Name: a chronic autoimmune dry eye rat model with increase in effector memory t cells in eyeball tissue
Uploaded: 2017-06-07T13:00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Chronic Autoimmune Dry Eye Rat Model with Increase in Effector Memory T Cells in Eyeball Tissue at JoVE.com

Авторы хотели бы поблагодарить г-жу Тин Мин Ци и д-ра Велухами Амутха Барати и ее команду за помощь в обращении с животными. Эта работа была поддержана NHIC-I2D-1409007, Фондом SingHealth SHF / FG586P / 2014 и NMRC / CSA / 045/2012.

Животных обрабатывали в соответствии с институциональными руководящими принципами и Заявление ARVO по использованию животных в исследованиях на фоне офтальмологии и зрения. Протокол исследования был одобрен Комитетом по охране здоровья и использованию животных SingHealth. 1. Получение экстракта слезной железы ПРИМЕЧАНИЕ. Крысам анестезировали внутрибрюшинную инъекцию кетамина (75 мг / кг) и ксилазина (10 мг / кг). Правильная анестезия была подтверждена защемлением пальцев стопы и защемлением хвоста. Офтальмологический гель наносят на глаза крысы, чтобы предотвратить сухость после каждой процедуры. Анестезированных крыс помещали под дальние инфракрасные лучи, чтобы животные не нагревались до полного выздоровления. В ходе процедур и времени восстановления животных тщательно контролировали исследователи. Перед использованием все материалы и хирургические инструменты были стерильными. В конце эксперимента крыс подвергали эвтаназии путем внутрибрюшинной инъекции пентобарбитала (80 мг / кг).Полная эвтаназия была подтверждена отсутствием сердечного импульса и не мигающим рефлексом, касаясь глазного яблока. Крыс размещали в стандартных условиях: при комнатной температуре, 21-23 ° C; Относительная влажность, 30-70%; Светло-темного цикла, чередуя 12 ч (с 7 до 7 часов). <ol><li> Поместите усыпленных самцов крыс Sprague-Dawley (возраст от 8 недель до 16 недель) плоской, с одним ухом на столе, а другой вверх. Сделайте 10-миллиметровый разрез выше-ниже под открытым ухом с парой пружинных ножниц. Удалите слезную железу, рассекая ее от окружающей соединительной ткани и от дренажного канала. <ol><li> Хранить сальники при -80 ° C до тех пор, пока не потребуется. Оттепель желез на льду. Mince как можно точнее на льду с ножницами. Добавить 150 мкл PBS с 1x ингибитором протеазы на слезной железе. </li></ol></li><li> Сонатируйте образцы на льду в течение 5 минут при 20 кГц с помощью установщика звука, установленного через 10 с, 10 с при 30% амплитуде. Центрифуга с сыномВ течение 20 мин при 13000 мкг и 4 ° С. </li><li> Внесите супернатант и перенесите его в новую пробирку. Выровняйте супернатант в 1,5 мл пробирки и храните их при -80 ° C. Измерьте концентрацию белка с помощью анализа бицинхониновой кислоты 22 в соответствии с инструкциями производителя. </li></ol> 2. Получение эмульсии и токсина коклюша <ol><li> эмульсионный <ol><li> Добавьте 40 мг убитого с высокой температурой Mycobacterium tuberculosis H37Ra в 10 мл полного адъюванта Фрейнда, содержащего 1 мг / мл Mycobacterium tuberculosis H37Ra, и хорошо перемешайте . ПРИМЕЧАНИЕ. Окончательный полный адъювант Фрейнда содержит 5 мг / мл Mycobacterium tuberculosis H37Ra. </li><li> Взвесьте овальбумин, растворите его в PBS и подготовьте смесь антигенов, содержащую 2 мг / мл овальбумина и 10 мг / мл экстракта слезной железы. Для достижения объема инъекции 200 мкл для каждого животного, подготовьте основную смесь bКак указано на животных. </li><li> Перенесите неполный адъювант Фрейнда или полный адъювант Фрейнда в трубку объемом 50 мл, гарантируя, что объем адъюванта антигенной смеси находится в соотношении 1: 1. Добавьте смесь антигена по капле в адъювант, в то время как вортексы с максимальной скоростью, что не приводит к утечке. Продолжайте встряхивание в течение 5 минут после того, как был добавлен антиген. </li><li> Перенесите эмульсию в 5 мл шприц и свяжите ее с другим 5-мл шприцем через шприцевой соединитель. Надавите эмульсию от одного шприца к другому, чтобы смешать его. ПРИМЕЧАНИЕ. Эмульсия готова, если одна капля остается в виде шара при помещении в воду. Следует использовать только свежеприготовленную эмульсию или эмульсию, хранящуюся в течение ночи при температуре 4 ° C. </li></ol></li><li> Коклюшный токсин <ol><li> Восстановите 50 мкг коклюшного токсина в 500 мкл воды, чтобы получить конечную концентрацию 100 нг / мкл. Votex контейнер в течение 30 с, чтобы убедиться, что tОксин полностью растворяется. ПРИМЕЧАНИЕ. Не стерилизуйте фильтрованием, так как это приведет к потере материала. Не замораживать. Этот раствор остается активным в течение не менее 6 месяцев при 4 ° C. </li><li> Разбавьте 100 нг / мкл коклюшного токсина до 3 нг / мкл, используя PBS. Передайте 100 мкл разбавленного коклюшного токсина в 1 мл инъекционный шприц Luer-lock с иглой 27 G. </li></ol></li></ol> 3. Иммунизация крыс Льюиса <ol><li> В день 0 смешайте эмульсию несколько раз. Распределите 200 мкл эмульсии, которая содержит 1 мг экстракта слезной железы и 200 мкг овальбумина в полном адъюванте Фрейнда, в 1-мл шприцы Luer-lock с 27G иглами. Внедрить эмульсию подкожно у основания хвостов крысы без анестезии. ПРИМЕЧАНИЕ: Перед инъекцией хвост