Name: extraction and purification of polyphenols from freeze-dried berry powder for the treatment of vascular smooth muscle cells in vitro
Uploaded: 2017-07-05T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Extraction and Purification of Polyphenols from Freeze-dried Berry Powder for the Treatment of Vascular Smooth Muscle Cells In Vitro at JoVE.com

Este trabalho foi financiado pela Associação Americana do Coração (14GRNT20180028) e pelo Conselho da Universidade Estadual da Flórida sobre Pesquisa e Criatividade (COFRS).

1. Preparação de Reagentes <ol><li> Prepare 80% de etanol (100 mL) misturando 80 mL de etanol absoluto (grau de biologia molecular) e 20 mL de água estéril de grau de cultura celular. </li><li> Para preparar extrato de polifenol (10 mg / mL), pesa 10 mg de CE ou PE. Adicione 1 mL de meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) sob uma capa de cultura de células. Vortex a solução. Alíquota em porções de 200 μL e armazene a -20 ° C. </li><li> Prepare o tampão de lise. <ol><li> Adicionar 5 mL de solução de ...

<ol>
	<li>Morton, L. W., Abu-Amsha Caccetta, R., Puddey, I. B., Croft, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemistry+and+biological+effects+of+dietary+phenolic+compounds:+relevance+to+cardiovascular+disease.">Chemistry and biological effects of dietary phenolic compounds: relevance to cardiovascular disease.</a> Clin Exp Pharmacol Physiol. 27 (3), 152-159 (2000).</li><li>Sekirov, I., Russell, S. L., Antunes, L. C., Finlay, B. 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G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blackberry,+raspberry+and+black+raspberry+polyphenol+extracts+attenuate+angiotensin+II-induced+senescence+in+vascular+smooth+muscle+cells.">Blackberry, raspberry and black raspberry polyphenol extracts attenuate angiotensin II-induced senescence in vascular smooth muscle cells.</a> Food Funct. 7 (10), 4175-4187 (2016).</li><li>Pergola, C., Rossi, A., Dugo, P., Cuzzocrea, S., Sautebin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+nitric+oxide+biosynthesis+by+anthocyanin+fraction+of+blackberry+extract.">Inhibition of nitric oxide biosynthesis by anthocyanin fraction of blackberry extract.</a> Nitric Oxide. 15 (1), 30-39 (2006).</li><li>Lu, H., Li, J., Zhang, D., Stoner, G. D., Huang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+involved+in+chemoprevention+of+black+raspberry+extracts:+from+transcription+factors+to+their+target+genes.">Molecular mechanisms involved in chemoprevention of black raspberry extracts: from transcription factors to their target genes.</a> Nutr Cancer. 54 (1), 69-78 (2006).</li><li>Kim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aqueous+extract+of+unripe+Rubus+coreanus+fruit+attenuates+atherosclerosis+by+improving+blood+lipid+profile+and+inhibiting+NF-&#954;B+activation+via+phase+II+gene+expression.">Aqueous extract of unripe Rubus coreanus fruit attenuates atherosclerosis by improving blood lipid profile and inhibiting NF-&#954;B activation via phase II gene expression.</a> J Ethnopharmacol. 146 (2), 515-524 (2013).</li><li>Wang, J., Mazza, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+anthocyanins+and+other+phenolic+compounds+on+the+production+of+tumor+necrosis+factor+alpha+in+LPS/IFN-gamma-activated+RAW+264.7+macrophages.">Effects of anthocyanins and other phenolic compounds on the production of tumor necrosis factor alpha in LPS/IFN-gamma-activated RAW 264.7 macrophages.</a> J Agric Food Chem. 50 (15), 4183-4189 (2002).</li><li>Pascual-Teresa, S., Moreno, D. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyphenols+purified+from+the+Brazilian+aroeira+plant+(Schinus+terebinthifolius,+Raddi)+induce+apoptotic+and+autophagic+cell+death+of+DU145+cells.">Polyphenols purified from the Brazilian aroeira plant (Schinus terebinthifolius, Raddi) induce apoptotic and autophagic cell death of DU145 cells.</a> Anticancer Res. 26 (1A), 379-387 (2006).</li><li>Griendling, K. K., Taubman, M. B., Akers, M., Mendlowitz, M., Alexander, R. 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Os polifenóis isolados das bagas contêm composições distintas. O protocolo de extração baseado em etanol descrito aqui permitiu a identificação de diferentes níveis de ácidos fenólicos e flavonóides presentes em extratos de polifenóis brutos e purificados de BL ( Tabela 1 ). CE foi enriquecido em ácido gálico, ácido ferúlico, ácido 4-O-cafeoilquinico e ácido 5-O-cafeoilquinico. O processo de purificação não alterou significativamente os níveis de ácido gálico e ácido p-cumarico...

