Name: a chronic autoimmune dry eye rat model with increase in effector memory t cells in eyeball tissue
Uploaded: 2017-06-07T13:00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Chronic Autoimmune Dry Eye Rat Model with Increase in Effector Memory T Cells in Eyeball Tissue at JoVE.com

Forfatterne vil gerne takke fru Tin Min Qi og Dr. Veluchamy Amutha Barathi og hendes hold for deres hjælp til håndtering af dyrene. Dette arbejde blev understøttet af NHIC-I2D-1409007, SingHealth Foundation SHF / FG586P / 2014 og NMRC / CSA / 045/2012.

Dyrene blev håndteret i henhold til institutionelle retningslinjer og ARVO-erklæringen for anvendelse af dyr i øjet og øjneforskning. Studieprotokollen blev godkendt af den institutionelle dyrepleje og brugskomité for SingHealth. 1. Fremstilling af Lacrimal Gland Extract BEMÆRK: Rotter blev bedøvet med intraperitoneal injektion af ketamin (75 mg / kg) og xylazin (10 mg / kg). Korrekt anæstetisering blev bekræftet ved tå klemning og hale klemning. Ophthalmic gel blev påført på rotte øjne for at forhindre tørhed efter hver procedure. De bedøvede rotter blev anbragt under fjern infrarøde lys for at holde dyrene varme indtil de helt blev genoprettet. Under procedurerne og restitutionstiden blev dyrene nøje overvåget af forskere. Alle materialer og kirurgiske værktøjer var sterile før brug. Ved forsøgets afslutning blev rotter euthaniseret ved intraperitoneal injektion af pentobarbital (80 mg / kg).Komplet eutanasi blev verificeret ved manglende hjertepuls og ingen blinkrefleks ved at berøre øjehullet. Rotter blev anbragt under standardbetingelser: stuetemperatur, 21-23 ° C; Relativ luftfugtighed, 30-70%; Lys-mørk cyklus, vekslende 12 h (7 AM til 7 PM). <ol><li> Placer de euthaniserede kvindelige Sprague-Dawley rotter (aldersgruppe fra 8 uger til 16 uger) fladt, med et øre mod bordet og den anden opad. Lav en 10 mm snit overlegen-underlegen under det synlige øre med et par fjeder saks. Fjern lacrimal kirtel ved at dissekere det fra det omgivende bindevæv og fra drænkanalen. <ol><li> Opbevar kirtlerne ved -80 ° C indtil det kræves. Tør kirtlerne på is. Hakkel så fint som muligt på is med saks. Tilsæt 150 μl PBS med 1x proteaseinhibitor pr lakrimalkirtlen. </li></ol></li><li> Sonikere prøverne på is i 5 minutter ved 20 kHz med sonikatoren sat til 10 s on, 10 s off ved 30% amplitude. Centrifuger sønnenIcerede prøver i 20 minutter ved 13.000 xg og 4 ° C. </li><li> Pipetter supernatanten og overfør den til et nyt rør. Aliquot supernatanten til 1,5 ml rør og opbevar dem ved -80 ° C. Mål proteinkoncentrationen med et bicinchoninsyre-assay 22 ifølge producentens anvisninger. </li></ol> 2. Fremstilling af emulsions- og pertussis-toksin <ol><li> Emulsion <ol><li> Tilsæt 40 ​​mg varmdræbt Mycobacterium tuberculosis H37Ra i 10 ml komplet Freunds adjuvans indeholdende 1 mg / ml Mycobacterium tuberculosis H37Ra og bland godt. BEMÆRK: Den endelige komplette Freunds adjuvans indeholder 5 mg / ml Mycobacterium tuberculosis H37Ra. </li><li> Væg ovalbuminet, opløs det i PBS og tilbered en antigenblanding indeholdende 2 mg / ml ovalbumin og 10 mg / ml lakrimalkirtleekstrakt. Mål for et injektionsvolumen på 200 μl for hvert dyr, tilbered en masterblanding bAsed på dyret numre. </li><li> Overfør ufuldstændig Freunds adjuvans eller komplet Freunds adjuvans til et 50 ml rør, hvilket sikrer, at mængden af ​​adjuvans til antigenblandingen er i et forhold 1: 1. Tilsæt antigenblandingen drop-by-drop til adjuvansen, mens vortexing med den højeste hastighed, der ikke resulterer i spild. Fortsæt vortexing i 5 minutter efter at alt antigen er blevet tilsat. </li><li> Overfør emulsionen til en 5 ml sprøjte og bind den sammen med en anden 5 ml sprøjte gennem en sprøjtekontakt. Skub emulsionen fra en sprøjte til den anden for at blande den. BEMÆRK: Emulsionen er klar, hvis en enkelt dråbe forbliver som en kugle, når den placeres i vand. Kun frisklavet emulsion eller emulsion opbevaret natten over ved 4 ° C bør anvendes. </li></ol></li><li> Pertussis toxin <ol><li> Rekonstituer 50 μg pertussis toksin i 500 μl vand for at opnå en slutkoncentration på 100 ng / μl. Votex beholderen i 30 s for at sikre tOxin opløses fuldstændigt. BEMÆRK: Steriliser ikke ved filtrering, da dette vil medføre tab af materiale. Må ikke nedfryses. Denne opløsning forbliver aktiv i mindst 6 måneder ved 4 ° C. </li><li> Fortynd 100 ng / μl pertussis toksin til 3 ng / μl ved anvendelse af PBS. Overfør 100 μL af det fortyndede pertussis toksin til en 1 ml Luer-lock injektionssprøjte med en 27 G nål. </li></ol></li></ol> 3. Immunisering af Lewis-rotterne <ol><li> På dag 0 blandes emulsionen et par gange. Fordel 200 μL emulsionen, som indeholder 1 mg lacrimalkirtleekstrakt og 200 μg ovalbumin i komplet Freunds adjuvans, i 1 ml Luer-låsesprøjter med 27 G nåle. Injicer emulsionen subkutant i bunden af ​​rottehalerne