не нужно предварительно нагревать. Каждая крыса иммунизирована 1 мг экстракта слезной железы и 200 мкг овальбумина в полном адъюванте ФрейндаH 500 мкг Mycobacterium tuberculosis H37Ra. </li><li> На 14-й день вводите 200 мкл эмульсии, которая содержит 1 мг экстракта слезной железы и 200 мкг овальбумина в неполном адъюванте Фрейнда, таким же образом, как и на день 0. Внесите 300 нг коклюшного токсина в 100 мкл PBS внутрибрюшинно На крысу в тот же день. </li></ol> 4. Инъекция антигенной смеси в суставную сублицензию и слезную слюну для приема антигенспецифических иммунных клеток и причиной локального воспаления <ol><li> Вычислите количество экстракта овальбумина и слезной железы, исходя из количества крыс в эксперименте. Взвесьте необходимое количество овальбумина и объедините его с экстрактом размороженной слезной железы, приготовленной на стадии 1, с получением раствора антигена, содержащего 1 мг / мл овальбумина и 1 мг / мл экстракта слезной железы. </li><li> Анестезируйте крыс с помощью кетамина (75 мг / кг) и ксилазина (10 мг / кг) путем внутрибрюшинной инъекции. ЗажмитеДля обеспечения правильной анестезии ( т. Е. После пинча не наблюдается реагирующего движения). Внесите 5 мкл антигена в суставную субконъюнкцию глаза. Внесите 20 мкл антигена в слезные железы. </li></ol> 5. Оценка свойств сухого глаза ПРИМЕЧАНИЕ. Для этапов 5.1-5.3 анестезированные крысы следует держать осторожно перчаткой в ​​вертикальном положении на ровной поверхности, чтобы избежать движения. <ol><li> Измерьте объем разрыва с помощью фенольной красной нити. <ol><li> Используйте одну пару щипцов, чтобы удерживать нить, а другую, чтобы потянуть нижнее веко крысы. Поместите нить в проксимальный угол нижнего винта в течение 1 минуты, а затем удалите нить. ПРИМЕЧАНИЕ. Слезы делают смазанную часть нити красной по цвету. </li><li> Возьмите изображение длины смачиваемой части нити рядом с линейкой с миллиметровой маркировкой. Измерьте смоченную длину до десятой oFa миллиметр с помощью программного обеспечения изображения ( например, ImageJ). </li></ol></li><li> Измерьте гладкость роговицы / слез. <ol><li> Поместите крысу под стереомикроскоп, снабженный кольцевым осветителем и камерой. Нанесите 5 мкл физиологического раствора на роговицу крысы. Пассивно мигайте, перемещая верхние и нижние веки пальцами в перчатках ~ 5 раз, чтобы распространить физиологический раствор. </li><li> Сосредоточьте кольцевую подсветку на середине поверхности роговицы под 1,6-кратным увеличением. Приобретайте фотографические изображения через 10 секунд. ПРИМЕЧАНИЕ. Кольцевая иллюминация представляет два круглых ряда точечных изображений на роговицах животного. Регулярное расстояние неискаженных точек указывает на гладкий слой роговицы / разрыва. </li></ol></li><li> Измерьте повреждение роговицы флуоресцеиновым окрашиванием. <ol><li> Добавьте 2 мкл 0,2% флуоресцеина в роговицу крысы. Пассивно открывайте и закрывайте веки крыс 3 раза пальцем в перчатках, чтобы распространить флуоресцеиновый краситель на поверхность глаза. </li><lI&gt; Через 1 мин нанести 1 мл солевого раствора с 3 мл шприцем (без прикрепления иглы), поместить шприц около 2-3 мм перед роговицей и осторожно проталкивать физиологический раствор на глаз. </li><li> Приобретайте изображения под фильтром кобальтового синего ( т.е. около 400 нм) окулярно-образного микроскопа с выключенными фоновой подсветкой. ПРИМЕЧАНИЕ. Изображения впоследствии анализировались с помощью системы классификации, измененной из предыдущих публикаций 23 . Затем изображения анализировали путем субъективной оценки количества, площади и интенсивности зеленых пятен от 0 до 2, где 0 указывает их отсутствие, 1 указывает на точечное окрашивание менее 50 пятен, а 2 указывает на точечное окрашивание более 50 пятен. </li></ol></li><li> Эвтаназию крыс через внутрибрюшинную инъекцию пентобарбитала (80 мг / кг). Удалите верхние и нижние веки с помощью ножниц. Исправить и пролапс глазных яблок, нажав на периокулярные ткани с помощью щипцов. Освободите земной шар, разорвав tОн экстраокулярные мышцы, зрительный нерв и суставная конъюнктива. </li><li> Закрепите положение глазного яблока с помощью щипцов и откройте его круговым разрезом вдоль экватора. Удалите объектив и стекловидное тело. Поместите расчлененные глазные яблоки в 1,5 мл пробирки на лед. </li><li> Соберите слезные железы, как описано в шаге 1.1. Немедленно переносите расчлененные ткани глазного яблока и слезные железы в лабораторию для подготовки к анализу проточной цитометрии. </li><li> Изолируют иммунные клетки с коллагеназой и дезактивируют методы переваривания II 24 , 25 . Приступить к использованию проточной цитометрии для профилирования субпопуляции Т-клеток в тканях глазного яблока 26 . ПРИМЕЧАНИЕ. Панель антител: анти-CD45APC-цианин7 (OX-1), анти-CD3 BV421 (1F4), анти-CD4-PE-цианин7 (OX-35), анти-CD45RC Alexa647 (OX-22), анти-CD4 -CD62 PE (HRL1), анти-CD44 FITC (OX-50) и жизнеспособный клеточный краситель 7-AAD. Среди CD45 + CD3 <sup&gt; + 7AAD - население, наивное (CD3 + CD45RC + ), эффекторная память (T EM, CD3 + CD45RC - CD44 + CD62L - ), а центральная память (T CM, CD3 + CD45RC - CD44 + CD62L + ) T-клетки были закрыты , </li></ol>

