Name: a chronic autoimmune dry eye rat model with increase in effector memory t cells in eyeball tissue
Uploaded: 2017-06-07T13:00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Chronic Autoimmune Dry Eye Rat Model with Increase in Effector Memory T Cells in Eyeball Tissue at JoVE.com

Les auteurs souhaitent remercier Mme Tin Min Qi et le Dr Veluchamy Amutha Barathi et son équipe pour leur aide à manipuler les animaux. Ce travail a été soutenu par NHIC-I2D-1409007, SingHealth Foundation SHF / FG586P / 2014 et NMRC / CSA / 045/2012.

Les animaux ont été traités conformément aux lignes directrices institutionnelles et à la Déclaration ARVO pour l&#39;utilisation des animaux dans la recherche ophtalmologique et de la vision. Le protocole d&#39;étude a été approuvé par le comité institutionnel de soins animaux et d&#39;utilisation de SingHealth. 1. Préparation de l&#39;extrait de glande lacrymale NOTE: Les rats ont été anesthésiés avec l&#39;injection intrapéritonéale de kétamine (75 mg / kg) et de xylazine (10 mg / kg). Une anesthésie correcte a été confirmée par le pincement des oreilles et le pincement de la queue. Le gel ophtalmique a été appliqué aux yeux du rat pour prévenir la sécheresse après chaque procédure. Les rats anesthésiés ont été placés sous des feux infrarouges lointains pour garder les animaux chauds jusqu&#39;à ce qu&#39;ils se soient complètement rétablis. Au cours des procédures et du temps de récupération, les chercheurs ont surveillé de près les animaux. Tous les matériaux et les outils chirurgicaux étaient stériles avant utilisation. À la fin de l&#39;expérience, les rats ont été euthanasiés par injection intrapéritonéale de pentobarbital (80 mg / kg).L&#39;euthanasie complète a été vérifiée par manque de pouls cardiaque et sans réflexe clignotant en touchant le globe oculaire. Les rats ont été logés dans des conditions standard: température ambiante, 21 à 23 ° C; Humidité relative, 30-70%; Cycle lumière-sombre, alternant 12 h (7 à 7 heures). <ol><li> Placez les rats Sprague-Dawley femelles euthanasiés (âge de 8 semaines à 16 semaines) à plat, avec une oreille contre la table et l&#39;autre face vers le haut. Faire une incision de 10 mm supérieure - inférieureement sous l&#39;oreille exposée avec une paire de ciseaux à ressort. Enlevez la glande lacrymale en la disséquant du tissu conjonctif environnant et du conduit de drainage. <ol><li> Rangez les glandes à -80 ° C jusqu&#39;à ce qu&#39;elles soient nécessaires. Décongeler les glandes sur la glace. Pique le plus fin possible sur la glace avec des ciseaux. Ajouter 150 μL de PBS avec 1x inhibiteur de la protéase par glandes lacrymales. </li></ol></li><li> Sonicate les échantillons sur de la glace pendant 5 min à 20 kHz avec le sonicateur réglé à 10 s allumé, 10 s à 30% d&#39;amplitude. Centrifugez le filsÉchantillons glacés pendant 20 min à 13 000 xg et 4 ° C. </li><li> Pipettez le surnageant et transférez-le sur un nouveau tube. Aliquoter le surnageant dans des tubes de 1,5 mL et les conserver à -80 ° C. Mesurer la concentration de protéines avec un dosage d&#39;acide bicinchoninique 22 selon les instructions du fabricant. </li></ol> 2. Préparation de la toxine d&#39;émulsion et de coqueluche <ol><li> Émulsion <ol><li> Ajouter 40 mg de Mycobacterium tuberculosis H37Ra mort dans la chaleur dans 10 mL d&#39;adjuvant complet de Freund contenant 1 mg / mL de Mycobacterium tuberculosis H37Ra et bien mélanger. NOTE: L&#39;adjuvant final complet de Freund contient 5 mg / ml de Mycobacterium tuberculosis H37Ra. </li><li> Peser l&#39;ovalbumine, la dissoudre dans du PBS et préparer un mélange d&#39;antigènes contenant 2 mg / ml d&#39;ovalbumine et 10 mg / mL d&#39;extrait de glande lacrymale. Destiné à un volume d&#39;injection de 200 μl pour chaque animal, préparer un mélange maître bSur le nombre d&#39;animaux. </li><li> Transférer l&#39;adjuvant incomplet