Name: extraction and purification of polyphenols from freeze-dried berry powder for the treatment of vascular smooth muscle cells in vitro
Uploaded: 2017-07-05T14:00:00
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Este trabajo fue financiado por la Asociación Americana del Corazón (14GRNT20180028) y el Consejo de Investigación y Creatividad de la Universidad Estatal de Florida (COFRS).

1. Preparación de reactivos <ol><li> Preparar 80% de etanol (100 ml) mezclando 80 ml de etanol absoluto (grado de biología molecular) y 20 ml de agua estéril de grado de cultivo celular. </li><li> Para preparar el extracto de polifenol (10 mg / ml), pese 10 mg de CE o PE. Añadir 1 ml de medio de Eagle modificado de Dulbecco simple (DMEM) bajo una campana de cultivo celular. Vórtice la solución. Alícuota en porciones de 200 μl y guarde a -20 ° C. </li><li> Preparar buffer de lisis. <ol><li> Se añaden 5 ml de ...

<ol>
	<li>Morton, L. W., Abu-Amsha Caccetta, R., Puddey, I. B., Croft, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemistry+and+biological+effects+of+dietary+phenolic+compounds:+relevance+to+cardiovascular+disease.">Chemistry and biological effects of dietary phenolic compounds: relevance to cardiovascular disease.</a> Clin Exp Pharmacol Physiol. 27 (3), 152-159 (2000).</li><li>Sekirov, I., Russell, S. L., Antunes, L. C., Finlay, B. 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G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blackberry,+raspberry+and+black+raspberry+polyphenol+extracts+attenuate+angiotensin+II-induced+senescence+in+vascular+smooth+muscle+cells.">Blackberry, raspberry and black raspberry polyphenol extracts attenuate angiotensin II-induced senescence in vascular smooth muscle cells.</a> Food Funct. 7 (10), 4175-4187 (2016).</li><li>Pergola, C., Rossi, A., Dugo, P., Cuzzocrea, S., Sautebin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+nitric+oxide+biosynthesis+by+anthocyanin+fraction+of+blackberry+extract.">Inhibition of nitric oxide biosynthesis by anthocyanin fraction of blackberry extract.</a> Nitric Oxide. 15 (1), 30-39 (2006).</li><li>Lu, H., Li, J., Zhang, D., Stoner, G. D., Huang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+involved+in+chemoprevention+of+black+raspberry+extracts:+from+transcription+factors+to+their+target+genes.">Molecular mechanisms involved in chemoprevention of black raspberry extracts: from transcription factors to their target genes.</a> Nutr Cancer. 54 (1), 69-78 (2006).</li><li>Kim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aqueous+extract+of+unripe+Rubus+coreanus+fruit+attenuates+atherosclerosis+by+improving+blood+lipid+profile+and+inhibiting+NF-&#954;B+activation+via+phase+II+gene+expression.">Aqueous extract of unripe Rubus coreanus fruit attenuates atherosclerosis by improving blood lipid profile and inhibiting NF-&#954;B activation via phase II gene expression.</a> J Ethnopharmacol. 146 (2), 515-524 (2013).</li><li>Wang, J., Mazza, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+anthocyanins+and+other+phenolic+compounds+on+the+production+of+tumor+necrosis+factor+alpha+in+LPS/IFN-gamma-activated+RAW+264.7+macrophages.">Effects of anthocyanins and other phenolic compounds on the production of tumor necrosis factor alpha in LPS/IFN-gamma-activated RAW 264.7 macrophages.</a> J Agric Food Chem. 50 (15), 4183-4189 (2002).</li><li>Pascual-Teresa, S., Moreno, D. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyphenols+purified+from+the+Brazilian+aroeira+plant+(Schinus+terebinthifolius,+Raddi)+induce+apoptotic+and+autophagic+cell+death+of+DU145+cells.">Polyphenols purified from the Brazilian aroeira plant (Schinus terebinthifolius, Raddi) induce apoptotic and autophagic cell death of DU145 cells.</a> Anticancer Res. 26 (1A), 379-387 (2006).</li><li>Griendling, K. K., Taubman, M. B., Akers, M., Mendlowitz, M., Alexander, R. 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Los polifenoles aislados de bayas contienen composiciones distintas. El protocolo de extracción a base de etanol descrito aquí permitió la identificación de diferentes niveles de ácidos fenólicos y flavonoides presentes en los extractos de polifenoles crudos y purificados de BL ( Tabla 1 ). CE se enriqueció en ácido gálico, ácido ferúlico, ácido 4-O-cafeoilquínico y ácido 5-O-cafeoilquínico. El proceso de purificación no alteró significativamente los niveles de ácido gálico y ácido p...