<ol>
	<li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+definition+and+classification+of+dry+eye+disease:+report+of+the+Definition+and+Classification+Subcommittee+of+the+International+Dry+Eye+WorkShop+(2007).">The definition and classification of dry eye disease: report of the Definition and Classification Subcommittee of the International Dry Eye WorkShop (2007).</a> Ocul Surf. 5 (2), 75-92 (2007).</li><li>Gayton, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Etiology,+prevalence,+and+treatment+of+dry+eye+disease.">Etiology, prevalence, and treatment of dry eye disease.</a> Clin Ophthalmol. 3, 405-412 (2009).</li><li>Tong, L., Tan, J., Thumboo, J., Seow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dry+eye.">The dry eye.</a> Praxis (Bern 1994). 102 (13), 803-805 (2013).</li><li>Messmer, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathophysiology,+diagnosis,+and+treatment+of+dry+eye+disease.">The pathophysiology, diagnosis, and treatment of dry eye disease.</a> Dtsch Arztebl Int. 112 (5), 71-81 (2015).</li><li>Liu, K. C., Huynh, K., Grubbs, J., Davis, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoimmunity+in+the+pathogenesis+and+treatment+of+keratoconjunctivitis+sicca.">Autoimmunity in the pathogenesis and treatment of keratoconjunctivitis sicca.</a> Curr Allergy Asthma Rep. 14 (1), 403 (2014).</li><li>Stevenson, W., Chauhan, S. K., Dana, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dry+eye+disease:+an+immune-mediated+ocular+surface+disorder.">Dry eye disease: an immune-mediated ocular surface disorder.</a> Arch Ophthalmol. 130 (1), 90-100 (2012).</li><li>Tong, L., Thumboo, J., Tan, Y. K., Wong, T. Y., Albani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+eye:+a+window+of+opportunity+in+rheumatoid+arthritis.">The eye: a window of opportunity in rheumatoid arthritis.</a> Nat Rev Rheumatol. 10 (9), 552-560 (2014).</li><li>Carnahan, M. C., Goldstein, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ocular+complications+of+topical,+peri-ocular,+and+systemic+corticosteroids.">Ocular complications of topical, peri-ocular, and systemic corticosteroids.</a> Curr Opin Ophthalmol. 11 (6), 478-483 (2000).</li><li>Johannsdottir, S., Jansook, P., Stefansson, E., Loftsson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+cyclodextrin-based+aqueous+cyclosporin+A+eye+drop+formulations.">Development of a cyclodextrin-based aqueous cyclosporin A eye drop formulations.</a> Int J Pharm. 493 (1-2), 86-95 (2015).</li><li>Prabhasawat, P., Tesavibul, N., Karnchanachetanee, C., Kasemson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+cyclosporine+0.05%+eye+drops+in+Stevens+Johnson+syndrome+with+chronic+dry+eye.">Efficacy of cyclosporine 0.05% eye drops in Stevens Johnson syndrome with chronic dry eye.</a> J Ocul Pharmacol Ther. 29 (3), 372-377 (2013).</li><li>Ishimaru, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Severe+destructive+autoimmune+lesions+with+aging+in+murine+Sjogren's+syndrome+through+Fas-mediated+apoptosis.">Severe destructive autoimmune lesions with aging in murine Sjogren's syndrome through Fas-mediated apoptosis.</a> Am J Pathol. 156 (5), 1557-1564 (2000).</li><li>Jonsson, R., Tarkowski, A., Backman, K., Holmdahl, R., Klareskog, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sialadenitis+in+the+MRL-l+mouse:+morphological+and+immunohistochemical+characterization+of+resident+and+infiltrating+cells.">Sialadenitis in the MRL-l mouse: morphological and immunohistochemical characterization of resident and infiltrating cells.</a> Immunology. 60 (4), 611-616 (1987).</li><li>Jonsson, R., Tarkowski, A., Backman, K., Klareskog, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+characterization+of+sialadenitis+in+NZB+X+NZW+F1+mice.">Immunohistochemical characterization of sialadenitis in NZB X NZW F1 mice.</a> Clin Immunol Immunopathol. 42 (1), 93-101 (1987).</li><li>Li, H., Dai, M., Zhuang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+T+cell+intrinsic+role+of+Id3+in+a+mouse+model+for+primary+Sjogren's+syndrome.">A T cell intrinsic role of Id3 in a mouse model for primary Sjogren's syndrome.</a> Immunity. 21 (4), 551-560 (2004).