Name: a chronic autoimmune dry eye rat model with increase in effector memory t cells in eyeball tissue
Uploaded: 2017-06-07T13:00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Chronic Autoimmune Dry Eye Rat Model with Increase in Effector Memory T Cells in Eyeball Tissue at JoVE.com

Författarna vill tacka Ms. Tin Min Qi och Dr Veluchamy Amutha Barathi och hennes team för deras hjälp med att hantera djuren. Detta arbete stöddes av NHIC-I2D-1409007, SingHealth Foundation SHF / FG586P / 2014 och NMRC / CSA / 045/2012.

Djur hanterades enligt institutionella riktlinjer och ARVO-satsen för användning av djur i ögon- och visionsforskning. Studieprotokollet godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee of SingHealth. 1. Framställning av lakrimalkörtelxtrakt OBS: Råttor bedövades med intraperitoneal injektion av ketamin (75 mg / kg) och xylazin (10 mg / kg). Korrekt bedövning bekräftades av tånklipning och svansklämning. Oftalmisk gel applicerades på råttögon för att förhindra torrhet efter varje procedur. De bedövade råttorna placerades under långt infraröd ljus för att hålla djuren varm tills de helt återställdes. Under förfarandena och återhämtningstiden övervakades djuren noggrant av forskare. Alla material och kirurgiska verktyg var sterila före användning. Vid slutet av experimentet avlivades råttor genom intraperitoneal injektion av pentobarbital (80 mg / kg).Fullständig eutanasi kontrollerades genom brist på hjärtpuls och ingen blinkreflex genom att röra ögongloben. Råttor hölls i standardbetingelser: rumstemperatur, 21-23 ° C; Relativ fuktighet, 30-70%; Ljus mörk cykel, alternerande 12 h (7 AM till 7 PM). <ol><li> Placera euthanized kvinnliga Sprague-Dawley råttor (åldersintervall från 8 veckor till 16 veckor) platt, med ett öra mot bordet och den andra uppåt. Gör en 10 mm snitt överlägsen-underlägsen under det exponerade örat med ett par fjädersaxar. Ta bort lacrimalkörteln genom att dissekera den från den omgivande bindväven och från dräneringskanalen. <ol><li> Förvara körtlarna vid -80 ° C tills det behövs. Tina körtlarna på is. Mince så fin som möjligt på is med sax. Tillsätt 150 μl PBS med 1x proteashämmare per lakrimalkörtel. </li></ol></li><li> Sonikera proven på is i 5 min vid 20 kHz med sonikatorn inställd på 10 s på, 10 s av vid 30% amplitud. Centrifugera sonenIcerade prov under 20 minuter vid 13 000 xg och 4 ° C. </li><li> Pipettera supernatanten och överför den till ett nytt rör. Aliquot supernatanten till 1,5 ml rör och förvara dem vid -80 ° C. Mät proteinkoncentrationen med en bicinchoninsyraanalys 22 , enligt tillverkarens instruktioner. </li></ol> 2. Framställning av emulsion och pertussistoxin <ol><li> Emulsion <ol><li> Tillsätt 40 mg värmdöd Mycobacterium tuberculosis H37Ra i 10 ml fullständigt Freunds adjuvans innehållande 1 mg / ml Mycobacterium tuberculosis H37Ra och blanda väl. OBS! Den slutliga fullständiga Freunds adjuvans innehåller 5 mg / ml Mycobacterium tuberculosis H37Ra . </li><li> Väg ovalbuminet, lös det upp i PBS och förbered en antigenblandning innehållande 2 mg / ml ovalbumin och 10 mg / ml lakrimalkörtelxtrakt. Syftar till en injektionsvolym av 200 μl för varje djur, bereda en mängderblandning bAsed på djurens nummer. </li><li> Överför ofullständig Freunds adjuvans eller fullständig Freunds adjuvans till ett 50 ml rör, vilket säkerställer att volymen av adjuvans till antigenblandningen är i ett förhållande 1: 1. Tillsätt antigenblandningen drop-by-drop till adjuvansen medan vortexing med högsta hastighet som inte leder till spill. Fortsätt vortexing i 5 minuter efter att allt antigen har tillsatts. </li><li> Överför emulsionen till en 5 ml spruta och koppla den med en annan 5 ml spruta genom en sprutanslutning. Skjut emulsionen från en spruta till den andra för att blanda den. OBS: Emulsionen är klar om en enda droppe förblir som en sfär när den placeras i vatten. Endast nyberedd emulsion eller emulsion som lagras över natten vid 4 ° C bör användas. </li></ol></li><li> Pertussis toxin <ol><li> Rekonstituera 50 μg pertussis toxin i 500 μl vatten för att få en slutlig koncentration av 100 ng / μl. Votex behållaren i 30 s för att se till att tOxin löser sig fullständigt. OBSERVERA: Sterilisera inte genom filtrering, eftersom detta kommer att leda till förlust av material. Frys inte. Denna lösning förblir aktiv under minst 6 månader vid 4 ° C. </li><li> Späd 100 ng / μl pertussis toxin till 3 ng / μl med PBS. Överför 100 μL av det utspädda pertussis toxinet till en 1 ml luerlås injektionsspruta med en 27 G nål. </li></ol></li></ol> 3. Immunisering av Lewis-råttorna <ol><li> På dag 0, blanda emulsionen några gånger. Distribuera 200 μl av emulsionen, som innehåller 1 mg lacrimalkirtlextrakt och 200 μg ovalbumin i fullständigt Freunds adjuvans, i 1 ml luerlåssprutor med 27 G nålar. Injicera emulsionen