Os polifenóis são compostos contendo pelo menos um anel fenólico em sua estrutura e estão abundantemente presentes no reino vegetal 1 . Os seres humanos têm consumido plantas por milênios para fins medicinais sem estar ciente da existência de tais compostos 2 . Muitas frutas e vegetais têm alguns compostos polifenólicos compartilhados, embora com diferentes quantidades, incluindo flavonóides, stilbenos e ácidos fenólicos 3 . Embora os polifenóis sejam freqüentemente associados a frutas e vegetais coloridos, isso não é estritamente verdadeiro. Por exemplo, a zeaxantina e a xantina estão presentes em vegetais que não são altamente coloridos, como cebolas e alho, que são da família de cebolas e estão associados a numerosos benefícios para a saúde 4 . Além de estar associado a vários benefícios para a saúde 5 , os polifenóis também servem as plantas, protegendo-os de insetos eD radiação ultravioleta 2 . Os polifenóis são comumente encontrados na dieta humana e são considerados poderosos antioxidantes, pois eles podem evitar as espécies reativas de oxigênio (ROS) 6 , 7 , 8 . Eles também têm propriedades antiinflamatórias 9 , antimicrobianas 10 , anti-hipertensivas 11 e antitranscinogênicas 12 , 13 . Estudos epidemiológicos demonstram uma associação inversa entre o consumo de flavonóides e incidência de doença cardiovascular (DCV) 16 , 17 e mortalidade 14 , 15 . As bagas são amplamente consumidas nos EUA e possuem grandes quantidades de polifenóis, incluindo flavonóides. Por exemplo, o consumo de suco de amora (BL) (300<html> ML / d) durante oito semanas diminuiu significativamente a pressão arterial sistólica em pacientes dislipidêmicos 18 . Jeong et al. 19 relataram que homens e mulheres pré-hipertensos que consumiam 2,5 g de extrato de framboesa preta (BRB) por dia tiveram uma pressão arterial baixa de 24 horas e noite em comparação com aqueles que consumiam um placebo. As framboesas (RB) diminuíram a pressão sanguínea ao aumentar a expressão de superóxido dismutase (SOD) em ratos espontaneamente hipertensos 20 . Foi recentemente demonstrado que BL, RB e BRB reduzem os níveis de ROS e senescência induzidos pela angiotensina II (Ang II) em células musculares lisas vasculares (VSMCs) 21 . Além disso, a fração de antocianina do extracto de BL reduziu a expressão de óxido nítrico sintase induzível (iNOS) e inibiu a atividade do Fator Nuclear kappa B (NF-kB) e cinase regulada por sinal extracelular (ERK) em lipopolisacarídeos (LPS) estimulada Células J774Ass = &quot;xref&quot;&gt; 22. Os extratos de BRB diminuíram a ativação de NF-κB e a expressão de ciclooxigenase 2 (COX-2) in vitro 23 , melhoraram o perfil lipídico e impediram a formação da lesão aterosclerose em camundongos alimentados com uma dieta rica em gordura 24 . As antocianinas, que são consideradas os flavonóides mais abundantes nas bagas, modulam a resposta inflamatória em macrófagos RAW 264.7 estimulados pelo LPS ao diminuir a produção 25 do Fator de Necrose Tumoral (TNF-α) e diminuir a proliferação e migração de VSMCs 26 . Uma vez que tem crescido o interesse em compreender o papel dos polifenóis na saúde humana e na doença, é importante otimizar o método de extração. A extração de solvente é amplamente utilizada para esse propósito, pois é econômica e facilmente reprodutível. Neste estudo, utilizou-se uma extração solvente com etanol, juntamente com uma extração extraída por ultra-somN método, que foi adaptado de Kim e Lee 27 . A purificação e o fraccionamento de extratos brutos (CE) utilizando clorofórmio e acetato de etilo foram realizados para obter a fração de extrato purificado (PE) que foi adaptada de Queires et al 28 . Além disso, foram comparadas a eficácia de extratos de polifenóis em bruto contra purificado de BL na redução da fosforilação basal de ERK1 / 2 e foram apresentados exemplos representativos do efeito inibitório do extrato de polifenol BL purificado em reduções de sinalização induzidas por Ang II em VSMCs.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="971">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Angiotensin II</td>
			<td style="width:157px;">Sigma-Aldrich, Inc.</td>
			<td style="width:168px;">A9525-10MG</td>
			<td style="width:343px;">Treatment of VSMCs</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">&#946;-actin</td>
			<td style="width:157px;">Sigma-Aldrich, Inc.</td>
			<td style="width:168px;">A2228</td>
			<td>Primary antibody (1:5000)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Blackberry fruit</td>
			<td style="width:157px;">Mercer Foods</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td>Freeze-dried blackberry powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Catalase&#160;</td>
			<td style="width:157px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:168px;">219010</td>