uden bedøvelse. BEMÆRK: Halen behøver ikke at blive forvarmet før injektionen. Hver rotte immuniseres med 1 mg lacrimalkirtleekstrakt og 200 μg ovalbumin i komplet Freunds adjuvans hvidH 500 μg Mycobacterium tuberculosis H37Ra. </li><li> På dag 14 injicerer 200 μl emulsionen, som indeholder 1 mg lacrimalkirtleekstrakt og 200 μg ovalbumin i ufuldstændig Freunds adjuvans på samme måde som på dag 0. Injicer 300 ng pertussis toksin i 100 μl PBS intraperitonealt Pr. Rotte på samme dag. </li></ol> 4. Injektion af antigenblandingen i forniceal subconjunctiva og lakrimalkirtlen til rekruttering af antigenspecifikke immunceller og forårsage lokal inflammation <ol><li> Beregn mængden af ​​ovalbumin og lacrimal kirtelekstrakt baseret på antallet af rotter i eksperimentet. Væg den nødvendige mængde ovalbumin og kombiner den med det afrimte lacrimalkirtleekstrakt fremstillet i trin 1, hvilket gør antigenopløsning indeholdende 1 mg / ml ovalbumin og 1 mg / ml lakrimalkirtleekstrakt. </li><li> Bedøves rotterne med ketamin (75 mg / kg) og xylazin (10 mg / kg) ved intraperitoneal injektion. Pinch toRottene for at sikre, at der er opnået en ordentlig anæstesi ( dvs. ingen bevægelsesbevægelse observeres efter klemmen). Injicer 5 μl antigen i øjets fornitale subkonjunktiva. Injicer 20 μl antigen i lacrimalkirtlen. </li></ol> 5. Vurdering af tør øjne funktioner BEMÆRK: For trin 5.1-5.3 skal de bedøvede rotter holdes forsigtigt af en handskbet hånd i opretstående stilling på en plan overflade for at undgå bevægelse. <ol><li> Mål tåremængden med fenolrød tråd. <ol><li> Brug et par tænger til at holde tråden og en anden for at trække det nedre øjenlåg af rotte. Placer tråden i det proksimale hjørne af den nedre fornix i 1 minut, og fjern derefter tråden. BEMÆRK: Tårer gør den befugtede del af tråden rød i farve. </li><li> Tag et billede af længden af ​​den befugtede del af tråden ved siden af ​​en linjal med millimeter markeringer. Mål den befugtede længde til den tiende oFa millimeter ved hjælp af et billedprogram ( f.eks. ImageJ). </li></ol></li><li> Mål hornhinde / rive glathed. <ol><li> Placer rotten under et stereomikroskop udstyret med en ringbelysning og et kamera. Påfør 5 μl saltvand til rotter hornhinden. Passivt blinke ved at flytte det øvre og nedre øjenlåg med glovede fingre ~ 5 gange for at sprede saltvand. </li><li> Fokusér ringbelysningen på midten af ​​hornhindeoverfladen under 1,6x forstørrelse. Få fotografiske billeder efter 10 s. BEMÆRK: Ringbelysningen projekterer to cirkulære rækker prikkbilleder på dyrets hornhinder. Regelmæssig afstand mellem de uforstyrrede prikker antyder et glat hornhinde / tårelag. </li></ol></li><li> Mål kornealskader med fluoresceinfarvning. <ol><li> Tilsæt 2 μL 0,2% fluorescein til rottehinden. Passivt åbner og lukker røde øjenlåg 3 gange med en handsken finger for at sprede fluoresceinfarvestoffet på overfladen af ​​øjet. </li><lI&gt; Efter 1 minut tegnes 1 ml saltvand med en 3 ml sprøjte (uden nålfastgørelse), placer sprøjten ca. 2-3 mm foran hornhinden, og forsigtigt forsynet saltvand på øjet. </li><li> Få billeder under koboltblåt filter ( dvs. ~ 400 nm) af et okulært billedmikroskop med baggrundslysene slukket. BEMÆRK: Billeder blev efterfølgende analyseret af et klassificeringssystem modificeret fra tidligere publikationer 23 . Billeder blev derefter analyseret ved at indplacere antallet, området og intensiteten af ​​de grønne pletter fra 0 til 2, hvor 0 angiver deres fraværende, 1 angiver punkteringsfarvning på mindre end 50 pletter og 2 angiver punkteringsfarvning på mere end 50 pletter. </li></ol></li><li> Udliv rotterne gennem intraperitoneal injektion af pentobarbital (80 mg / kg). Fjern øvre og nedre øjenlåg med saks. Fix og prolapse øjnene ved at skubbe ned på det periokulære væv med tang. Fri kloden ved at adskille tHan ekstraokulære muskler, optisk nerve og forniceal conjunctiva. </li><li> Fastgør positionen af ​​rotteøjehulet med pincet og åbne det med et perifert snit langs ækvator. Fjern linsen og glaspladen. Sæt de dissekerede øjne i 1,5 ml rør på is. </li><li> Saml lakrimalkirtlerne som beskrevet i trin 1.1. Overfør straks de dissekerede øjnevæv og lacrimalkirtler til laboratoriet for at forberede sig på flowcytometrianalyse. </li><li> Isolerede immuncellerne med kollagenase og dispas II fordøjelsesmetoder 24 , 25 . Fortsæt med at anvende flowcytometri til profilering af T-celle-subpopulationen i øjenklapvævene 26 . BEMÆRK: Antistoffepanelet er: anti-CD45APC-cyanin7 (OX-1), anti-CD3 BV421 (1F4), anti-CD4 PE-cyanin7 (OX-35), anti-CD45RC Alexa647 (OX-22) -CD62 PE (HRL1), anti-CD44 FITC (OX-50) og levedygtighedscellefarvestof 7-AAD. Blandt CD45 + CD3 <sup&gt; + 7AAD - population, naiv (CD3 + CD45RC + ), effektorhukommelse (T EM, CD3 + CD45RC - CD44 + CD62L-) og central hukommelse (T CM, CD3 + CD45RC - CD44 + CD62L + ) . </li></ol>