subkutant vid botten av råtta svansar utan anestesi. OBS: Svansen behöver inte förvärmas före injektionen. Varje råtta immuniseras med 1 mg lakrimalkörtelxtrakt och 200 μg ovalbumin i fullständig Freunds adjuvansvitH 500 μg Mycobacterium tuberculosis H37Ra . </li><li> På dag 14 injicerar 200 μl av emulsionen, som innehåller 1 mg lakrimalkörtelxtrakt och 200 μg ovalbumin i ofullständigt Freunds adjuvans, på samma sätt som vid dag 0. Injicera 300 ng pertussis toxin i 100 ul PBS intraperitonealt Per råtta på samma dag. </li></ol> 4. Injektion av antigensblandningen i forniceal subkonjunktiva och lacrimalkörteln för att rekrytera antigenspecifika immunceller och orsaka lokal inflammation <ol><li> Beräkna mängden ovalbumin och lacrimal körtel extrakt baserat på antalet råttor i experimentet. Väg den önskade mängden ovalbumin och kombinera det med det avfrostade lacrimalkirtletraktet framställt i steg 1, vilket gör antigenlösning innehållande 1 mg / ml ovalbumin och 1 mg / ml lakrimalkörtelxtrakt. </li><li> Bedöda råttorna med ketamin (75 mg / kg) och xylazin (10 mg / kg) genom intraperitoneal injektion. Knippa toRåttor för att säkerställa att rätt anestesi har uppnåtts ( dvs ingen responsiv rörelse observeras efter klyftan). Injicera 5 | il antigen i ögonens forniceal subkonjunktiva. Injicera 20 μl antigen i lacrimalkörteln. </li></ol> 5. Bedömning av torra ögonfunktioner OBS! För steg 5.1-5.3 ska de bedövade råttorna försiktigt hållas med en handskruv i upprätt läge på en plan yta för att undvika rörelse. <ol><li> Mät tårvolymen med fenolröd tråd. <ol><li> Använd ett par tångar för att hålla tråden och en annan för att dra ryggens nedre ögonlopp. Placera tråden i det proximala hörnet av den nedre fornixen i 1 min och ta bort tråden. OBS: Tårar gör den fuktiga delen av tråden röd i färg. </li><li> Ta en bild av längden på den fuktiga delen av tråden bredvid en linjal med millimetermarkeringar. Mät den fuktiga längden till den tionde oFa millimeter med hjälp av en bildprogramvara ( t.ex. ImageJ). </li></ol></li><li> Mät hornhinnor / riva jämnhet. <ol><li> Placera råttan under ett stereomikroskop utrustat med en ringbelysning och en kamera. Applicera 5 μl saltlösning på råtthinnan. Passivt blinka genom att flytta övre och nedre ögonlocken med handskna fingrar ~ 5 gånger för att sprida saltlösningen. </li><li> Fokusera ringbelysningen på mitten av hornhinnans yta under 1,6x förstoring. Få fotografiska bilder efter 10 s. OBS: Ringen belyser två cirkulära rader av punktbilder på djurets hornhinnor. Regelbunden avstånd mellan de oförvrängda punkterna antyder ett slät hornhinnor / tårskikt. </li></ol></li><li> Mät kornealskador med fluoresceinfärgning. <ol><li> Tillsätt 2 μl 0,2% fluorescein till råtthinnan. Passivt öppna och stäng råttögonlocken 3 gånger med ett handskent finger för att sprida fluoresceinfärgämnet på ytan. </li><lI&gt; Efter 1 minut ritas 1 ml saltlösning med en 3 ml spruta (utan nålfästning), placera sprutan ca 2-3 mm främre mot hornhinnan och försiktigt driva saltlösning på ögat. </li><li> Skaffa bilder under koboltblåfiltret ( dvs. ~ 400 nm) av ett okulärt bildmikroskop med bakgrundsljusen avstängda. OBS! Bilder analyserades senare av ett klassificeringssystem modifierat från tidigare publikationer 23 . Bilder analyserades sedan genom att subjektivt betygsätta antalet grönområden, antal och intensitet från 0 till 2, där 0 indikerar att de saknas, 1 indikerar punktadefärgning av mindre än 50 fläckar och 2 indikerar punktadefärgning av mer än 50 fläckar. </li></ol></li><li> Euthanisera råttorna genom intraperitoneal injektion av pentobarbital (80 mg / kg). Ta bort övre och nedre ögonlocken med sax. Fix och prolapse ögonbollarna genom att trycka ner på de periokulära vävnaderna med tång. Frigör världen genom att avbryta tHan extraokulära muskler, optisk nerv och forniceal conjunctiva. </li><li> Fixa råttögonbollens position med pincett och öppna den med ett omkretssnitt längs ekvatorn. Ta bort linsen och glasögon. Sätt de dissekerade ögonbollarna i 1,5 ml rör på is. </li><li> Samla lacrimalkörtlarna, som beskrivs i steg 1.1. Överför omedelbart de dissekerade ögonlocksvävnaderna och lacrimalkörtlarna till laboratoriet för att förbereda sig för flödescytometrianalys. </li><li> Isolerade immuncellerna med kollagenas- och dispas II-digestionsmetoderna 24 , 25 . Fortsätt att använda flödescytometri för att profilera T-cell-subpopulationen i ögonbollens vävnader 26 . OBS: Antistoffpanelen är: anti-CD45APC-Cyanin7 (OX-1), anti-CD3 BV421 (1F4), anti-CD4 PE-cyanin7 (OX-35), anti-CD45RC Alexa647 (OX-22) -CD62 PE (HRL1), anti-CD44 FITC (OX-50) och livskraftcellsfärg 7-AAD. Bland CD45 + CD3 <sup&gt; + 7AAD - population, naiv (CD3 + CD45RC + ), effektorminne (T EM, CD3 + CD45RC - CD44 + CD62L-) och centralt minne (T CM, CD3 + CD45RC - CD44 + CD62L + ) . </li></ol>