</li><li>Shull, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+disruption+of+the+mouse+transforming+growth+factor-beta+1+gene+results+in+multifocal+inflammatory+disease.">Targeted disruption of the mouse transforming growth factor-beta 1 gene results in multifocal inflammatory disease.</a> Nature. 359 (6397), 693-699 (1992).</li><li>Green, J. E., Hinrichs, S. H., Vogel, J., Jay, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exocrinopathy+resembling+Sjogren's+syndrome+in+HTLV-1+tax+transgenic+mice.">Exocrinopathy resembling Sjogren's syndrome in HTLV-1 tax transgenic mice.</a> Nature. 341 (6237), 72-74 (1989).</li><li>Shen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+autoimmunity+in+IL-14alpha-transgenic+mice.">Development of autoimmunity in IL-14alpha-transgenic mice.</a> J Immunol. 177 (8), 5676-5686 (2006).</li><li>Hayashi, Y., Hirokawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunopathology+of+experimental+autoallergic+sialadenitis+in+C3H/He+mice.">Immunopathology of experimental autoallergic sialadenitis in C3H/He mice.</a> Clin Exp Immunol. 75 (3), 471-476 (1989).</li><li>Liu, S. H., Zhou, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+autoimmune+dacryoadenitis:+purification+and+characterization+of+a+lacrimal+gland+antigen.">Experimental autoimmune dacryoadenitis: purification and characterization of a lacrimal gland antigen.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 33 (6), 2029-2036 (1992).</li><li>Liu, S. H., Prendergast, R. A., Silverstein, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+autoimmune+dacryoadenitis.+I.+Lacrimal+gland+disease+in+the+rat.">Experimental autoimmune dacryoadenitis. I. Lacrimal gland disease in the rat.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 28 (2), 270-275 (1987).</li><li>Jiang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+model+of+experimental+autoimmune+keratoconjunctivitis+sicca+(KCS)+induced+in+Lewis+rat+by+the+autoantigen+Klk1b22.">A new model of experimental autoimmune keratoconjunctivitis sicca (KCS) induced in Lewis rat by the autoantigen Klk1b22.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 50 (5), 2245-2254 (2009).</li><li>Walker, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bicinchoninic+acid+(BCA)+assay+for+protein+quantitation.">The bicinchoninic acid (BCA) assay for protein quantitation.</a> Methods Mol Biol. 32, 5-8 (1994).</li><li>Lin, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+dry+eye+model+induced+by+topical+administration+of+benzalkonium+chloride.">A mouse dry eye model induced by topical administration of benzalkonium chloride.</a> Mol Vis. 17, 257-264 (2011).</li><li>Cousins, S. W., Streilein, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+detection+of+lymphocyte+proliferation+in+eyes+with+immunogenic+inflammation.">Flow cytometric detection of lymphocyte proliferation in eyes with immunogenic inflammation.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 31 (10), 2111-2122 (1990).</li><li>Yawata, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+change+in+natural+killer+cell+type+in+the+human+ocular+mucosa+in+situ+as+means+of+immune+evasion+by+adenovirus+infection.">Dynamic change in natural killer cell type in the human ocular mucosa in situ as means of immune evasion by adenovirus infection.</a> Mucosal Immunol. 9 (1), 159-170 (2016).</li><li>Chen, Y., Chauhan, S. K., Lee, H. S., Saban, D. R., Dana, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+dry+eye+disease+is+principally+mediated+by+effector+memory+Th17+cells.">Chronic dry eye disease is principally mediated by effector memory Th17 cells.</a> Mucosal Immunol. 7 (1), 38-45 (2014).</li><li>Goldmuntz, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+of+the+autoimmune+disease-resistant+LER+rat:+an+outcross+between+the+buffalo+and+autoimmune+disease-prone+Lewis+inbred+rat+strains.">The origin of the autoimmune disease-resistant LER rat: an outcross between the buffalo and autoimmune disease-prone Lewis inbred rat strains.</a> J Neuroimmunol. 44 (2), 215-219 (1993).</li><li>Cahalan, M. D., Chandy, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functional+network+of+ion+channels+in+T+lymphocytes.">The functional network of ion channels in T lymphocytes.</a> Immunol Rev. 231 (1), 59-87 (2009).</li></ol>