<ol>
	<li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+definition+and+classification+of+dry+eye+disease:+report+of+the+Definition+and+Classification+Subcommittee+of+the+International+Dry+Eye+WorkShop+(2007).">The definition and classification of dry eye disease: report of the Definition and Classification Subcommittee of the International Dry Eye WorkShop (2007).</a> Ocul Surf. 5 (2), 75-92 (2007).</li><li>Gayton, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Etiology,+prevalence,+and+treatment+of+dry+eye+disease.">Etiology, prevalence, and treatment of dry eye disease.</a> Clin Ophthalmol. 3, 405-412 (2009).</li><li>Tong, L., Tan, J., Thumboo, J., Seow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dry+eye.">The dry eye.</a> Praxis (Bern 1994). 102 (13), 803-805 (2013).</li><li>Messmer, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathophysiology,+diagnosis,+and+treatment+of+dry+eye+disease.">The pathophysiology, diagnosis, and treatment of dry eye disease.</a> Dtsch Arztebl Int. 112 (5), 71-81 (2015).</li><li>Liu, K. C., Huynh, K., Grubbs, J., Davis, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoimmunity+in+the+pathogenesis+and+treatment+of+keratoconjunctivitis+sicca.">Autoimmunity in the pathogenesis and treatment of keratoconjunctivitis sicca.</a> Curr Allergy Asthma Rep. 14 (1), 403 (2014).</li><li>Stevenson, W., Chauhan, S. K., Dana, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dry+eye+disease:+an+immune-mediated+ocular+surface+disorder.">Dry eye disease: an immune-mediated ocular surface disorder.</a> Arch Ophthalmol. 130 (1), 90-100 (2012).</li><li>Tong, L., Thumboo, J., Tan, Y. K., Wong, T. Y., Albani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+eye:+a+window+of+opportunity+in+rheumatoid+arthritis.">The eye: a window of opportunity in rheumatoid arthritis.</a> Nat Rev Rheumatol. 10 (9), 552-560 (2014).</li><li>Carnahan, M. C., Goldstein, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ocular+complications+of+topical,+peri-ocular,+and+systemic+corticosteroids.">Ocular complications of topical, peri-ocular, and systemic corticosteroids.</a> Curr Opin Ophthalmol. 11 (6), 478-483 (2000).</li><li>Johannsdottir, S., Jansook, P., Stefansson, E., Loftsson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+cyclodextrin-based+aqueous+cyclosporin+A+eye+drop+formulations.">Development of a cyclodextrin-based aqueous cyclosporin A eye drop formulations.</a> Int J Pharm. 493 (1-2), 86-95 (2015).</li><li>Prabhasawat, P., Tesavibul, N., Karnchanachetanee, C., Kasemson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+cyclosporine+0.05%+eye+drops+in+Stevens+Johnson+syndrome+with+chronic+dry+eye.">Efficacy of cyclosporine 0.05% eye drops in Stevens Johnson syndrome with chronic dry eye.</a> J Ocul Pharmacol Ther. 29 (3), 372-377 (2013).</li><li>Ishimaru, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Severe+destructive+autoimmune+lesions+with+aging+in+murine+Sjogren's+syndrome+through+Fas-mediated+apoptosis.">Severe destructive autoimmune lesions with aging in murine Sjogren's syndrome through Fas-mediated apoptosis.</a> Am J Pathol. 156 (5), 1557-1564 (2000).</li><li>Jonsson, R., Tarkowski, A., Backman, K., Holmdahl, R., Klareskog, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sialadenitis+in+the+MRL-l+mouse:+morphological+and+immunohistochemical+characterization+of+resident+and+infiltrating+cells.">Sialadenitis in the MRL-l mouse: morphological and immunohistochemical characterization of resident and infiltrating cells.</a> Immunology. 60 (4), 611-616 (1987).</li><li>Jonsson, R., Tarkowski, A., Backman, K., Klareskog, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+characterization+of+sialadenitis+in+NZB+X+NZW+F1+mice.">Immunohistochemical characterization of sialadenitis in NZB X NZW F1 mice.</a> Clin Immunol Immunopathol. 42 (1), 93-101 (1987).</li><li>Li, H., Dai, M., Zhuang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+T+cell+intrinsic+role+of+Id3+in+a+mouse+model+for+primary+Sjogren's+syndrome.">A T cell intrinsic role of Id3 in a mouse model for primary Sjogren's syndrome.</a> Immunity. 21 (4), 551-560 (2004).