדר frameshift ברצף הקידוד של הגנים הממוקדים. ידיעה מדויקת זה מונע את הצורך ביעילות צעד רצף מאשר ומאפשרת למשתמשים לחסוך זמן ועלויות בתהליך. יתר על כן, טכניקה זו הוכיחה להיות תכליתי genotyping בתאי יונקים שונים של מקורות רקמות שונים הממוקדים ידי RNAs מדריך נגד גנים רבים, כפי שמוצג כאן ובמקומות אחרים.

ניאון טכניקת ג&#39;ל אלקטרופורזה PCR-נימים המתוארות כאן צפויה לחול בכל אזור ניתן למיקוד בגנום כמעט בכל קו תא ניתן למסירת דנ&quot;א זרה. הוכחנו היישום שלה בעבר על ידי מיקוד שלושה גנים בקו תא סרטן מעי גס 12. הנה, אנחנו מראים את יעילותו genotyping שורת ת...

Watch this Scientific Journal Video about Using a Fluorescent PCR-capillary Gel Electrophoresis Technique to Genotype CRISPR/Cas9-mediated Knockout Mutants in a High-throughput Format at JoVE.com

Using a Fluorescent PCR-capillary Gel Electrophoresis Technique to Genotype CRISPR/Cas9-mediated Knockout Mutants in a High-throughput Format

טכניקת גנוטיפ המתוארת כאן, אשר זוגות תגובת השרשרת של פולימראז פלורסנט (PCR) כדי נימי ג&#39;ל אלקטרופורזה, מאפשרת גנוטיפ תפוקה גבוהה של שיבוטים בנוקאאוט בתיווך nuclease. זה עוקף מגבלות בפני טכניקות גנוטיפ אחרות הוא יותר חסכוני מאשר שיטות סידור.

באמצעות טכניקה ג&#39;ל אלקטרופורזה פלורסנט PCR-נימי הגנוטיפ קריספר / Cas9 בתיווך נוק מוטאנטים בתוך פורמט תפוקה גבוהה

The development of programmable genome-editing tools has facilitated the use of reverse genetics to understand the roles specific genomic sequences play ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Perturbations of Circulating miRNAs in Irritable Bowel Syndrome Detected Using a Multiplexed High-throughput Gene Expression Platform

הפרעות של במחזור miRNAs ב תסמונת מעי רגיז זוהו באמצעות פלטפורמת ביטוי גני תפוקה הגבוהה Multiplexed

The gene expression platform assay allows for robust and highly reproducible quantification of the expression of up to 800 transcripts (mRNA or miRNAs) in ...

High-Throughput Robotically Assisted Isolation of Temperature-sensitive Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii

High-Throughput Robotically Assisted Isolation of Temperature-sensitive Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii

תפוקה גבוהה בידוד Assisted רובוטית של מוטאנטים קטלניים רגישים-טמפרטורה<em&gt; Chlamydomonas reinhardtii</em

Systematic identification and characterization of genetic perturbations have proven useful to decipher gene function and cellular pathways. However, the ...

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

הבחירה תלויה עצמאית הדור של CRISPR / Cas9 בתיווך גין Knockouts בתאי יונקים

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

דור של כרומטין יליד Immunoprecipitation רצף ספריות לניתוח צפיפות נוקלאוזום

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

G2-seq: A High Throughput Sequencing-based Technique for Identifying Late Replicating Regions of the Genome

G2-seq: תפוקה גבוהה המבוססת על רצף טכניקה לזיהוי מאוחר לבצע שיכפול אזורים בגנום

Numerous techniques have been developed to follow the progress of DNA replication through the S phase of the cell cycle. Most of these techniques have ...

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

DNA חזקים בידוד ובנייה ספריית רצף תפוקה גבוהה עבור דגימות עשבייה

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-מתווכת אינטגרציה יישוב In Vivo באמצעות אסטרטגיה מבוסס על הצטרפות סוף בתיווך הומולוגיה

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells

פרוטוקול עבור הייצור של וקטורים Lentiviral חשוכת-Integrase עבור CRISPR/Cas9-מתווכת נוקאאוט גנטי חלוקת תאים

Lentiviral vectors are an ideal choice for delivering gene-editing components to cells due to their capacity for stably transducing a broad range of cells ...

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

זיהוי תפוקה גבוהה של שילובים תרופתיים סינרגטי בשיטת חפיפה2

Although antimicrobial drugs have dramatically increased the lifespan and quality of life in the 20th century, antimicrobial resistance threatens our ...

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

מהירה עם צינור נתיישב עבור יצירת מוטציות נקודה גנומית ב- C. elegans באמצעות CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

The clustered regularly interspersed palindromic repeats (CRISPR)-CRISPR-associated protein 9 (Cas9) prokaryotic adaptive immune defense system has been ...