Los polifenoles son compuestos que contienen al menos un anillo fenólico en su estructura y están abundantemente presentes en el reino vegetal 1 . Los seres humanos han estado consumiendo plantas durante milenios con fines medicinales sin ser conscientes de la existencia de tales compuestos 2 . Muchas frutas y verduras tienen algunos compuestos polifenólicos compartidos, aunque con diferentes cantidades, incluyendo flavonoides, estilbenos y ácidos fenólicos 3 . Aunque los polifenoles a menudo se asocian con frutas y verduras de colores, esto no es estrictamente cierto. Por ejemplo, la zeaxantina y la xantina están presentes en vegetales que no son muy coloridos, como la cebolla y el ajo, que provienen de la familia de los cebolletas y que están asociados con numerosos beneficios para la salud 4 . Aparte de estar asociado con varios beneficios para la salud [ 5] , polifenoles también sirven a las plantas mediante la protección de los insectos yD radiación ultravioleta 2 . Los polifenoles se encuentran comúnmente en la dieta humana y se consideran poderosos antioxidantes, ya que pueden eliminar especies reactivas de oxígeno (ROS) 6 , 7 , 8 . También tienen propiedades antiinflamatorias 9 , antimicrobianas 10 , antihipertensivas 11 y anti-carcinógenas 12 , 13 . Los estudios epidemiológicos demuestran una asociación inversa entre el consumo de flavonoides y la incidencia de enfermedades cardiovasculares (ECV) 16 , 17 y mortalidad 14 , 15 . Las bayas son ampliamente consumidas en los EE.UU. y tienen altas cantidades de polifenoles, incluyendo flavonoides. Por ejemplo, el consumo de jugo de zarzamora (BL) (300<html> Ml / d) durante ocho semanas disminuyó significativamente la presión arterial sistólica en pacientes dislipidémicos 18 . Jeong et al. 19 informaron que los hombres y mujeres pre-hipertensos que consumían 2,5 g de extracto de frambuesa negra (BRB) por día tenían una presión sanguínea más baja de 24 h y de noche que los que consumían un placebo. Las frambuesas (RB) disminuyeron la presión arterial mientras aumentaban la expresión de superóxido dismutasa (SOD) en ratas espontáneamente hipertensas 20 . Recientemente se ha demostrado que BL, RB y BRB reducen los niveles de ROS y senescencia inducida por la angiotensina II (Ang II) en las células musculares lisas vasculares (VSMCs) [ 21] . Además, la fracción de antocianina del extracto BL redujo la expresión de la sintasa de óxido nítrico inducible (iNOS) e inhibió la actividad de Factor Nuclear kappa B (NF-κB) y de la quinasa regulada por señal extracelular (ERK) en estimulaciones de lipopolisacárido (LPS) Células J774Ass = &quot;xref&quot;&gt; 22. Los extractos de BRB disminuyeron la expresión de la activación de NF-κB y la ciclooxigenasa 2 (COX-2) in vitro 23 , mejoraron el perfil lipídico y evitaron la formación de lesiones de aterosclerosis en ratones alimentados con una dieta rica en grasas 24 . Las antocianinas, que se consideran los flavonoides más abundantes en las bayas, modulan la respuesta inflamatoria en los macrófagos RAW 264.7 estimulados con LPS, disminuyendo la producción de factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α) 25 y disminuyendo la proliferación y migración de los VSMC 26 . Dado que ha habido un creciente interés en la comprensión del papel de los polifenoles en la salud humana y la enfermedad, es importante optimizar el método de extracción. La extracción con disolvente es ampliamente utilizada para este propósito, ya que es rentable y fácilmente reproducible. En este estudio, se utilizó una extracción con disolvente con etanol, junto con una extracción asistida por ultrasonidoN, que fue adaptado de Kim y Lee [ 27] . La purificación y fraccionamiento de extractos brutos (CE) con cloroformo y acetato de etilo se realizaron para obtener la fracción de extracto purificado (PE) que fue adaptada de Queires et al . Además, se comparó la eficacia de los extractos de polifenoles crudos versus purificados de BL en la reducción de la fosforilación basal de ERK1 / 2, y se proporcionaron ejemplos representativos del efecto inhibidor del extracto de polifenol BL purificado en las reducciones de señalización inducidas por Ang II en VSMC.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="971">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Angiotensin II</td>
			<td style="width:157px;">Sigma-Aldrich, Inc.</td>
			<td style="width:168px;">A9525-10MG</td>
			<td style="width:343px;">Treatment of VSMCs</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">&#946;-actin</td>
			<td style="width:157px;">Sigma-Aldrich, Inc.</td>
			<td style="width:168px;">A2228</td>
			<td>Primary antibody (1:5000)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Blackberry fruit</td>
			<td style="width:157px;">Mercer Foods</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td>Freeze-dried blackberry powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Catalase&#160;</td>