de Freund ou compléter l&#39;adjuvant de Freund à un tube de 50 ml, en veillant à ce que le volume d&#39;adjuvant au mélange d&#39;antigène soit en 1: 1. Ajouter le mélange d&#39;antigène par goutte à goutte à l&#39;adjuvant tout en vortexant avec la vitesse la plus élevée qui n&#39;entraîne pas de déversement. Continuer à tourbillonner pendant 5 minutes après l&#39;ajout de l&#39;antigène. </li><li> Transférer l&#39;émulsion dans une seringue de 5 ml et la relier à une autre seringue de 5 ml à travers un connecteur de seringue. Pousser l&#39;émulsion d&#39;une seringue à l&#39;autre pour la mélanger. REMARQUE: L&#39;émulsion est prête si une seule gouttelette reste comme une sphère lorsqu&#39;elle est placée dans l&#39;eau. Seuls des émulsions ou des emulsions fraîchement préparées stockées pendant une nuit à 4 ° C devraient être utilisées. </li></ol></li><li> La toxine de la coquille <ol><li> Reconstituer 50 μg de toxine pertussis dans 500 μl d&#39;eau pour obtenir une concentration finale de 100 ng / μL. Votez le conteneur pendant 30 s pour vous assurer que le tL&#39;oxine se dissout complètement. REMARQUE: Ne pas stériliser par filtration, car cela entraînera une perte de matériau. Ne gèle pas. Cette solution reste active pendant au moins 6 mois à 4 ° C. </li><li> Diluer 100 ng / μL de toxine coquelucheuse à 3 ng / μL en utilisant PBS. Transférer 100 μL de la toxine de la coqueluche diluée à une seringue d&#39;injection de 1 mL Luer-lock avec une aiguille de 27 G. </li></ol></li></ol> 3. Vaccination des Lewis Rats <ol><li> Le jour 0, mélangez l&#39;émulsion quelques fois. Distribuer 200 μL de l&#39;émulsion, qui contient 1 mg d&#39;extrait de glande lacrymale et 200 μg d&#39;ovalbumine dans l&#39;adjuvant complet de Freund, dans des seringues Luer-lock de 1 mL avec des aiguilles 27G. Injecter l&#39;émulsion par voie sous-cutanée à la base de la queue de rat sans anesthésie. REMARQUE: la queue n&#39;a pas besoin d&#39;être préchauffée avant l&#39;injection. Chaque rat est immunisé avec 1 mg d&#39;extrait de glande lacrymale et 200 μg d&#39;ovalbumine dans l&#39;adjuvant complet de FreundH 500 μg de Mycobacterium tuberculosis H37Ra. </li><li> Au jour 14, injectez 200 μL de l&#39;émulsion, qui contient 1 mg d&#39;extrait de glande lacrymale et 200 μg d&#39;ovalbumine dans l&#39;adjuvant incomplet de Freund, de la même manière que le jour 0. Injecter 300 ng de toxine coquelucheuse dans 100 μL de PBS par voie intrapéritonéale Par rat le même jour. </li></ol> 4. Injection du mélange d&#39;antigènes dans la sous-conjonctivite fornicale et la glande lacrymale pour recruter des cellules immunitaires spécifiques à l&#39;antigène et provoquer une inflammation locale <ol><li> Calculez la quantité d&#39;ovalbumine et d&#39;extrait de glande lacriminale en fonction du nombre de rats dans l&#39;expérience. Peser la quantité requise d&#39;ovalbumine et la combiner avec l&#39;extrait de glandes lacrymales décongelées préparé à l&#39;étape 1, en obtenant une solution d&#39;antigène contenant 1 mg / ml d&#39;ovalbumine et 1 mg / ml d&#39;extrait de glande lacrymale. </li><li> Anesthésier les rats avec de la kétamine (75 mg / kg) et de la xylazine (10 mg / kg) par injection intraperitoneale. Pincer le àDes rats pour s&#39;assurer qu&#39;une anesthésie adéquate a été atteinte ( c.