У авторов нет конфликта интересов. LT получил предварительное финансирование и / или подарки от Alcon, Allergan, Santen, Bausch и Lomb, Eyelens и Eyedetec.

Критическим этапом этого протокола является обеспечение однородности эмульсии. В хорошо подготовленных эмульсиях антигены полностью покрыты маслом, что обеспечивает медленное высвобождение введенного антигена и непрерывную иммунную стимуляцию. Еще одной важной особенностью этого протокола является использование крыс Льюиса. Крысы Льюиса более чувствительны к развитию аутоиммунного заболевания, чем другие штаммы 27 . Этот протокол был модифицирован из двух ранее опубликованных протоколов, в которых либо использовался только экстракт слезной железы, либо рекомбинантный Klk1b22 20 , 21 . В текущем протоколе в качестве антигена используется экстракт овальбумина плюс слезной железы, а антигенспецифические иммунные клетки притягиваются к поверхности глаза и слезной железе, вызывая местное повреждение тканей. Сухой глаз развивается медленно, достигая ~ 85% днем ​​48 после первоначальной иммунизации. Антигенный вызовГлаза и слезные железы на 48-й день усугубляют сухость глаз и обеспечивают его хроничность до 70-го дня. По сравнению с рекомбинантным Klk1b22 в модели DED, индуцированной Klk, экстракт слезной железы и овальбумин, используемый в текущей модели, дешевле и легче получить. Экстракт слезной железы также содержит другие белки, помимо Klk, которые могут вызывать аутоиммунитет, поэтому этот экстракт теоретически более эффективен, чем метод Klk при индуцировании DED. Мы также пробовали иммунизировать крыс только с помощью слезной железы; Хотя эти иммунизированные крысы развивали DED, не было значительного увеличения Т-клеток с эффекторной памятью в тканях глазного яблока по сравнению с контрольными. Ограничение этого метода заключается в том, что для достижения этой модели требуется 70 дней. Т-клетки с эффекторной памятью являются основными подмножествами Т-клеток в нормальном глазе крысы. В этой модели аутоиммунный DED приводит к увеличению Т-клеток с эффекторной памятью CD3 + в глазном яблоке. Наркотики, которыеВозможно, подавляют эффекторную память Т-клетки, такие как селективные ингибиторы калиевого канала Kv1.3, поэтому могут иметь терапевтическое преимущество при аутоиммунном DED 28 .