			<td style="width:157px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:168px;">219010</td>
			<td>Primary antibody (1:1000)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chloroform</td>
			<td style="width:157px;">Biotech Grd, Inc.</td>
			<td style="width:168px;">97064-678</td>
			<td>Preparation of purified polyphenol extracts</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM</td>
			<td style="width:157px;">Mediatech, Inc.</td>
			<td style="width:168px;">10-014-CV</td>
			<td>Culture of VSMCs</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethanol (absolute molecular biology grade)</td>
			<td style="width:157px;">Sigma-Aldrich, Inc.</td>
			<td style="width:168px;">E7023-500ML</td>
			<td>Preparation of polyphenol extracts&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethylacetate</td>
			<td style="width:157px;">Sigma-Aldrich, Inc.</td>
			<td style="width:168px;">439169</td>
			<td>Preparation of purified polyphenol extracts</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:303px;">ERK1/2</td>
			<td style="width:157px;">Cell Signaling Technology, Inc.</td>
			<td style="width:168px;">9102S</td>
			<td>Primary antibody (1:500)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">EDTA, 500 mM, pH 8.0</td>
			<td style="width:157px;">Teknova, Inc.</td>
			<td style="width:168px;">E0306</td>
			<td>Lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Freeze-Dryer</td>
			<td style="width:157px;">Labconco</td>
			<td style="width:168px;">VirTis Benchtop K</td>
			<td>Preparation of polyphenol extracts</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">FBS</td>
			<td style="width:157px;">Seradigm</td>
			<td style="width:168px;">1400-500</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">HEPES</td>
			<td style="width:157px;">Sigma-Aldrich, Inc.</td>
			<td style="width:168px;">H3375</td>
			<td>Lysis buffer&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">NaCl</td>
			<td style="width:157px;">EMD Millipore, Inc.</td>
			<td style="width:168px;">7760</td>
			<td>Lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">NaF</td>
			<td style="width:157px;">J.T.Baker, Inc.</td>
			<td style="width:168px;">3688-01&#160;</td>
			<td>Lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:303px;">Na3VO4</td>
			<td style="width:157px;">Sigma-Aldrich, Inc.</td>
			<td style="width:168px;">450243</td>
			<td>Lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:303px;">Na4P2O7 , decahydrate</td>
			<td style="width:157px;">Sigma-Aldrich, Inc.</td>
			<td style="width:168px;">S-9515</td>
			<td>Lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:303px;">phospho ERK1/2&#160;</td>
			<td style="width:157px;">Cell Signaling Technology, Inc.</td>
			<td style="width:168px;">9101S</td>
			<td>Primary antibody (1:1000)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protease inhibitor cocktail</td>
			<td style="width:157px;">Sigma-Aldrich, Inc.</td>
			<td style="width:168px;">P8340-5ml</td>
			<td>Lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:303px;">Protein assay dye reagent</td>
			<td style="width:157px;">Bio-Rad Laboratories, Inc.</td>
			<td style="width:168px;">500-0006</td>
			<td>Protein concentration Measurement</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">PVDF transfer membrane</td>
			<td style="width:157px;">Thermo Scientific, Inc.</td>
			<td style="width:168px;">88518</td>
			<td>Western blots</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="41" style="height:41px;width:303px;">Rotatory Evaporator</td>
			<td style="width:157px;">Buchi Labortechnik</td>
			<td style="width:168px;">Rotavapor 
			R3000</td>
			<td>Preparation of polyphenol extracts</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sterile water</td>
			<td style="width:157px;">Mediatech, Inc.</td>
			<td style="width:168px;">25-055-CV</td>
			<td>Preparation of polyphenol extracts</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Sonicator</td>
			<td style="width:157px;">QSonica, LLC</td>
			<td style="width:168px;">Q125</td>
			<td>Preparation of cell extracts</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">SOD2</td>
			<td style="width:157px;">Enzo Life Sciences, Inc.</td>
			<td style="width:168px;">ADI-SOD-110-F</td>
			<td>Primary antibody (1:1000)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Triton-X-100</td>
			<td style="width:157px;">Sigma-Aldrich, Inc.</td>
			<td style="width:168px;">X100</td>
			<td>Western blots</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Whatman #2 filter paper</td>
			<td style="width:157px;">GE Healthcare, Inc.</td>
			<td style="width:168px;">28317-241</td>
			<td>Preparation of polyphenol extracts</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extraction and purification of polyphenols from freeze-dried berry powder for the treatment of vascular smooth muscle cells in vitro