</li><li>Shull, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+disruption+of+the+mouse+transforming+growth+factor-beta+1+gene+results+in+multifocal+inflammatory+disease.">Targeted disruption of the mouse transforming growth factor-beta 1 gene results in multifocal inflammatory disease.</a> Nature. 359 (6397), 693-699 (1992).</li><li>Green, J. E., Hinrichs, S. H., Vogel, J., Jay, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exocrinopathy+resembling+Sjogren's+syndrome+in+HTLV-1+tax+transgenic+mice.">Exocrinopathy resembling Sjogren's syndrome in HTLV-1 tax transgenic mice.</a> Nature. 341 (6237), 72-74 (1989).</li><li>Shen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+autoimmunity+in+IL-14alpha-transgenic+mice.">Development of autoimmunity in IL-14alpha-transgenic mice.</a> J Immunol. 177 (8), 5676-5686 (2006).</li><li>Hayashi, Y., Hirokawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunopathology+of+experimental+autoallergic+sialadenitis+in+C3H/He+mice.">Immunopathology of experimental autoallergic sialadenitis in C3H/He mice.</a> Clin Exp Immunol. 75 (3), 471-476 (1989).</li><li>Liu, S. H., Zhou, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+autoimmune+dacryoadenitis:+purification+and+characterization+of+a+lacrimal+gland+antigen.">Experimental autoimmune dacryoadenitis: purification and characterization of a lacrimal gland antigen.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 33 (6), 2029-2036 (1992).</li><li>Liu, S. H., Prendergast, R. A., Silverstein, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+autoimmune+dacryoadenitis.+I.+Lacrimal+gland+disease+in+the+rat.">Experimental autoimmune dacryoadenitis. I. Lacrimal gland disease in the rat.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 28 (2), 270-275 (1987).</li><li>Jiang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+model+of+experimental+autoimmune+keratoconjunctivitis+sicca+(KCS)+induced+in+Lewis+rat+by+the+autoantigen+Klk1b22.">A new model of experimental autoimmune keratoconjunctivitis sicca (KCS) induced in Lewis rat by the autoantigen Klk1b22.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 50 (5), 2245-2254 (2009).</li><li>Walker, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bicinchoninic+acid+(BCA)+assay+for+protein+quantitation.">The bicinchoninic acid (BCA) assay for protein quantitation.</a> Methods Mol Biol. 32, 5-8 (1994).</li><li>Lin, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+dry+eye+model+induced+by+topical+administration+of+benzalkonium+chloride.">A mouse dry eye model induced by topical administration of benzalkonium chloride.</a> Mol Vis. 17, 257-264 (2011).</li><li>Cousins, S. W., Streilein, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+detection+of+lymphocyte+proliferation+in+eyes+with+immunogenic+inflammation.">Flow cytometric detection of lymphocyte proliferation in eyes with immunogenic inflammation.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 31 (10), 2111-2122 (1990).</li><li>Yawata, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+change+in+natural+killer+cell+type+in+the+human+ocular+mucosa+in+situ+as+means+of+immune+evasion+by+adenovirus+infection.">Dynamic change in natural killer cell type in the human ocular mucosa in situ as means of immune evasion by adenovirus infection.</a> Mucosal Immunol. 9 (1), 159-170 (2016).</li><li>Chen, Y., Chauhan, S. K., Lee, H. S., Saban, D. R., Dana, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+dry+eye+disease+is+principally+mediated+by+effector+memory+Th17+cells.">Chronic dry eye disease is principally mediated by effector memory Th17 cells.</a> Mucosal Immunol. 7 (1), 38-45 (2014).</li><li>Goldmuntz, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+of+the+autoimmune+disease-resistant+LER+rat:+an+outcross+between+the+buffalo+and+autoimmune+disease-prone+Lewis+inbred+rat+strains.">The origin of the autoimmune disease-resistant LER rat: an outcross between the buffalo and autoimmune disease-prone Lewis inbred rat strains.</a> J Neuroimmunol. 44 (2), 215-219 (1993).</li><li>Cahalan, M. D., Chandy, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functional+network+of+ion+channels+in+T+lymphocytes.">The functional network of ion channels in T lymphocytes.</a> Immunol Rev. 231 (1), 59-87 (2009).</li></ol>