Болезнь сухого глаза (DED) представляет собой многофакторное заболевание слез и глазной поверхности, что приводит к симптомам дискомфорта, нарушению зрения и нестабильности слезной пленки, что может привести к повреждению глазной поверхности. Он сопровождается повышенной осмолярностью слезной пленки и воспалением глазной поверхности 1 . Симптомы, связанные с DED, сжигаются, жалят, едят, ощущают инородное тело, разрывают, окулярную усталость и сухость 2 , 3 . Двумя основными причинами DED являются снижение продукции разрыва в слезной секреторной железе и чрезмерное испарение слезной пленки 4 . У пациентов с аутоиммунными заболеваниями, такими как синдром Шегрена, системная красная волчанка и ревматоидный артрит, иммунные повреждения мейбомановых желез уменьшают экспрессию липидов, необходимых для стабильности разрыва. Кроме того, иммунный ущерб поверхности глаза уменьшаетНа муцинах, важных для поверхностной смачиваемости. Вместе эти процессы кумулятивно вызывают хронический сухой глаз 5 , 6 , 7 . Задержка замены и противовоспалительная терапия являются основой терапии. Однако современные противовоспалительные терапии DED ( т.е. кортикостероиды и циклоспорин) широко иммуносупрессивные, что приводит к серьезным побочным эффектам 8 , 9 , 10 . Существует потребность в подходящей модели для животных для тестирования новых иммуномодулирующих средств для лечения аутоиммунного сухого глаза. Мыши с определенными генетическими дефектами 11 , 12 , 13 , мыши, лишенные специфических генов 14 , 15 , и трансгенные мыши, сверхэкспрессирующие иммунорегулатГены ory использовались в качестве моделей аутоиммунного сухого глаза 16 , 17 . Аномально-индуцированные аутоиммунные модели животных также были зарегистрированы у мышей 18 , кроликов 19 и крыс 20 , 21 . Здесь мы описываем антиген-индуцированную модель хронического аутоиммунного сухого глаза. Эта модель является модификацией двух более ранних моделей; Один использовали экстракты слезной железы, а второй использовали аутоантиген ( т.е. klk1b22) из ​​слезных желез 20 , 21 . Болезнь была вызвана подкожной иммунизацией от 6 до 8 недельных самцов крыс Льюиса с овальбумином, полным адъювантом Фрейнда и эмульсией, содержащей следы слезной железы от крыс Sprague-Dawley ( рис. 1 ). Вторая иммунизация с тем же антигеном в неполном адъюванте Фрейнда былаВведенных через две недели. Чтобы набрать антигенспецифические иммунные клетки в слезные железы и глазную поверхность, смесь экстракт слезной железы и овальбумина (1 мг / мл) вводили в суставную субконъюнктиву и слезные железы на 6-7 - й неделе ( рис. 1 ). Более 85% крыс разработали характерные черты сухого глаза через 70 дней после первой иммунизации. Эти особенности включают в себя снижение производства разрывов ( рис. 2 ), увеличение окрашивания флуоресцеином роговицы ( рис. 3 ) и снижение стабильности разрыва ( рисунок 4 ). Иммунное профилирование Т-клеток в глазных яблоках нормальных крыс с помощью проточной цитометрии показывает преобладание Т-клеток с эффекторной памятью CD3 + ( рис. 5 и 6 ). Крысы с аутоиммунным DED показывают увеличение Т-клеток с эффекторной памятью CD3 + и соответствующее уменьшение в наивных и центральных ячеек памяти ( рис. 6 </stroнг&gt;).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="995">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">Reagents</td>
			<td style="width:300px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">Protease inhibitor cocktail</td>
			<td style="width:300px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">P2714-1BTL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td style="width:300px;">Thermal Scientific</td>
			<td style="width:143px;">23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">Mycobacterium tuberculosis H37Ra&#160;</td>
			<td style="width:300px;">Becton, Dickinson and company</td>
			<td style="width:143px;">231141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">complete Freund&#39;s adjuvant</td>
			<td style="width:300px;">Becton, Dickinson and company</td>
			<td style="width:143px;">231131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">ovalbumin</td>
			<td style="width:300px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">A5503-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">incomplete Freund&#39;s adjuvant&#160;</td>
			<td style="width:300px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">F5506-6X10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">pertussis toxin&#160;</td>
			<td style="width:300px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">P7208-50UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">fluorescein sodium solution</td>
			<td style="width:300px;">Bausch &#38; Lomb U.K Limited</td>
			<td style="width:143px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">Name</td>
			<td style="width:300px;">Company</td>
			<td style="width:143px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">Equipment</td>
			<td style="width:300px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">Sonicator</td>
			<td>Sonics&#160;</td>
			<td>Vibra-Cell</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">phenol red thread</td>
			<td>Tianjin Jingming New Technological development Co. LTD.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:387px;">Stereo microscope with ring light illuminator and camera</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">Micro IV microscope&#160;</td>
			<td style="width:300px;">Phoenix Research Labs</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a chronic autoimmune dry eye rat model with increase in effector memory t cells in eyeball tissue

Болезнь сухого глаза является очень распространенным заболеванием, которое вызывает заболеваемость и бремя болезней и снижает качество жизни. Существует потребность в подходящей модели животных для сухого глаза для тестирования новых терапевтических средств для лечения аутоиммунных сухих глазных состояний. Этот протокол описывает хроническую аутоиммунную модель сухих глазных крыс. Крыс Льюиса иммунизировали эмульсией, содержащей экстракт слезной железы, овальбумин и полный адъювант Фрейнда. Вторую иммунизацию с теми же антигенами в неполном адъюванте Фрейнда вводили через две недели. Эти иммунизации вводили подкожно у основания хвоста. Для усиления иммунного ответа на глазную поверхность и слезные железы, экстракт слезной железы и овальбумин вводили в суставную субконъюнктиву и слезные железы через 6 недель после первой иммунизации. У крыс были развиты сухие глаза, в том числе снижение производства слез, снижение стабильности слез и увеличение повреждения роговицы. Иммунный проПодача с помощью проточной цитометрии показала преобладание Т3-клеток с эффекторной памятью CD3 + в глазном яблоке.