<ol>
	<li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+definition+and+classification+of+dry+eye+disease:+report+of+the+Definition+and+Classification+Subcommittee+of+the+International+Dry+Eye+WorkShop+(2007).">The definition and classification of dry eye disease: report of the Definition and Classification Subcommittee of the International Dry Eye WorkShop (2007).</a> Ocul Surf. 5 (2), 75-92 (2007).</li><li>Gayton, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Etiology,+prevalence,+and+treatment+of+dry+eye+disease.">Etiology, prevalence, and treatment of dry eye disease.</a> Clin Ophthalmol. 3, 405-412 (2009).</li><li>Tong, L., Tan, J., Thumboo, J., Seow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dry+eye.">The dry eye.</a> Praxis (Bern 1994). 102 (13), 803-805 (2013).</li><li>Messmer, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathophysiology,+diagnosis,+and+treatment+of+dry+eye+disease.">The pathophysiology, diagnosis, and treatment of dry eye disease.</a> Dtsch Arztebl Int. 112 (5), 71-81 (2015).</li><li>Liu, K. C., Huynh, K., Grubbs, J., Davis, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoimmunity+in+the+pathogenesis+and+treatment+of+keratoconjunctivitis+sicca.">Autoimmunity in the pathogenesis and treatment of keratoconjunctivitis sicca.</a> Curr Allergy Asthma Rep. 14 (1), 403 (2014).</li><li>Stevenson, W., Chauhan, S. K., Dana, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dry+eye+disease:+an+immune-mediated+ocular+surface+disorder.">Dry eye disease: an immune-mediated ocular surface disorder.</a> Arch Ophthalmol. 130 (1), 90-100 (2012).</li><li>Tong, L., Thumboo, J., Tan, Y. K., Wong, T. Y., Albani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+eye:+a+window+of+opportunity+in+rheumatoid+arthritis.">The eye: a window of opportunity in rheumatoid arthritis.</a> Nat Rev Rheumatol. 10 (9), 552-560 (2014).</li><li>Carnahan, M. C., Goldstein, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ocular+complications+of+topical,+peri-ocular,+and+systemic+corticosteroids.">Ocular complications of topical, peri-ocular, and systemic corticosteroids.</a> Curr Opin Ophthalmol. 11 (6), 478-483 (2000).</li><li>Johannsdottir, S., Jansook, P., Stefansson, E., Loftsson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+cyclodextrin-based+aqueous+cyclosporin+A+eye+drop+formulations.">Development of a cyclodextrin-based aqueous cyclosporin A eye drop formulations.</a> Int J Pharm. 493 (1-2), 86-95 (2015).</li><li>Prabhasawat, P., Tesavibul, N., Karnchanachetanee, C., Kasemson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+cyclosporine+0.05%+eye+drops+in+Stevens+Johnson+syndrome+with+chronic+dry+eye.">Efficacy of cyclosporine 0.05% eye drops in Stevens Johnson syndrome with chronic dry eye.</a> J Ocul Pharmacol Ther. 29 (3), 372-377 (2013).</li><li>Ishimaru, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Severe+destructive+autoimmune+lesions+with+aging+in+murine+Sjogren's+syndrome+through+Fas-mediated+apoptosis.">Severe destructive autoimmune lesions with aging in murine Sjogren's syndrome through Fas-mediated apoptosis.</a> Am J Pathol. 156 (5), 1557-1564 (2000).</li><li>Jonsson, R., Tarkowski, A., Backman, K., Holmdahl, R., Klareskog, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sialadenitis+in+the+MRL-l+mouse:+morphological+and+immunohistochemical+characterization+of+resident+and+infiltrating+cells.">Sialadenitis in the MRL-l mouse: morphological and immunohistochemical characterization of resident and infiltrating cells.</a> Immunology. 60 (4), 611-616 (1987).</li><li>Jonsson, R., Tarkowski, A., Backman, K., Klareskog, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+characterization+of+sialadenitis+in+NZB+X+NZW+F1+mice.">Immunohistochemical characterization of sialadenitis in NZB X NZW F1 mice.</a> Clin Immunol Immunopathol. 42 (1), 93-101 (1987).</li><li>Li, H., Dai, M., Zhuang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+T+cell+intrinsic+role+of+Id3+in+a+mouse+model+for+primary+Sjogren's+syndrome.">A T cell intrinsic role of Id3 in a mouse model for primary Sjogren's syndrome.</a> Immunity. 21 (4), 551-560 (2004).