Forfatterne har ingen interessekonflikter. LT modtog forudgående finansiering og / eller gaver fra Alcon, Allergan, Santen, Bausch og Lomb, Eyelens og Eyedetec.

Et kritisk trin i denne protokol er at sikre homogeniteten af ​​emulsionen. I velforberedte emulsioner er antigenerne fuldstændigt overtrukket med olie, hvilket sikrer langsom frigivelse af det injicerede antigen og kontinuerlig immunstimulering. Et andet kritisk træk ved denne protokol er brugen af ​​Lewis rotter. Lewis rotter er mere følsomme overfor udviklingen af ​​autoimmun sygdom end andre stammer 27 . Denne protokol er blevet modificeret fra to tidligere offentliggjorte protokoller, som enten kun anvendte lakrimalkirtleekstrakt eller rekombinant Klk1b22 20 , 21 . I den nuværende protokol anvendes ovalbumin plus lacrimalkirtleekstrakt som antigenet, og antigenspecifikke immunceller tiltrækkes på den okulære overflade og lacrimalkirtlen, hvilket fremkalder lokal vævsskade. Tørøje øjne udvikler sig langsomt og når ~ 85% dag 48 efter den indledende immunisering. Antigenisk udfordring tilØjen- og lakrimalkirtlen på dag 48 forværrer det tørre øje og sikrer dets kroniske virkning frem til dag 70. Sammenlignet med det rekombinante Klk1b22 i den Klk-inducerede DED-model er lacrimalkirtleekstraktet og ovalbuminet anvendt i den nuværende model billigere og lettere at opnå. Lacrimalkirtlenekstraktet indeholder også andre proteiner, bortset fra Klk, der kan inducere autoimmunitet, så dette ekstrakt er teoretisk mere potent end Klk-metoden ved at inducere DED. Vi har også forsøgt at immunisere rotter med lakrimalkirtleekstrakt alene; Skønt disse immuniserede rotter udviklede DED, var der ingen signifikant forøgelse af effektor-hukommelses-T-celler i øjnevæv sammenlignet med kontroller. Begrænsningen af ​​denne teknik er, at det tager 70 dage at opnå modellen. Effector-hukommelse T-celler er de vigtigste T-celle-undergrupper i det normale rotteøje. I denne model resulterer autoimmun DED i en stigning i CD3 + effector-hukommelse T-celler i øjet. Narkotika, der præferererUndertrykke effektive hukommelse T-celler, såsom selektive inhibitorer af Kv1.3 kaliumkanalen, kan derfor have en terapeutisk fordel på autoimmun DED 28 .