Рисунок 1 иллюстрирует проект эксперимента. В день 48 и 70 дней клинические признаки сухого глаза оцениваются у иммунизированных крыс. Объем разрыва представлен длиной влажной части фенольной красной нити. На рисунке 2 показаны типичные изображения фенольных красных нитей из контрольных и крыс DED. Длина фенольных красных нитей в группе DED короче контрольной группы, что указывает на меньший объем разрыва. Флуоресцеин связывается с поврежденным эпителием роговицы. Таким образом, повреждение роговицы измеряют окрашиванием флуоресцеина роговицы. Флуоресцеиновые пятна на поверхности роговицы крыс DED оценивали от 0 до 2 и сравнивали с контрольными крысами. Крысы с DED имеют больше окрашивания флуоресцеином, чем контрольные крысы ( рис. 3 ), что указывает на повреждение роговицы. Гладкость роговицыВ DED и контрольные крысы оценивали с помощью кольцевого осветителя. Если поверхность роговицы гладкая, с высокой устойчивостью к разрыву, изображение кольца осветителя на поверхности глаза округлое и совершенное. Искажение изображения указывает на снижение гладкости роговицы и нестабильную слезоточивую пленку. Степень искажения кольца была градуирована от 0 до 2. В группе DED был отмечен более высокий уровень искажения кольца ( рисунок 4 ), что свидетельствует о меньшей стабильности разрыва. Крыс определяют как сухие глаза, когда по крайней мере две клинические признаки сухого глаза являются ненормальными. Среди 24 иммунизированных крыс 21 крыса разработали DED на 48-й день. Результаты были согласованы при оценке на 70-й день. Анализ проточной цитометрии показывает, что преобладающим подмножеством Т-клеток в нормальных тканях глазного яблока крысы являются Т-клетки с эффекторной памятью ( рис. 5 ). В глазных яблоках крыс DED ~ 70% CD3+ Т-клетки являются Т-клетками эффекторной памяти, тогда как у контрольных крыс это число составляет ~ 50%. Глазные клетки крыс DED имеют значительно более высокоэффективные Т-клетки памяти, чем у контрольных крыс ( рис. 6 ). <img alt="Рисунок 1" src="/files/ftp_upload/55592/55592fig1.jpg" /> Рисунок 1: Схема экспериментальной конструкции. LG: слезные железы; DED: болезнь сухого глаза; CFA: полный адъювант Фрейнда; IFA: неполный адъювант Фрейнда. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55592/55592fig1large.jpg" target="_blank">Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a> <img alt="фигура 2" src="/files/ftp_upload/55592/55592fig2.jpg" /> Рисунок 2: Красная нить фенола измеряет объем слез. Красную нить фенола помещают в проксимальный угол глаз крысы в ​​течение 1 мин и затем удаляют. RepresentativПоказаны изображения фенольной красной нити вместе с линейкой из групп управления и DED. ImageJ использовался для измерения длины влажной части феноло-красных нитей. Шкала шкалы = 1 мм. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55592/55592fig2large.jpg" target="_blank">Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a> <img alt="Рисунок 3" src="/files/ftp_upload/55592/55592fig3.jpg" /> Рисунок 3: Репрезентативные изображения эпителиального повреждения роговицы, измеренные флуоресцеиновым окрашиванием. Каждая крысиная роговица окрашивалась 0,2% флюоресцеином в течение 1 мин и промывалась по меньшей мере 1 мл физиологического раствора. Изображения были сделаны под микроскопом для визуализации глаз с кобальтовым синим светом. В первом столбце представлены репрезентативные изображения контрольных роговиц. Во второй колонке представлены репрезентативные изображения окрашивания роговицы у крыс с функциями DED. Зеленые флуоресцентные пятна указывают на эпителий роговицы<html> L повреждение. Все изображения были сделаны в той же цветовой гамме. Количественное определение флуоресцеинового окрашивания проводили в соответствии с площадью и плотностью зеленых пятен. Шкала шкалы = 1 мм. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55592/55592fig3large.jpg" target="_blank">Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a> <img alt="Рисунок 4" src="/files/ftp_upload/55592/55592fig4.jpg" /> Рисунок 4: Репрезентативные изображения Cornea, показывающие отражение кольцевого осветителя. Гладкость роговицы плавника / слез измеряли с помощью кольцевого осветителя. Степень искажения кольца в захваченных изображениях является показателем относительной стабильности разрыва. В левой колонке показаны репрезентативные изображения у контрольных животных, а в правой колонке показаны репрезентативные изображения после индукции сухого глаза. Шкала шкалы = 1 мм.Ank &quot;&gt; Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. <img alt="Рисунок 5" src="/files/ftp_upload/55592/55592fig5.jpg" /> Рисунок 5: Точечные графики, полученные из анализа проточной цитометрии. Т-клетки, выделенные из тканей глазного яблока, окрашивали панелью антител. В CD45 + CD3 + 7AAD - популяции были выделены CD3 + 7-AAD - T-клетки. Среди CD3 + 7-AAD - T-клеток определялись наивные, центральные памяти и популяции T-клеток памяти с эффекторной памятью. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55592/55592fig5large.jpg" target="_blank">Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a> <img alt="Рисунок 6" src="/files/ftp_upload/55592/55592fig6.jpg" /> Рисунок 6: Профиль субпопуляции Т-клеток в глазных яблоках. CD3 + CD45RC+ Наивные Т-клетки, CD3 + CD45RC - CD44 + CD62L - клетки эффекторной памяти T (T EM ) и CD3 + CD45RC - CD44 + CD62L + центральная память T (T CM ) клетки представлены как процент CD3 + Т-клеток. Результаты взяты у 3 контрольных крыс и у 6 крыс DED. Аналогичные результаты были получены из анализа Т-клеток из изолированных слезных желез (данные не показаны). Для статистического сравнения использовался t-тест непарного ученика. Полосы ошибок представляют собой SD. * P &lt;0,05, ** p &lt;0,01. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55592/55592fig6large.jpg" target="_blank">Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Chronic Autoimmune Dry Eye Rat Model with Increase in Effector Memory T Cells in Eyeball Tissue at JoVE.com