</li><li>Shull, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+disruption+of+the+mouse+transforming+growth+factor-beta+1+gene+results+in+multifocal+inflammatory+disease.">Targeted disruption of the mouse transforming growth factor-beta 1 gene results in multifocal inflammatory disease.</a> Nature. 359 (6397), 693-699 (1992).</li><li>Green, J. E., Hinrichs, S. H., Vogel, J., Jay, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exocrinopathy+resembling+Sjogren's+syndrome+in+HTLV-1+tax+transgenic+mice.">Exocrinopathy resembling Sjogren's syndrome in HTLV-1 tax transgenic mice.</a> Nature. 341 (6237), 72-74 (1989).</li><li>Shen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+autoimmunity+in+IL-14alpha-transgenic+mice.">Development of autoimmunity in IL-14alpha-transgenic mice.</a> J Immunol. 177 (8), 5676-5686 (2006).</li><li>Hayashi, Y., Hirokawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunopathology+of+experimental+autoallergic+sialadenitis+in+C3H/He+mice.">Immunopathology of experimental autoallergic sialadenitis in C3H/He mice.</a> Clin Exp Immunol. 75 (3), 471-476 (1989).</li><li>Liu, S. H., Zhou, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+autoimmune+dacryoadenitis:+purification+and+characterization+of+a+lacrimal+gland+antigen.">Experimental autoimmune dacryoadenitis: purification and characterization of a lacrimal gland antigen.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 33 (6), 2029-2036 (1992).</li><li>Liu, S. H., Prendergast, R. A., Silverstein, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+autoimmune+dacryoadenitis.+I.+Lacrimal+gland+disease+in+the+rat.">Experimental autoimmune dacryoadenitis. I. Lacrimal gland disease in the rat.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 28 (2), 270-275 (1987).</li><li>Jiang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+model+of+experimental+autoimmune+keratoconjunctivitis+sicca+(KCS)+induced+in+Lewis+rat+by+the+autoantigen+Klk1b22.">A new model of experimental autoimmune keratoconjunctivitis sicca (KCS) induced in Lewis rat by the autoantigen Klk1b22.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 50 (5), 2245-2254 (2009).</li><li>Walker, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bicinchoninic+acid+(BCA)+assay+for+protein+quantitation.">The bicinchoninic acid (BCA) assay for protein quantitation.</a> Methods Mol Biol. 32, 5-8 (1994).</li><li>Lin, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+dry+eye+model+induced+by+topical+administration+of+benzalkonium+chloride.">A mouse dry eye model induced by topical administration of benzalkonium chloride.</a> Mol Vis. 17, 257-264 (2011).</li><li>Cousins, S. W., Streilein, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+detection+of+lymphocyte+proliferation+in+eyes+with+immunogenic+inflammation.">Flow cytometric detection of lymphocyte proliferation in eyes with immunogenic inflammation.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 31 (10), 2111-2122 (1990).</li><li>Yawata, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+change+in+natural+killer+cell+type+in+the+human+ocular+mucosa+in+situ+as+means+of+immune+evasion+by+adenovirus+infection.">Dynamic change in natural killer cell type in the human ocular mucosa in situ as means of immune evasion by adenovirus infection.</a> Mucosal Immunol. 9 (1), 159-170 (2016).</li><li>Chen, Y., Chauhan, S. K., Lee, H. S., Saban, D. R., Dana, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+dry+eye+disease+is+principally+mediated+by+effector+memory+Th17+cells.">Chronic dry eye disease is principally mediated by effector memory Th17 cells.</a> Mucosal Immunol. 7 (1), 38-45 (2014).</li><li>Goldmuntz, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+of+the+autoimmune+disease-resistant+LER+rat:+an+outcross+between+the+buffalo+and+autoimmune+disease-prone+Lewis+inbred+rat+strains.">The origin of the autoimmune disease-resistant LER rat: an outcross between the buffalo and autoimmune disease-prone Lewis inbred rat strains.</a> J Neuroimmunol. 44 (2), 215-219 (1993).</li><li>Cahalan, M. D., Chandy, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functional+network+of+ion+channels+in+T+lymphocytes.">The functional network of ion channels in T lymphocytes.</a> Immunol Rev. 231 (1), 59-87 (2009).</li></ol>