			<td>Primary antibody (1:1000)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chloroform</td>
			<td style="width:157px;">Biotech Grd, Inc.</td>
			<td style="width:168px;">97064-678</td>
			<td>Preparation of purified polyphenol extracts</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM</td>
			<td style="width:157px;">Mediatech, Inc.</td>
			<td style="width:168px;">10-014-CV</td>
			<td>Culture of VSMCs</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethanol (absolute molecular biology grade)</td>
			<td style="width:157px;">Sigma-Aldrich, Inc.</td>
			<td style="width:168px;">E7023-500ML</td>
			<td>Preparation of polyphenol extracts&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethylacetate</td>
			<td style="width:157px;">Sigma-Aldrich, Inc.</td>
			<td style="width:168px;">439169</td>
			<td>Preparation of purified polyphenol extracts</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:303px;">ERK1/2</td>
			<td style="width:157px;">Cell Signaling Technology, Inc.</td>
			<td style="width:168px;">9102S</td>
			<td>Primary antibody (1:500)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">EDTA, 500 mM, pH 8.0</td>
			<td style="width:157px;">Teknova, Inc.</td>
			<td style="width:168px;">E0306</td>
			<td>Lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Freeze-Dryer</td>
			<td style="width:157px;">Labconco</td>
			<td style="width:168px;">VirTis Benchtop K</td>
			<td>Preparation of polyphenol extracts</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">FBS</td>
			<td style="width:157px;">Seradigm</td>
			<td style="width:168px;">1400-500</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">HEPES</td>
			<td style="width:157px;">Sigma-Aldrich, Inc.</td>
			<td style="width:168px;">H3375</td>
			<td>Lysis buffer&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">NaCl</td>
			<td style="width:157px;">EMD Millipore, Inc.</td>
			<td style="width:168px;">7760</td>
			<td>Lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">NaF</td>
			<td style="width:157px;">J.T.Baker, Inc.</td>
			<td style="width:168px;">3688-01&#160;</td>
			<td>Lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:303px;">Na3VO4</td>
			<td style="width:157px;">Sigma-Aldrich, Inc.</td>
			<td style="width:168px;">450243</td>
			<td>Lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:303px;">Na4P2O7 , decahydrate</td>
			<td style="width:157px;">Sigma-Aldrich, Inc.</td>
			<td style="width:168px;">S-9515</td>
			<td>Lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:303px;">phospho ERK1/2&#160;</td>
			<td style="width:157px;">Cell Signaling Technology, Inc.</td>
			<td style="width:168px;">9101S</td>
			<td>Primary antibody (1:1000)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protease inhibitor cocktail</td>
			<td style="width:157px;">Sigma-Aldrich, Inc.</td>
			<td style="width:168px;">P8340-5ml</td>
			<td>Lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:303px;">Protein assay dye reagent</td>
			<td style="width:157px;">Bio-Rad Laboratories, Inc.</td>
			<td style="width:168px;">500-0006</td>
			<td>Protein concentration Measurement</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">PVDF transfer membrane</td>
			<td style="width:157px;">Thermo Scientific, Inc.</td>
			<td style="width:168px;">88518</td>
			<td>Western blots</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="41" style="height:41px;width:303px;">Rotatory Evaporator</td>
			<td style="width:157px;">Buchi Labortechnik</td>
			<td style="width:168px;">Rotavapor 
			R3000</td>
			<td>Preparation of polyphenol extracts</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sterile water</td>
			<td style="width:157px;">Mediatech, Inc.</td>
			<td style="width:168px;">25-055-CV</td>
			<td>Preparation of polyphenol extracts</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Sonicator</td>
			<td style="width:157px;">QSonica, LLC</td>
			<td style="width:168px;">Q125</td>
			<td>Preparation of cell extracts</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">SOD2</td>
			<td style="width:157px;">Enzo Life Sciences, Inc.</td>
			<td style="width:168px;">ADI-SOD-110-F</td>
			<td>Primary antibody (1:1000)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Triton-X-100</td>
			<td style="width:157px;">Sigma-Aldrich, Inc.</td>
			<td style="width:168px;">X100</td>
			<td>Western blots</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Whatman #2 filter paper</td>
			<td style="width:157px;">GE Healthcare, Inc.</td>
			<td style="width:168px;">28317-241</td>
			<td>Preparation of polyphenol extracts</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extraction and purification of polyphenols from freeze-dried berry powder for the treatment of vascular smooth muscle cells in vitro