Tørre øjensygdomme (DED) er en multifaktorisk sygdom i tårerne og den okulære overflade, der resulterer i ubehag, synsforstyrrelser og tårefilmens ustabilitet, hvilket kan medføre skade på den okulære overflade. Det ledsages af øget osmolaritet af tårefilmen og ved betændelse i den okulære overflade 1 . Symptomer forbundet med DED brænder, stikkende, grittiness, fremmedlegeme sensation, tåre, okular træthed og tørhed 2 , 3 . De to hovedårsager til DED reducerer tåreproduktionen af ​​tåreafskærmningen og den overdrevne fordampning af tårfilmen 4 . Hos patienter med autoimmune sygdomme, såsom Sjogren syndrom, systemisk lupus erythematosus og reumatoid arthritis, beskadiges immunforstyrrelser på de meibomiske kirtler, udtrykket af lipider, der er essentielle for tårestabilitet. Endvidere nedsætter immunskade på den okulære overflade produktionenPå muciner, der er vigtige for overfladefugtighed. Sammen medfører disse processer kumulativt kronisk tørt øje 5 , 6 , 7 . Tear udskiftning og anti-inflammatorisk terapi er hovedprioriteterne i behandlingen. De nuværende antiinflammatoriske terapier til DED ( dvs. kortikosteroider og cyclosporin) er imidlertid stort set immunosuppressive, hvilket medfører alvorlige bivirkninger 8 , 9 , 10 . Der er behov for en egnet dyremodel til at teste nye immunmodulerende midler til behandling af autoimmunt tørt øje. Mus med specifikke genetiske defekter 11 , 12 , 13 , mus, der mangler specifikke gener 14 , 15 og transgene mus, der overudtrykker immunoregulatOrygener er blevet brugt som modeller af autoimmun tørt øje 16 , 17 . Antigeninducerede autoimmune dyremodeller er også blevet rapporteret hos mus 18 , kaniner 19 og rotter 20 , 21 . Her beskriver vi en antigen-induceret model af kronisk autoimmunt tørt øje. Denne model er en modifikation af to tidligere modeller; En brugte lakrimalkirtleekstrakter, og den anden brugte en autoantigen ( dvs. klk1b22) fra lacrimalkirtlerne 20 , 21 . Sygdommen blev induceret ved subkutan immunisering af 6 til 8 ugers gamle Lewis-hunrotter med ovalbumin, komplet Freunds adjuvans og en emulsion indeholdende lacrimalkirtleekstrakter fra Sprague-Dawley-rotter ( figur 1 ). En anden immunisering med det samme antigen i ufuldstændig Freunds adjuvans varIndgivet to uger senere. For at rekruttere antigenspecifikke immunceller til lacrimalkirtlen og okularoverfladen blev en blanding af lacrimalkirtleekstrakt og ovalbumin (1 mg / ml) injiceret i de fornitale subkonjunktiva og lacrimalkirtlerne i 6. - 7 . Uge ( Figur 1 ). Mere end 85% af rotterne udviklede karakteristiske træk ved tør øjne 70 dage efter den første immunisering. Disse egenskaber omfatter reduceret tåreproduktion ( figur 2 ), øget hornhindefluoresceinfarvning ( figur 3 ) og nedsat tårestabilitet ( figur 4 ). Immunprofilering af T-cellerne i øjnene af normale rotter ved hjælp af flowcytometri afslører en overvejelse af CD3 + effector-hukommelses-T-celler ( figur 5 og 6 ). Rotter med autoimmun DED viser en stigning i CD3 + effector-hukommelses-T-celler og tilsvarende fald i naive og centrale hukommelses-T-celler ( figur 6 </strong&gt;).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="995">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">Reagents</td>
			<td style="width:300px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">Protease inhibitor cocktail</td>
			<td style="width:300px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">P2714-1BTL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td style="width:300px;">Thermal Scientific</td>
			<td style="width:143px;">23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">Mycobacterium tuberculosis H37Ra&#160;</td>
			<td style="width:300px;">Becton, Dickinson and company</td>
			<td style="width:143px;">231141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">complete Freund&#39;s adjuvant</td>
			<td style="width:300px;">Becton, Dickinson and company</td>
			<td style="width:143px;">231131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">ovalbumin</td>
			<td style="width:300px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">A5503-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">incomplete Freund&#39;s adjuvant&#160;</td>
			<td style="width:300px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">F5506-6X10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">pertussis toxin&#160;</td>
			<td style="width:300px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">P7208-50UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">fluorescein sodium solution</td>
			<td style="width:300px;">Bausch &#38; Lomb U.K Limited</td>
			<td style="width:143px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">Name</td>
			<td style="width:300px;">Company</td>
			<td style="width:143px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">Equipment</td>
			<td style="width:300px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">Sonicator</td>
			<td>Sonics&#160;</td>
			<td>Vibra-Cell</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">phenol red thread</td>
			<td>Tianjin Jingming New Technological development Co. LTD.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:387px;">Stereo microscope with ring light illuminator and camera</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">Micro IV microscope&#160;</td>
			<td style="width:300px;">Phoenix Research Labs</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a chronic autoimmune dry eye rat model with increase in effector memory t cells in eyeball tissue

Tørøje øjne er en meget almindelig tilstand, der forårsager sygelighed og sundhedspleje byrde og nedsætter livskvaliteten. Der er et behov for en egnet tørøremodellmodel til at teste nye terapeutiske midler til behandling af autoimmune tørre øjneforhold. Denne protokol beskriver en kronisk autoimmun tørre øjne rotte model. Lewis-rotter blev immuniseret med en emulsion indeholdende lakrimalkirtleekstrakt, ovalbumin og komplet Freunds adjuvans. En anden immunisering med de samme antigener i ufuldstændig Freunds adjuvans blev administreret to uger senere. Disse immuniseringer blev administreret subkutant ved bunden af ​​halen. For at øge immunresponset på den okulære overflade og lacrimalkirtlerne blev lakrimalkirtleekstrakt og ovalbumin injiceret i de fornitale subkonjunktiva og lacrimale kirtler 6 uger efter den første immunisering. Rotterne udviklede tørre øjne funktioner, herunder reduceret tåreproduktion, nedsat tåre stabilitet og øget hornhinde skader. ImmunproArkivering ved hjælp af flowcytometri viste en overvejelse af CD3 + effector-hukommelses-T-celler i øjehullet.