Författarna har inga intressekonflikter. LT mottog tidigare finansiering och / eller gåvor från Alcon, Allergan, Santen, Bausch och Lomb, Eyelens och Eyedetec.

Ett kritiskt steg i detta protokoll är att säkerställa emulsionens homogenitet. I välberedda emulsioner beläggs antigenerna fullständigt med olja, vilket säkerställer långsam frisättning av det injicerade antigenet och kontinuerlig immunstimulering. En annan viktig egenskap hos detta protokoll är användningen av Lewis-råttor. Lewis-råttor är känsligare för utvecklingen av autoimmun sjukdom än andra stammar 27 . Detta protokoll har modifierats från två tidigare publicerade protokoll, som antingen endast använde lakrimalkörtelxtrakt eller rekombinant Klk1b22 20 , 21 . I det nuvarande protokollet används ovalbumin plus lacrimalkörtelxtrakt som antigen, och antigen-specifika immunceller lockas till okularytan och lacrimalkörteln, vilket inducerar lokal vävnadsskada. Torrt öga utvecklas långsamt och når ~ 85% dag 48 efter den initiala immuniseringen. Antigenisk utmaning tillÖgon- och lacrimalkörteln på dag 48 förvärrar det torra ögat och säkerställer dess kroniskitet fram till dag 70. Jämfört med det rekombinanta Klk1b22 i den Klk-inducerade DED-modellen är lacrimalkörtelkstraktet och ovalbuminet som används i den nuvarande modellen billigare och lättare att erhålla. Lackrimalkörteln extrakten innehåller också andra proteiner, förutom Klk, som kan inducera autoimmunitet, så detta extrakt är teoretiskt mer potent än Klk-metoden vid induktion av DED. Vi har också försökt immunisera råttor med lacrimal körtel extrakt bara; Fastän dessa immuniserade råttor utvecklade DED, var det ingen signifikant ökning av effektorminne-T-celler i ögonloppsvävnader jämfört med kontroller. Begränsningen av denna teknik är att det tar 70 dagar att uppnå modellen. Effektminne T-celler är de huvudsakliga T-cellundergrupperna i det normala råttögonet. I denna modell resulterar autoimmun DED i en ökning av CD3 + -effektorminnet T-celler i ögongloben. Läkemedel som prefSignifikant undertrycka effektorminnet T-celler, såsom selektiva hämmare av Kv1.3-kaliumkanalen, kan därför ha en terapeutisk fördel på autoimmun DED 28 .