-à-d., Aucun mouvement réactif n&#39;est observé après le pincement). Injecter 5 μL d&#39;antigène dans la sous-conjonctif de fornice de l&#39;oeil. Injecter 20 μL d&#39;antigène dans la glande lacrymale. </li></ol> 5. Évaluation des caractéristiques des yeux secs REMARQUE: Pour les étapes 5.1-5.3, les rats anesthésiés doivent être tenus doucement par une main gantée en position verticale sur une surface plane pour éviter tout mouvement. <ol><li> Mesurer le volume de déchirure avec du fil de phénol rouge. <ol><li> Utilisez une paire de pince pour maintenir le fil et une autre pour tirer la paupière inférieure du rat. Placez le fil au coin proximal du fornix inférieur pendant 1 min, puis retirez le fil. REMARQUE: Les larmes rendent la partie humide du fil rouge. </li><li> Prenez une image de la longueur de la partie mouillée du fil à côté d&#39;une règle avec des marques millimétriques. Mesurez la longueur mouillée jusqu&#39;au dixièmeFa millimètre à l&#39;aide d&#39;un logiciel d&#39;image ( p. Ex., ImageJ). </li></ol></li><li> Mesurer la douceur de la cornée / déchirure. <ol><li> Placez le rat sous un stéréomicroscope équipé d&#39;un illuminateur à anneau et d&#39;une caméra. Appliquer 5 μL de solution saline à la cornée du rat. Passive clignote en déplaçant les paupières supérieures et inférieures avec des doigts gantés ~ 5 fois pour répandre la solution saline. </li><li> Concentrez l&#39;illuminateur de sonnerie au milieu de la surface de la cornée sous un grossissement de 1,6x. Acquérir des images photographiques après 10 s. REMARQUE: L&#39;illuminateur d&#39;anneau projette deux lignes circulaires d&#39;images de points sur les cornées de l&#39;animal. L&#39;espacement régulier des points déformés suggère une couche de cornée / déchirure lisse. </li></ol></li><li> Mesurer les dommages à la cornée avec une coloration au fluorescéine. <ol><li> Ajouter 2 μl de fluorescéine à 0,2% à la cornée du rat. Ouvrez et fermez les paupières du rat 3 fois avec un doigt ganté pour étaler le colorant fluorescéine à la surface de l&#39;œil. </li><lI&gt; Après 1 min, dessinez 1 mL de solution saline avec une seringue de 3 mL (sans attache à l&#39;aiguille), positionnez la seringue à environ 2-3 mm avant la cornée et suivez doucement la solution saline sur l&#39;œil. </li><li> Acquérir des images sous le filtre bleu cobalt ( c&#39;est-à-dire ~ 400 nm) d&#39;un microscope d&#39;imagerie oculaire avec les lumières de fond éteintes. NOTE: Les images ont ensuite été analysées par un système de notation modifié par les publications précédentes 23 . Les images ont ensuite été analysées en classant subjectivement le nombre, la surface et l&#39;intensité des points verts de 0 à 2, où 0 indique leur absence, 1 indique une coloration ponctuelle de moins de 50 points et 2 indique une coloration ponctuelle de plus de 50 points. </li></ol></li><li> Éuthaniser les rats par injection intrapéritonéale de pentobarbital (80 mg / kg). Retirez les paupières supérieures et inférieures en utilisant des ciseaux. Réparez et prolapsez les globes oculaires en poussant vers le bas sur les tissus périoculaires avec des pinces. Libérez le globe en séparant tLes muscles extraoculaires, le nerf optique et la conjonctive du fornice. </li><li> Fixez la position du globe oculaire du rat avec la pince et ouvrez-le avec une incision circonférentielle le long de l&#39;équateur. Retirer l&#39;objectif et le vitreux. Mettez les globes oculaires disséqués dans des tubes de 1,5 mL sur de la glace. </li><li> Recueillir les glandes lacrymales, comme décrit à l&#39;étape 1.1. Transférer immédiatement les tissus dissimulés du globe oculaire et les glandes lacrymales au laboratoire pour préparer l&#39;analyse de cytométrie en flux. </li><li> Isoler les cellules immunitaires avec des méthodes de digestion par la collagénase et la dispase II 24 , 25 . Procédez à l&#39;utilisation de la cytométrie de flux pour analyser la sous-population des cellules T dans les tissus des yeux 26 . NOTE: Le panel d&#39;anticorps est: anti-CD45APC-Cyanine7 (OX-1), anti-CD3 BV421 (1F4), anti-CD4 PE-Cyanine7 (OX-35), anti-CD45RC Alexa647 (OX-22), anti- -CD62 PE (HRL1), anti-CD44 FITC (OX-50) et colorant cellulaire viabilité 7-AAD. Parmi les CD45 + CD3 <sup&gt; + 7AAD - population, naïve (CD3 + CD45RC + ), mémoire effectorale (T EM, CD3 + CD45RC - CD44 + CD62L - ) et mémoire centrale (T CM, CD3 + CD45RC - CD44 + CD62L + ) Les cellules T ont été fermées . </li></ol>