Estudos epidemiológicos indicam que o aumento da ingestão de flavonóides correlaciona-se com a diminuição da mortalidade por doenças cardiovasculares (DCV) nos Estados Unidos (EUA) e na Europa. As bagas são amplamente consumidas nos EUA e têm um alto conteúdo polifenólico. Os polifenóis demonstraram interagir com muitos alvos moleculares e exercer numerosas funções biológicas positivas, incluindo efeitos antioxidantes, anti-inflamatórios e cardioprotetores. Os polifenóis isolados do blackberry (BL), da framboesa (RB) e da framboesa preta (BRB) reduzem o estresse oxidativo e a senescência celular em resposta à angiotensina II (Ang II). Este trabalho fornece uma descrição detalhada do protocolo usado para preparar os extratos de polifenóis de bagas liofilizadas. As extracções de polifenóis a partir de pó de baga liofilizado foram realizadas utilizando 80% de etanol aquoso e um método de extração assistida por ultra-som. O extracto em bruto foi ainda purificado e fraccionado utilizando clorofórmio e acetato de etilo,respectivamente. Os efeitos de extratos brutos e purificados foram testados em células musculares lisas vasculares (VSMCs) em cultura.

Foi demonstrado anteriormente que os extratos de polifenóis isolados de BL, RB e BRB reduziram a senescência de VSMCs em resposta a Ang II 21 . Verificou-se que estes extratos de polifenóis purificados modulam a sinalização de Ang II através da redução da fosforilação de Akt, p38 Mitrogen-activated Protein Kinase (MAPK) e ERK1 / 2. BL evita a senescência ao reduzir a expressão da NADPH oxidase (Nox) 1, uma enzima que produz aniões superóxido e está ...

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Extraction and Purification of Polyphenols from Freeze-dried Berry Powder for the Treatment of Vascular Smooth Muscle Cells In Vitro

Este trabalho detalha um método passo a passo para preparar extratos ricos em polifenóis de pó de baga liofilizado. Além disso, fornece uma descrição completa de como usar esses extratos ricos em polifenóis em cultura celular na presença do hormônio peptídico angiotensina II (Ang II) usando células musculares lisas vasculares (VSMCs).