Torr ögonsjukdom (DED) är en multifaktoriell sjukdom i tårarna och den okulära ytan som leder till symtom på obehag, synstörningar och instabilitet i tårfilmen, vilket kan leda till skador på okulär yta. Det åtföljs av ökad osmolaritet av tårfilmen och av inflammation i den okulära ytan 1 . Symptom som är förknippade med DED brinner, sticker, grittiness, känsla av främmande kropp, riva, okular trötthet och torrhet 2 , 3 . De två främsta orsakerna till DED reduceras tårproduktionen genom tårensekretionsklämman och den överdrivna indunstningen av tårfilmen 4 . Hos patienter med autoimmuna sjukdomar, såsom Sjogren syndrom, systemisk lupus erythematosus och reumatoid artrit, minskar immunförsvaret på meibomkörtlarna uttrycket av lipider som är väsentliga för tårestabilitet. Även immunförlusten på den okulära ytan minskar produktionenPå muciner som är viktiga för ytvätbarhet. Tillsammans orsakar dessa processer kumulativt kroniskt torrt öga 5 , 6 , 7 . Tårarbyte och antiinflammatorisk terapi är grunden för behandlingen. De nuvarande antiinflammatoriska terapierna för DED ( dvs kortikosteroider och cyklosporin) är emellertid i stort sett immunundertryckande, vilket leder till allvarliga biverkningar 8 , 9 , 10 . Det finns behov av en lämplig djurmodell för att testa nya immunmodulerande medel för att behandla autoimmunt torrt öga. Möss med specifika genetiska defekter 11 , 12 , 13 , möss som saknar specifika gener 14 , 15 och transgena möss som överuttrycker immunoregulatOrygener har använts som modeller av autoimmunt torrt öga 16 , 17 . Antigeninducerade autoimmuna djurmodeller har också rapporterats hos möss 18 , kaniner 19 och råttor 20 , 21 . Här beskriver vi en antigen-inducerad modell av kroniskt autoimmunt torrt öga. Denna modell är en modifikation av två tidigare modeller; En använde lacrimalkörtelkstrakter, och den andra använde en autoantigen ( dvs. klk1b22) från lacrimalkörtlarna 20 , 21 . Sjukdomen inducerades genom subkutan immunisering av 6 till 8 veckor gamla kvinnliga Lewis-råttor med ovalbumin, fullständig Freunds adjuvans och en emulsion innehållande lakrimalkörtelxtrakt från Sprague-Dawley-råttor ( Figur 1 ). En andra immunisering med samma antigen i ofullständig Freunds adjuvans varAdministreras två veckor senare. För att rekrytera antigenspecifika immunceller till lacrimalkörteln och okularytan injicerades blandningen av lacrimalkirtlextrakt och ovalbumin (1 mg / ml) i de fornikala subkonjunktiva och lacrimalkörtlarna vid 6 : e- 7 : e veckan ( Figur 1 ). Mer än 85% av råttorna utvecklade karakteristiska särdrag hos torrt öga 70 dagar efter den första immuniseringen. Dessa egenskaper innefattar minskad tårproduktion ( Figur 2 ), ökad hornhinnevätesfargning ( Figur 3 ) och minskad tårestabilitet ( Figur 4 ). Immunprofilering av T-cellerna i ögonbollarna hos normala råttor genom flödescytometri avslöjar en övervägande av CD3 + -verkningsminne-T-celler (figurerna 5 och 6 ). Råttor med autoimmun DED uppvisar en ökning av CD3 + effektorminne-T-celler och motsvarande minskningar i naiva och centrala minnes-T-celler ( Figur 6 </strong&gt;).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="995">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">Reagents</td>
			<td style="width:300px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">Protease inhibitor cocktail</td>
			<td style="width:300px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">P2714-1BTL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td style="width:300px;">Thermal Scientific</td>
			<td style="width:143px;">23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">Mycobacterium tuberculosis H37Ra&#160;</td>
			<td style="width:300px;">Becton, Dickinson and company</td>
			<td style="width:143px;">231141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">complete Freund&#39;s adjuvant</td>
			<td style="width:300px;">Becton, Dickinson and company</td>
			<td style="width:143px;">231131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">ovalbumin</td>
			<td style="width:300px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">A5503-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">incomplete Freund&#39;s adjuvant&#160;</td>
			<td style="width:300px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">F5506-6X10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">pertussis toxin&#160;</td>
			<td style="width:300px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">P7208-50UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">fluorescein sodium solution</td>
			<td style="width:300px;">Bausch &#38; Lomb U.K Limited</td>
			<td style="width:143px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">Name</td>
			<td style="width:300px;">Company</td>
			<td style="width:143px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">Equipment</td>
			<td style="width:300px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">Sonicator</td>
			<td>Sonics&#160;</td>
			<td>Vibra-Cell</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">phenol red thread</td>
			<td>Tianjin Jingming New Technological development Co. LTD.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:387px;">Stereo microscope with ring light illuminator and camera</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">Micro IV microscope&#160;</td>
			<td style="width:300px;">Phoenix Research Labs</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a chronic autoimmune dry eye rat model with increase in effector memory t cells in eyeball tissue

Torr ögonsjukdom är ett mycket vanligt tillstånd som orsakar sjuklighet och hälsovård, och minskar livskvaliteten. Det finns ett behov av en lämplig modell med torra ögon för att testa nya terapeutiska medel för att behandla autoimmuna torra ögonförhållanden. Detta protokoll beskriver en kronisk autoimmun torr ögonrotmodell. Lewis-råttor immuniserades med en emulsion innehållande lakrimalkörtelxtrakt, ovalbumin och fullständig Freunds adjuvans. En andra immunisering med samma antigener i ofullständig Freunds adjuvans administrerades två veckor senare. Dessa immuniseringar administrerades subkutant vid svansens bas. För att öka immunsvaret vid ögonytan och lacrimalkörtlarna injicerades lacrimalkörtelkstrakt och ovalbumin i de fornikala subkonjunktiva och lacrimalkörtlarna 6 veckor efter den första immuniseringen. Råttorna utvecklade funktionen torra ögon, inklusive minskad tårproduktion, minskad rivstabilitet och ökad hornhinneskada. ImmunproArkivering med flödescytometri visade en övervägande av CD3 + effektorminne-T-celler i ögongloben.