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Les auteurs n&#39;ont pas de conflit d&#39;intérêt. LT a reçu un financement et / ou des cadeaux antérieurs d&#39;Alcon, Allergan, Santen, Bausch et Lomb, Eyelens et Eyedetec.

Une étape cruciale de ce protocole est d&#39;assurer l&#39;homogénéité de l&#39;émulsion. Dans les émulsions bien préparées, les antigènes sont complètement enduits d&#39;huile, assurant la libération lente de l&#39;antigène injecté et la stimulation immunitaire continue. Une autre caractéristique critique de ce protocole est l&#39;utilisation de rats Lewis. Les rats Lewis sont plus sensibles au développement de la maladie auto-immune que d&#39;autres souches 27 . Ce protocole a été modifié à partir de deux protocoles précédemment publiés, soit soit l&#39;extrait de glande lacrymale seulement, soit le Klk1b22 recombinant 20 , 21 . Dans le protocole actuel, l&#39;antigène de la glande lacrymale et de l&#39;ovalbumine est utilisé comme antigène, et les cellules immunitaires spécifiques de l&#39;antigène sont attirées par la surface oculaire et la glande lacrymale, induisant des lésions tissulaires locales. L&#39;œil sec se développe lentement, atteignant ~ 85% par jour 48 après la vaccination initiale. Un défi antigénique à laL&#39;œil et la glande lacrymale au jour 48 exacerbe l&#39;oeil sec et assure sa chronicité au jour 70. Par rapport au Klk1b22 recombinant dans le modèle de DED induit par Klk, l&#39;extrait de glandes lacrymales et l&#39;ovalbumine utilisés dans le modèle actuel sont moins chers et plus faciles à obtenir. L&#39;extrait de la glande lacriminale contient également d&#39;autres protéines, à part Klk, qui peuvent induire une auto-immunité, donc cet extrait est théoriquement plus puissant que la méthode Klk pour induire le DED. Nous avons également essayé d&#39;immuniser des rats avec l&#39;extrait de glande lacrymale seulement; Bien que ces rats immunisés aient développé DED, il n&#39;y a pas eu d&#39;augmentation significative des lymphocytes T de mémoire effectorale dans les tissus des yeux en comparaison des témoins. La limitation de cette technique est qu&#39;il faut 70 jours pour atteindre le modèle. Les cellules T de mémoire Effector sont les principaux sous-ensembles de cellules T dans l&#39;œil normal de rat. Dans ce modèle, le DED auto-immune résulte en une augmentation des lymphocytes T de mémoire effectorale CD3 + dans le globe oculaire. Médicaments qui préfèrentSupprimer de manière efficace les cellules T de mémoire effectrice, telles que les inhibiteurs sélectifs du canal de potassium Kv1.3, peuvent donc avoir un avantage thérapeutique sur le DED 28 autoimmune.