Figur 1 illustrerer eksperimentdesign. På både dag 48 og dag 70 vurderes kliniske trækøjefunktioner i de immuniserede rotter. Tearvolumenet er repræsenteret af længden af ​​den våde del af fenolrødtråden. Figur 2 viser repræsentative billeder af phenolrøde tråde fra kontrol- og DED-rotter. Længden af ​​phenolrødtråden i DED-gruppen er kortere end kontrolgruppen, hvilket indikerer mindre tåremængde. Fluorescein binder til beskadiget hornhindeepitel. Således måles hornhindebeskadigelse ved hornhindefluoresceinfarvning. Fluoresceinpletter på hornhindeoverfladen af ​​DED-rotter blev graderet fra 0 til 2 og sammenlignet med kontrolrotter. Rotter med DED har mere fluoresceinfarvning end kontrolrotter ( Figur 3 ), hvilket tyder på hornhindebeskadigelse. HornhindejævnhedenI DED og kontrol rotter blev vurderet af ringbelysningen. Hvis hornhindeoverfladen er glat, med høj rivestabilitet, er billedet af belysningsringen på den okulære overflade rund og perfekt. Forvrængning af billedet indikerer reduceret kornealglathed og en ustabil tårefilm. Forvrængningsgraden af ​​ringen blev graderet fra 0 til 2. Et højere ringforvrængningsniveau blev noteret i DED-gruppen ( Figur 4 ), hvilket indikerer mindre rivestabilitet. Rotter defineres som tørre øjne, når mindst to kliniske træk ved tør øjne er unormale. Blandt de 24 immuniserede rotter udviklede 21 rotter DED på dag 48. Resultaterne var konsistente, når de blev evalueret på dag 70. Flowcytometrianalysen viser, at den overvejende T-celle delmængde i normale rotte-eyeballvæv er effektor-hukommelses-T-celler ( figur 5 ). I øjnene af DED rotter, ~ 70% af CD3+ T-celler er effektorhukommelses-T-celler, mens det i kontrolrotter er dette tal ~ 50%. Øjebolder af DED-rotter har signifikant højere effektor-hukommelses-T-celler end dem af kontrolrotter ( figur 6 ). <img alt="figur 1" src="/files/ftp_upload/55592/55592fig1.jpg" /> Figur 1: Skematisk af eksperimentelt design. LG: lakrimalkirtlen; DED: tør øjne sygdom; CFA: komplet Freunds adjuvans; IFA: ufuldstændig Freunds adjuvans. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55592/55592fig1large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/55592/55592fig2.jpg" /> Figur 2: Phenol Red Thread Measures Tear Volume. Phenol rød tråd er anbragt i det proximale hjørne af begge rotte øjne i 1 min og fjernes derefter. RepresentativE billeder af fenolrødtråd sammen med en linjal fra både kontrol- og DED-grupper vises. ImageJ blev brugt til at måle længden af ​​den våde del af de phenolrøde tråde. Skalbjælke = 1 mm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55592/55592fig2large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/55592/55592fig3.jpg" /> Figur 3: Repræsentative billeder af korneal epitelskader målt ved fluoresceinfarvning. Hver rotte hornhinde blev farvet med 0,2% fluorescein i 1 minut og spylt med mindst 1 ml saltvand. Billeder blev taget under et øjenbilledmikroskop med koboltblåt lys. Den første kolonne viser repræsentative billeder af kontrolhormoner. Den anden kolonne indeholder repræsentative billeder af hornhindefarvning fra rotter med DED-funktioner. De grønne fluorescerende pletter indikerer hornhindeepitel<html> Jeg beskadiger. Alle billeder blev produceret på samme farve skala. Kvantificeringen af ​​fluoresceinfarvning blev udført i overensstemmelse med området og densiteten af ​​de grønne pletter. Skalbjælke = 1 mm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55592/55592fig3large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a> <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/55592/55592fig4.jpg" /> Figur 4: Repræsentative Cornea-billeder Viser refleksionen af ​​ringbelysningen. Rat hornhinde / rive glathed blev målt ved en ringbelysning. Forvrængningsgraden af ​​ringen i de optagne billeder er et mål for relativ rivestabilitet. Den venstre kolonne viser de repræsentative billeder i kontroldyr, og den højre kolonne viser repræsentative billeder efter induktion af tør øjne. Skalbjælke = 1 mm.Ank &quot;&gt; Venligst klik her for at se en større version af denne figur. <img alt="Figur 5" src="/files/ftp_upload/55592/55592fig5.jpg" /> Figur 5: Dotplots afledt af flowcytometrianalyse. T-celler isoleret fra øjnevæv blev farvet med et panel af antistoffer. I CD45 + CD3 + 7AAD - populationen blev CD3 + 7-AAD - T-celler gated. Blandt CD3 + 7-AAD - T-cellerne blev de naive, centrale hukommelse og effektor-hukommelse T-cellepopulationer bestemt. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55592/55592fig5large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a> <img alt="Figur 6" src="/files/ftp_upload/55592/55592fig6.jpg" /> Figur 6: T-celle subpopulationsprofil i øjnene. CD3 + CD45RC+ Naive T-celler, CD3 + CD45RC - CD44 + CD62L-effektorhukommelse T (T EM ) celler og CD3 + CD45RC - CD44 + CD62L + -central-memory T (T CM ) -celler præsenteres som procentdelen af ​​CD3 + T-celler. Resultaterne er fra 3 kontrolrotter og 6 DED rotter. Lignende resultater blev opnået fra analysen af ​​T-celler fra isolerede lacrimalkirtler (data ikke vist). Den uparvede Students t-test blev brugt til statistisk sammenligning. Fejlstavene repræsenterer SD. * P &lt;0,05, ** p &lt;0,01. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55592/55592fig6large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Chronic Autoimmune Dry Eye Rat Model with Increase in Effector Memory T Cells in Eyeball Tissue at JoVE.com