Figur 1 illustrerar experimentdesignen. På båda dagarna 48 och 70 dag utvärderas kliniska särdrag med torra ögon i de immuniserade råttorna. Tårvolymen representeras av längden på den våta delen av fenolrödgängan. Figur 2 visar representativa bilder av fenolröda trådar från kontroll- och DED-råttor. Längden av fenolröda trådarna i DED-gruppen är kortare än kontrollgruppen, vilket indikerar mindre rivvolym. Fluorescein binder till skadat hornhinnepitel. Således mäts hornhinneskada genom hornfluoresceinfärgning. Fluoresceinfläckar på hornhinnans yta av DED-råttor graderades från O till 2 och jämfördes med kontrollråttor. Råttor med DED har mer fluoresceinfärgning än kontrollråttor ( Figur 3 ), vilket tyder på hornhinneskada. HörnhinnanI DED och kontrollrotor utvärderades av ringbelysningen. Om hornhinnans yta är jämn, med hög rivstabilitet är bilden av belysningsringen på den okulära ytan rund och perfekt. Förvrängning av bilden indikerar minskad hornhinnor jämnhet och en instabil tårfilm. Förvrängningsgraden för ringen blev graderad från O till 2. En högre ringförvrängningsnivå noterades i DED-gruppen ( Figur 4 ), vilket indikerar mindre rivstabilitet. Råttor definieras som torra ögon när minst två kliniska särdrag hos det torra ögat är onormala. Bland de 24 immuniserade råttorna utvecklade 21 råttor DED på dag 48. Resultaten var konsekventa när de utvärderades på dag 70. Flödescytometrianalysen visar att den övervägande T-cellsubsättningen i normala råttaögonvävnader är effektorminne-T-celler ( Figur 5 ). I ögonbollarna av DED-råttor, ~ 70% av CD3+ T-celler är effektorminne-T-celler, medan det i kontrollråttor är detta tal ~ 50%. Ögonbollar av DED-råttor har signifikant högre effektorminne-T-celler än de hos kontrollråttor ( Figur 6 ). <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/55592/55592fig1.jpg" /> Figur 1: Schematisk av experimentell design. LG: lacrimal körtel; DED: torr ögonsjukdom; CFA: komplett Freunds adjuvans; IFA: ofullständigt Freunds adjuvans. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55592/55592fig1large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/55592/55592fig2.jpg" /> Figur 2: Phenol Red Thread mäter tårvolymen. Fenolröd tråd placeras i det proximala hörnet av båda råttögonen i 1 min och avlägsnas sedan. representativE bilder av fenolröd tråd, tillsammans med en linjal, från både kontroll- och DED-grupper visas. ImageJ användes för att mäta längden på den våta delen av fenolröttråden. Skala bar = 1 mm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55592/55592fig2large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/55592/55592fig3.jpg" /> Figur 3: Representativa bilder av korneal epithelial skada mätt med fluoresceinfärgning. Varje råtthinnehinna färgades med 0,2% fluorescein i 1 min och spolades med minst 1 mL saltlösning. Bilder togs under ett ögonbildningsmikroskop med koboltblått ljus. Den första kolumnen visar representativa bilder av kontrollhinnor. Den andra kolumnen innehåller representativa bilder av hornhinnans färgning från råttor med DED-funktioner. De gröna fluorescerande fläckarna indikerar hornhinnepitel<html> L skada Alla bilder producerades på samma färgskala. Kvantifieringen av fluoresceinfärgning utfördes i enlighet med området och densiteten hos de gröna fläckarna. Skala bar = 1 mm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55592/55592fig3large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.</a> <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/55592/55592fig4.jpg" /> Figur 4: Representativa korneaprodukter Visar reflektionen av ringbelysningen. Råtthinnor / riva jämnhet mättes med en ringbelysning. Förvrängningsgraden hos ringen i de fångade bilderna är ett mått på relativ rivningsstabilitet. Den vänstra kolumnen visar de representativa bilderna i kontrolldjur och den högra kolumnen visar representativa bilder efter induktion av torra ögon. Skala bar = 1 mm.Ank &quot;&gt; Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur. <img alt="Figur 5" src="/files/ftp_upload/55592/55592fig5.jpg" /> Figur 5: Dotplots avledda från flödescytometrianalys. T-celler isolerade från ögongloppsvävnader färgades med en panel av antikroppar. I CD45 + CD3 + 7AAD - populationen stängdes CD3 + 7-AAD - T-celler. Bland CD3 + 7-AAD - T-cellerna bestämdes de naiva, centrala minnes- och effektorminne-T-cellpopulationerna. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55592/55592fig5large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.</a> <img alt="Figur 6" src="/files/ftp_upload/55592/55592fig6.jpg" /> Figur 6: T-cell subpopulationsprofil i ögonbollarna. CD3 + CD45RC+ Naiva T-celler, CD3 + CD45RC - CD44 + CD62L-effektorminne T (T EM ) celler och CD3 + CD45RC - CD44 + CD62L + -central - T (T CM ) -celler presenteras som andelen av CD3 + T-celler. Resultaten är från 3 kontrollråttor och 6 DED-råttor. Liknande resultat erhölls från analysen av T-celler från isolerade lacrimalkörtlar (data ej visade). Den oparade Studentens t-test användes för statistisk jämförelse. Felstängerna representerar SD. * P &lt;0,05, ** p &lt;0,01. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55592/55592fig6large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Chronic Autoimmune Dry Eye Rat Model with Increase in Effector Memory T Cells in Eyeball Tissue at JoVE.com