La maladie des yeux secs (DED) est une maladie multifactorielle des larmes et de la surface oculaire qui entraîne des symptômes d&#39;inconfort, de troubles visuels et d&#39;instabilité du film lacrymal, ce qui peut endommager la surface oculaire. Elle s&#39;accompagne d&#39;une osmolarité accrue du film lacrymal et par une inflammation de la surface oculaire 1 . Les symptômes associés au DED sont brûlants, piquants, grinçants, sensation de corps étrangers, déchirements, fatigue oculaire et sécheresse 2 , 3 . Les deux principales causes de DED réduisent la production de larmes par la glande de sécrétion déchirante et l&#39;évaporation excessive du film lacrymal 4 . Chez les patients atteints de maladies auto-immunes, tels que le syndrome de Sjogren, le lupus érythémateux systémique et l&#39;atteinte immunitaire à la polyarthrite rhumatoïde aux glandes méibomiennes, réduit l&#39;expression des lipides essentiels à la stabilité à la déchirure. En outre, les dommages immunitaires à la surface oculaire diminuent la productivitéSur les mucines importantes pour la mouillabilité de la surface. Ensemble, ces processus provoquent cumulativement des œil secs chroniques 5 , 6 , 7 . Le remplacement des larmes et la thérapie anti-inflammatoire sont les piliers de la thérapie. Cependant, les traitements anti-inflammatoires actuels pour le DED ( c.-à-d. Les corticostéroïdes et la cyclosporine) sont globalement immunosuppressifs, entraînant des effets indésirables graves 8 , 9 , 10 . Il existe un modèle animal approprié pour tester de nouveaux agents immunomodulateurs pour traiter l&#39;œil sec auto-immuns. Des souris présentant des défauts génétiques spécifiques 11 , 12 , 13 , des souris dépourvues de gènes spécifiques 14 , 15 et des souris transgéniques surexprimant l&#39;immunorégulleLes gènes ory ont été utilisés comme modèles d&#39;oeil sec autoimmune 16 , 17 . Des modèles animaux autoimmunes induits par un antigène ont également été rapportés chez des souris 18 , des lapins 19 et des rats 20 , 21 . Ici, nous décrivons un modèle induit par l&#39;antigène de l&#39;œil sec auto-immune chronique. Ce modèle est une modification de deux modèles antérieurs; Un utilisé des extraits de glandes lacrymales, et le second a utilisé un autoantigène ( c&#39;est-à-dire klk1b22) des glandes lacrymogènes 20 , 21 . La maladie a été induite par la vaccination sous-cutanée de rats Lewis Lewis de 6 à 8 semaines avec ovalbumine, complétent l&#39;adjuvant de Freund et une émulsion contenant des extraits de glandes lacrymales de rats Sprague-Dawley ( figure 1 ). Une deuxième immunisation avec le même antigène dans l&#39;adjuvant incomplet de Freund étaitAdministré deux semaines plus tard. Pour recruter des cellules immunitaires spécifiques de l&#39;antigène à la glande lacrymale et à la surface oculaire, un mélange d&#39;extrait de glande lacrymale et d&#39;ovalbumine (1 mg / mL) a été injecté dans la sous-conjonctivite de fornice et les glandes lacrymales à la 6ème à la 7ème semaine ( figure 1 ). Plus de 85% des rats ont développé des caractéristiques de l&#39;oeil sec 70 jours après la première vaccination. Ces caractéristiques comprennent une réduction de la production de larmes ( figure 2 ), une coloration fluorescente accrue de la cornée ( figure 3 ) et une diminution de la stabilité à la déchirure ( figure 4 ). Le profil immunitaire des cellules T dans les globes oculaires des rats normaux par cytométrie de flux révèle une prépondérance de cellules T de mémoire efflective CD3 + ( Figures 5 et 6 ). Les rats avec DED autoimmune montrent une augmentation des cellules T de mémoire effectorale CD3 + et des diminutions correspondantes dans les cellules T de mémoire centrale naïve et centrale ( Figure 6 </stroNg&gt;).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="995">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">Reagents</td>
			<td style="width:300px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">Protease inhibitor cocktail</td>
			<td style="width:300px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">P2714-1BTL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td style="width:300px;">Thermal Scientific</td>
			<td style="width:143px;">23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">Mycobacterium tuberculosis H37Ra&#160;</td>
			<td style="width:300px;">Becton, Dickinson and company</td>
			<td style="width:143px;">231141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">complete Freund&#39;s adjuvant</td>
			<td style="width:300px;">Becton, Dickinson and company</td>
			<td style="width:143px;">231131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">ovalbumin</td>
			<td style="width:300px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">A5503-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">incomplete Freund&#39;s adjuvant&#160;</td>
			<td style="width:300px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">F5506-6X10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">pertussis toxin&#160;</td>
			<td style="width:300px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">P7208-50UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">fluorescein sodium solution</td>
			<td style="width:300px;">Bausch &#38; Lomb U.K Limited</td>
			<td style="width:143px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">Name</td>
			<td style="width:300px;">Company</td>
			<td style="width:143px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">Equipment</td>
			<td style="width:300px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">Sonicator</td>
			<td>Sonics&#160;</td>
			<td>Vibra-Cell</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">phenol red thread</td>
			<td>Tianjin Jingming New Technological development Co. LTD.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:387px;">Stereo microscope with ring light illuminator and camera</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">Micro IV microscope&#160;</td>
			<td style="width:300px;">Phoenix Research Labs</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a chronic autoimmune dry eye rat model with increase in effector memory t cells in eyeball tissue