Extração e purificação de polifenóis a partir de pó de baga liofilizado para o tratamento de células musculares lisas vasculares<em&gt; In Vitro</em

Epidemiological studies indicate that increased flavonoid intake correlates with decreased mortality due to cardiovascular diseases (CVD) in the United ...

Research

JoVE Journal

Chemistry

Extraction and Purification of Polyphenols from Freeze-dried Berry Powder for the Treatment of Vascular Smooth Muscle Cells In Vitro

Rapid High Throughput Amylose Determination in Freeze Dried Potato Tuber Samples

Rápidas alto rendimento amilose Determinação em amostras liofilizadas tubérculo

This protocol describes a high through put colorimetric method that relies on the formation of a complex between iodine and chains of glucose molecules in ...

Química

Synthesis and Purification of Iodoaziridines Involving Quantitative Selection of the Optimal Stationary Phase for Chromatography

Síntese e Purificação de Iodoaziridines Envolvendo Quantitative Seleção do Optimal fase estacionária para cromatografia

The highly diastereoselective preparation of cis-N-Ts-iodoaziridines through reaction of diiodomethyllithium with N-Ts aldimines is described. ...

Supercritical Nitrogen Processing for the Purification of Reactive Porous Materials

Processamento de nitrogênio supercrítico para a purificação de Reativos Porous Materials

Supercritical fluid extraction and drying methods are well established in numerous applications for the synthesis and processing of porous materials. ...

X-ray Powder Diffraction in Conservation Science: Towards Routine Crystal Structure Determination of Corrosion Products on Heritage Art Objects

Difração de raios-X em Ciência da Conservação: Rumo a rotina determinação da estrutura cristalina de corrosão produtos na arte Heritage Objects

The crystal structure determination and refinement process of corrosion products on historic art objects using laboratory high-resolution X-ray powder ...

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

Síntese de Bioconjugados de proteínas<em&gt; via</em&gt; Química cisteína-maleimida

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the ...

A Convenient Method for Extraction and Analysis with High-Pressure Liquid Chromatography of Catecholamine Neurotransmitters and Their Metabolites

Um método conveniente para extração e análise com a cromatografia líquida de alta pressão de neurotransmissores catecolaminas e seus metabólitos

The extraction and analysis of catecholamine neurotransmitters in biological fluids is of great importance in assessing nervous system function and ...

Nanothermite with Meringue-like Morphology: From Loose Powder to Ultra-porous Objects

Nanothermite com merengue, como morfologia: de pó solto para objetos ultra porosos

The goal of the protocol described in this article is to prepare aluminothermic compositions (nanothermites) in the form of porous, monolithic objects. ...

Separation of Aldehydes and Reactive Ketones from Mixtures Using a Bisulfite Extraction Protocol

Separação de aldeídos e cetonas reativas de misturas usando um protocolo de extração de bissulfito

The purification of organic compounds is an essential component of routine synthetic operations. The ability to remove contaminants into an aqueous layer ...

Extraction of Lignin with High &#946;-O-4 Content by Mild Ethanol Extraction and Its Effect on the Depolymerization Yield

Extraction of Lignin with High ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-O-4 Content by Mild Ethanol Extraction and Its Effect on the Depolymerization Yield

Extração da lignina com alto teor de β-O-4 por extração de etanol suave e seu efeito sobre o rendimento de despolimerização

Lignin valorization strategies are a key factor for achieving more economically competitive biorefineries based on lignocellulosic biomass. Most of the ...

Synthesis and Bioconjugation of Thiol-Reactive Reagents for the Creation of Site-Selectively Modified Immunoconjugates

Síntese e Bioconjugation dos reagentes Thiol-reativa para a criação de Site-seletivamente modificado Immunoconjugates

Maleimide-bearing bifunctional probes have been employed for decades for the site-selective modification of thiols in biomolecules, especially antibodies. ...