A Chronic Autoimmune Dry Eye Rat Model with Increase in Effector Memory T Cells in Eyeball Tissue

I denna rapport beskrivs en metod för att framkalla ett kroniskt experimentellt autoimmunt torrt öga i Lewis-råttor genom immunisering med en emulsion av råtta lakrimalkirtlextrakt, ovalbumin och fullständig Freunds adjuvans, följt av injektion av lakrimalkirtlextrakt och ovalbumin i de forniceala subkonjunktiva och lacrimalkirtlarna Sex veckor senare.

En kronisk autoimmun torr ögonrotmodell med ökning av Effector Memory T-celler i ögonlocksvävnad

Dry eye disease is a very common condition that causes morbidity and healthcare burden and decreases the quality of life. There is a need for a suitable ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

Retroviral Transduction av T-cell receptorer i Mus T-celler

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Quantitative Assessment of Immune Cells in the Injured Spinal Cord Tissue by Flow Cytometry:  a Novel Use for a Cell Purification Method

Kvantitativ bedömning av immunceller i den skadade ryggmärg med flödescytometri: en ny användning för en cell reningsmetod

Detection of immune cells in the injured central nervous system (CNS) using morphological or histological techniques has not always provided true ...

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&iuml;ve and Memory T Cells

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve and Memory T Cells

Generering av Inducerade regulatoriska T-celler från primära humana naiva och minne T-celler

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac transposon System Ändring av primära humana T-celler

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Systemic Injection of Neural Stem/Progenitor Cells in Mice with Chronic EAE

Systemisk Injektion av neurala stamceller / stamceller hos möss med kronisk EAE

Neural stem/precursor cells (NPCs) are a promising stem cell source for transplantation approaches aiming at brain repair or restoration in regenerative ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Induktion av murina tarminflammation med adoptiv överföring av Effector CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Hög</sup&gt; T-celler i möss med immunbrist

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Application of Long-term cultured Interferon-&#947; Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle

Application of Long-term cultured Interferon-ÃƒÅ½Ã‚Â³ Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle

Tillämpning av Långsiktigt odlade Interferon-γ Enzymkopplad immunospot analys för bedömning Effector och Memory T-cellssvar hos nötkreatur

Effector and memory T cells are generated through developmental programing of na&#239;ve cells following antigen recognition. If the infection is ...

Induction of Paralysis and Visual System Injury in Mice by T Cells Specific for Neuromyelitis Optica Autoantigen Aquaporin-4

Induktion av förlamning och visuella systemet skada hos möss av T celler specifika för Neuromyelitis Optica Autoantigen akvaporin-4

While it is recognized that aquaporin-4 (AQP4)-specific T cells and antibodies participate in the pathogenesis of neuromyelitis optica (NMO), a human ...

An Efficient and Simple Method to Establish NK and T Cell Lines from Patients with Chronic Active Epstein-Barr Virus Infection

En effektiv och enkel metod för att fastställa NK och T cellinjer från patienter med kronisk aktiv Epstein - Barr virusinfektion

A number of methods have been described to establish NK/T cell lines from patients with lymphoma or lymphoproliferative syndrome. These methods employed ...

In Vitro Differentiation Model of Human Normal Memory B Cells to Long-lived Plasma Cells

I Vitro differentiering modell av människans normala minne B celler att långlivade plasmaceller

Plasma cells (PCs) secrete large amounts of antibodies and develop from B cells that have been activated. PCs are rare cells located in the bone marrow or ...