La maladie des yeux secs est une maladie très fréquente qui cause la morbidité et le fardeau des soins de santé et diminue la qualité de vie. Il existe un besoin d&#39;un modèle d&#39;oeil sec approprié pour tester de nouveaux agents thérapeutiques pour traiter les conditions de l&#39;œil sec autoimmune. Ce protocole décrit un modèle chronique autoimmune de l&#39;œil sec. Les rats Lewis ont été immunisés avec une émulsion contenant de l&#39;extrait de glandes lacrymales, de l&#39;ovalbumine et complètent l&#39;adjuvant de Freund. Une deuxième immunisation avec les mêmes antigènes dans l&#39;adjuvant incomplet de Freund a été administrée deux semaines plus tard. Ces immunisations ont été administrées par voie sous-cutanée à la base de la queue. Pour stimuler la réponse immunitaire à la surface oculaire et les glandes lacrymales, l&#39;extrait de glande lacrymale et l&#39;ovalbumine ont été injectés dans la sous-conjonctivite et les glandes lacrymales du paquetage 6 semaines après la première immunisation. Les rats ont développé des caractéristiques de l&#39;oeil sec, y compris une réduction de la production de larmes, une diminution de la stabilité à la déchirure et une augmentation des dommages causés par la cornée. Immune proLe dépôt par cytométrie de flux a montré une prépondérance des cellules T de mémoire effédiante CD3 + dans le globe oculaire.