A Chronic Autoimmune Dry Eye Rat Model with Increase in Effector Memory T Cells in Eyeball Tissue

Denne rapport beskriver en metode til at fremkalde kronisk eksperimentelt autoimmunt tørt øje i Lewis rotter gennem immunisering med en emulsion af råtta lakrimalkirtleekstrakt, ovalbumin og komplet Freunds adjuvans efterfulgt af injektion af lakrimalkirtleekstrakt og ovalbumin i de fornitale subkonjunktiva og lacrimalkirtlerne Seks uger senere.

En kronisk autoimmun tørre øjne rotte model med øget Effector Memory T celler i øjenvævssvæv

Dry eye disease is a very common condition that causes morbidity and healthcare burden and decreases the quality of life. There is a need for a suitable ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Quantitative Assessment of Immune Cells in the Injured Spinal Cord Tissue by Flow Cytometry:  a Novel Use for a Cell Purification Method

Detection of immune cells in the injured central nervous system (CNS) using morphological or histological techniques has not always provided true ...

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&iuml;ve and Memory T Cells

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve and Memory T Cells

Generering af inducerede regulatoriske T-celler fra primære humane naive og memory T-celler

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Ændring af primære humane T-celler

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Systemic Injection of Neural Stem/Progenitor Cells in Mice with Chronic EAE

Systemisk injektion af neurale stam / stamceller i mus med kronisk EAE

Neural stem/precursor cells (NPCs) are a promising stem cell source for transplantation approaches aiming at brain repair or restoration in regenerative ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Induktion af murine tarmbetændelse ved adoptiv overførsel af effektor CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Høj</sup&gt; T celler i immunsvækkede mus

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Application of Long-term cultured Interferon-&#947; Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle

Application of Long-term cultured Interferon-ÃƒÅ½Ã‚Â³ Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle

Anvendelse af Langsigtet kulturperler Interferon-γ Enzyme-linked immunospot Assay til Vurdering Effektorceller og Memory T celle responser i Cattle

Effector and memory T cells are generated through developmental programing of na&#239;ve cells following antigen recognition. If the infection is ...

Induction of Paralysis and Visual System Injury in Mice by T Cells Specific for Neuromyelitis Optica Autoantigen Aquaporin-4

Induktion af lammelse og visuelle System skade i mus af T celler specifik for Neuromyelitis Optica Autoantigen Aquaporin-4

While it is recognized that aquaporin-4 (AQP4)-specific T cells and antibodies participate in the pathogenesis of neuromyelitis optica (NMO), a human ...

An Efficient and Simple Method to Establish NK and T Cell Lines from Patients with Chronic Active Epstein-Barr Virus Infection

En effektiv og enkel metode til at etablere NK og T-cellelinier fra patienter med kronisk aktiv Epstein - Barr virusinfektion

A number of methods have been described to establish NK/T cell lines from patients with lymphoma or lymphoproliferative syndrome. These methods employed ...

In Vitro Differentiation Model of Human Normal Memory B Cells to Long-lived Plasma Cells

I Vitro differentiering Model af menneskets normale hukommelse B celler til langlivede plasmaceller

Plasma cells (PCs) secrete large amounts of antibodies and develop from B cells that have been activated. PCs are rare cells located in the bone marrow or ...