A Chronic Autoimmune Dry Eye Rat Model with Increase in Effector Memory T Cells in Eyeball Tissue

В этом отчете описывается способ индуцирования хронического экспериментального аутоиммунного сухого глаза у крыс Льюиса путем иммунизации эмульсией экстракта слезной железы крысы, овальбумина и полного адъюванта Фрейнда с последующей инъекцией экстракта слезной железы и овальбумина в суставную субконъюнктиву и слезные железы Шесть недель спустя.

Хроническая аутоиммунная модель сухих глаз с увеличением клеток памяти с эффекторной памятью в ткани глазного яблока

Dry eye disease is a very common condition that causes morbidity and healthcare burden and decreases the quality of life. There is a need for a suitable ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

Ретровирусные трансдукция Т-клеточных рецепторов в мышь Т-клеток

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Quantitative Assessment of Immune Cells in the Injured Spinal Cord Tissue by Flow Cytometry:  a Novel Use for a Cell Purification Method

Количественная оценка иммунных клеток в поврежденный спинной ткани шнура с помощью проточной цитометрии: Роман Используйте для метода очистки сотовый

Detection of immune cells in the injured central nervous system (CNS) using morphological or histological techniques has not always provided true ...

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&iuml;ve and Memory T Cells

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve and Memory T Cells

Генерация индуцированного регуляторных Т клеток из первичной человека наивного и Т-клеток памяти

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

PiggyBac транспозонов модификации системы первичной Т-клетках человека

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Systemic Injection of Neural Stem/Progenitor Cells in Mice with Chronic EAE

Системная Инъекция стволовых нервных / клеток-предшественников у мышей с хроническим ЕАЕ

Neural stem/precursor cells (NPCs) are a promising stem cell source for transplantation approaches aiming at brain repair or restoration in regenerative ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Индукционная мышиных воспаление кишечника с помощью приемных передачи эффекторных CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Высокая</sup&gt; Т-клеток в иммунодефицитных мышей

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Application of Long-term cultured Interferon-&#947; Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle

Application of Long-term cultured Interferon-ÃƒÅ½Ã‚Â³ Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle

Применение Долгосрочный культивируют Интерферон-γ фермент-связанного Immunospot анализе для оценки эффекторных и памяти T-клеточные ответы у крупного рогатого скота

Effector and memory T cells are generated through developmental programing of na&#239;ve cells following antigen recognition. If the infection is ...

Induction of Paralysis and Visual System Injury in Mice by T Cells Specific for Neuromyelitis Optica Autoantigen Aquaporin-4

Индукция паралич и зрительной системы травмы в мышей, специфические клетки T нейромиелит Optica Аквапорин аутоантиген-4

While it is recognized that aquaporin-4 (AQP4)-specific T cells and antibodies participate in the pathogenesis of neuromyelitis optica (NMO), a human ...

An Efficient and Simple Method to Establish NK and T Cell Lines from Patients with Chronic Active Epstein-Barr Virus Infection

Эффективной и простой метод для установления линии Т-клеток у больных с хроническим активный вирус Эпштейна - Барр инфекции и НК

A number of methods have been described to establish NK/T cell lines from patients with lymphoma or lymphoproliferative syndrome. These methods employed ...

In Vitro Differentiation Model of Human Normal Memory B Cells to Long-lived Plasma Cells

В модели дифференциации in Vitro клеток человека обычной памяти B для долгоживущих клеток плазмы

Plasma cells (PCs) secrete large amounts of antibodies and develop from B cells that have been activated. PCs are rare cells located in the bone marrow or ...