La figure 1 illustre la conception de l&#39;expérience. Le jour 48 et le jour 70, les caractéristiques cliniques des yeux secs sont évaluées chez les rats immunisés. Le volume de la larme est représenté par la longueur de la partie humide du fil de phénol rouge. La figure 2 montre des images représentatives de fils de phénol rouge à partir de rats de contrôle et DED. La longueur des fils de phénol rouge dans le groupe DED est plus courte que le groupe témoin, ce qui indique moins de volume de larmes. La fluorescéine se lie à l&#39;épithélium cornéen endommagé. Ainsi, les dommages cornéens sont mesurés par la coloration de la fluorescéine cornéenne. Les taches de fluorescéine sur la surface cornéenne des rats DED ont été classées de 0 à 2 et comparées aux rats témoins. Les rats avec DED ont plus de coloration à la fluorescéine que les rats témoins ( figure 3 ), ce qui suggère des dommages à la cornée. La douceur de la cornéeChez le DED et les rats témoins a été évalué par l&#39;illuminateur à anneau. Si la surface de la cornée est lisse, avec une grande stabilité à la déchirure, l&#39;image de l&#39;anneau d&#39;éclairage sur la surface oculaire est ronde et parfaite. La distorsion de l&#39;image indique une douceur cornéenne réduite et un film lacrymal instable. Le degré de distorsion de l&#39;anneau a été classé de 0 à 2. Un niveau de distorsion de l&#39;anneau plus élevé a été noté dans le groupe DED ( Figure 4 ), ce qui indique moins de stabilité à la déchirure. Les rats sont définis comme ayant un œil sec lorsque au moins deux caractéristiques cliniques de l&#39;œil sec sont anormales. Parmi les 24 rats immunisés, 21 rats ont développé DED au jour 48. Les résultats étaient cohérents lorsqu&#39;ils étaient évalués le jour 70. L&#39;analyse par cytométrie de flux montre que le sous-ensemble de cellules T prédominant dans les tissus de globe visuel normal de rat est une cellule T de mémoire effectrice ( figure 5 ). Dans les globes oculaires des rats DED, ~ 70% du CD3+ Les cellules T sont des cellules T de mémoire effectrice, tandis que chez les rats témoins, ce nombre est de ~ 50%. Les globes oculaires des rats DED ont des cellules T de mémoire effectrice significativement plus élevées que celles des rats témoins ( figure 6 ). <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/55592/55592fig1.jpg" /> Figure 1: schéma de la conception expérimentale. LG: glande lacrymale; DED: maladie des yeux secs; CFA: complète l&#39;adjuvant de Freund; IFA: adjuvant incomplet de Freund. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55592/55592fig1large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a> <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/55592/55592fig2.jpg" /> Figure 2: Filetage rouge Phenol Mesure le volume de déchirure. Le fil rouge du phénol est placé au coin proximal des deux yeux du rat pendant 1 min et est ensuite retiré. ReprésentantLes images du fil rouge phénol, avec une règle, des groupes témoins et DED sont représentées. ImageJ a été utilisé pour mesurer la longueur de la partie humide des fils de phénol rouge. Barre d&#39;échelle = 1 mm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55592/55592fig2large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a> <img alt="figure 3" src="/files/ftp_upload/55592/55592fig3.jpg" /> Figure 3: Images représentatives du dommage épithélial cornéen mesuré par coloration à la fluorescéine. Chaque cornée de rat a été colorée avec 0,2% de fluorescéine pendant 1 min et rincée avec au moins 1 ml de solution saline. Les images ont été prises sous un microscope à imagerie oculaire avec de la lumière bleu cobalt. La première colonne montre les images représentatives des cornées de contrôle. La deuxième colonne contient des images représentatives de coloration cornéenne à partir de rats avec des caractéristiques DED. Les points fluorescents verts indiquent l&#39;épithélium cornéen<html> L dommage. Toutes les images ont été produites sur la même échelle de couleurs. La quantification de la coloration à la fluorescéine a été effectuée en fonction de la superficie et de la densité des taches vertes. Barre d&#39;échelle = 1 mm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55592/55592fig3large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a> <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/55592/55592fig4.jpg" /> Figure 4: Images représentatives de la cornée montrant la réflexion de l&#39;illuminateur de l&#39;anneau. Le lissage de la cornée et de la lombaire a été mesuré par un illuminateur à anneau. Le degré de distorsion de l&#39;anneau dans les images capturées est une mesure de la stabilité relative de la déchirure. La colonne de gauche montre les images représentatives dans les animaux témoins, et la colonne de droite montre des images représentatives après l&#39;induction de l&#39;oeil sec. Barre d&#39;échelle = 1 mm.Ank &quot;&gt; Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/55592/55592fig5.jpg" /> Figure 5: Plots de points dérivés de l&#39;analyse de cytométrie de flux. Les cellules T isolées des tissus des yeux ont été colorées avec un panel d&#39;anticorps. Dans la population CD45 + CD3 + 7AAD, les cellules CD3 + 7-AAD - T ont été fermées. Parmi les cellules CD3 + 7-AAD - T, on a déterminé les populations de cellules T naïfs, de mémoire centrale et de mémoire effectorale. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55592/55592fig5large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a> <img alt="Figure 6" src="/files/ftp_upload/55592/55592fig6.jpg" /> Figure 6: Profil de sous-population de cellules T dans les globes oculaires. CD3 + CD45RC+ Lymphocytes T naïfs, CD3 + CD45RC - CD44 + CD62L - cellules T de mémoire effectorale et CD3 + CD45RC - CD44 + CD62L + cellules de mémoire centrale T (T CM ) sont présentées comme le pourcentage de cellules T CD3 + . Les résultats proviennent de 3 rats témoins et de 6 DAD. Des résultats similaires ont été obtenus à partir de l&#39;analyse des lymphocytes T à partir de glandes lacrymogènes isolées (données non présentées). Le test t du Student non accompagné a été utilisé pour la comparaison statistique. Les barres d&#39;erreur représentent le SD. * P &lt;0,05, ** p &lt;0,01. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55592/55592fig6large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Chronic Autoimmune Dry Eye Rat Model with Increase in Effector Memory T Cells in Eyeball Tissue at JoVE.com

A Chronic Autoimmune Dry Eye Rat Model with Increase in Effector Memory T Cells in Eyeball Tissue

Ce rapport décrit une méthode pour induire un œil sec autoimmune expérimental chronique chez des rats Lewis par immunisation avec une émulsion d&#39;extrait de glande lacrymale de rat, ovalbumine et adjuvant complet de Freund, suivie de l&#39;injection d&#39;extrait de glandes lacrymales et d&#39;ovalbumine dans la sous-conjonctif et les glandes lacrymales Six semaines plus tard.

Un modèle chronique auto-immune de rat à oeil sec avec augmentation de la cellule Effect Memory T dans le tissu Eyeball

Dry eye disease is a very common condition that causes morbidity and healthcare burden and decreases the quality of life. There is a need for a suitable ...

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Application de long terme de culture interféron-γ-enzymatique immunospot Essai d&#39;évaluation de mémoires et effectrices réponses des cellules T chez les bovins

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