Los estudios epidemiológicos indican que el aumento de la ingesta de flavonoides se correlaciona con la disminución de la mortalidad por enfermedades cardiovasculares (ECV) en los Estados Unidos y Europa. Las bayas son ampliamente consumidas en los EE.UU. y tienen un alto contenido polifenólico. Se ha demostrado que los polifenoles interactúan con muchos objetivos moleculares y ejercen numerosas funciones biológicas positivas, incluyendo efectos antioxidantes, antiinflamatorios y cardioprotectores. Los polifenoles aislados de mora (BL), frambuesa (RB) y frambuesa negra (BRB) reducen el estrés oxidativo y la senescencia celular en respuesta a angiotensina II (Ang II). Este trabajo proporciona una descripción detallada del protocolo utilizado para preparar los extractos de polifenoles de las bayas liofilizadas. Las extracciones de polifenoles de polvo de bayas liofilizadas se realizaron utilizando etanol acuoso al 80% y un método de extracción asistido por ultrasonidos. El extracto bruto se purificó adicionalmente y se fraccionó usando cloroformo y acetato de etilo,respectivamente. Los efectos de los extractos crudos y purificados se ensayaron en células musculares lisas vasculares (VSMC) en cultivo.

Se ha demostrado previamente que los extractos de polifenoles aislados de BL, RB y BRB reducían la senescencia de VSMCs en respuesta a Ang II 21 . Se ha demostrado que estos extractos de polifenoles purificados modulan la señalización de Ang II mediante la reducción de la fosforilación de Akt, p38 Mitogen-Activated Protein Kinase (MAPK), y ERK1 / 2. BL previene la senescencia al reducir la expresión de la NADPH oxidasa (Nox) 1, una enzima que produce aniones...

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Extraction and Purification of Polyphenols from Freeze-dried Berry Powder for the Treatment of Vascular Smooth Muscle Cells In Vitro

Este trabajo detalla un método paso a paso para preparar extractos ricos en polifenoles de polvo de bayas liofilizadas. Además, proporciona una descripción completa de cómo usar estos extractos ricos en polifenoles en cultivo celular en presencia de la hormona peptídica angiotensina II (Ang II) usando células vasculares de músculo liso (VSMCs).

Extracción y purificación de polifenoles de polvo de baya liofilizado para el tratamiento de células musculares lisas vasculares<em&gt; In Vitro</em

Epidemiological studies indicate that increased flavonoid intake correlates with decreased mortality due to cardiovascular diseases (CVD) in the United ...

Research

JoVE Journal

Chemistry

Extraction and Purification of Polyphenols from Freeze-dried Berry Powder for the Treatment of Vascular Smooth Muscle Cells In Vitro

Rapid High Throughput Amylose Determination in Freeze Dried Potato Tuber Samples

Rápida y alto rendimiento La amilosa Determinación de Freeze Dried papa Muestras

This protocol describes a high through put colorimetric method that relies on the formation of a complex between iodine and chains of glucose molecules in ...

Investigación

Química

Synthesis and Purification of Iodoaziridines Involving Quantitative Selection of the Optimal Stationary Phase for Chromatography

Síntesis y purificación de Iodoaziridines Involucrar cuantitativa Selección de la fase estacionaria óptima para cromatografía

The highly diastereoselective preparation of cis-N-Ts-iodoaziridines through reaction of diiodomethyllithium with N-Ts aldimines is described. ...

Supercritical Nitrogen Processing for the Purification of Reactive Porous Materials

Procesamiento de nitrógeno supercrítico para la purificación de reactivos Materiales porosos

Supercritical fluid extraction and drying methods are well established in numerous applications for the synthesis and processing of porous materials. ...

X-ray Powder Diffraction in Conservation Science: Towards Routine Crystal Structure Determination of Corrosion Products on Heritage Art Objects

Difracción de polvo de rayos X en Ciencias de la Conservación: Hacia rutina de determinación de estructura cristalina de los productos de corrosión de objetos de arte del patrimonio

The crystal structure determination and refinement process of corrosion products on historic art objects using laboratory high-resolution X-ray powder ...

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

Síntesis de Proteínas bioconjugados<em&gt; vía</em&gt; Química cisteína-maleimida

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the ...

A Convenient Method for Extraction and Analysis with High-Pressure Liquid Chromatography of Catecholamine Neurotransmitters and Their Metabolites

Un método conveniente para la extracción y análisis con cromatografía líquida de alta presión de los neurotransmisores catecolaminas y sus metabolitos

The extraction and analysis of catecholamine neurotransmitters in biological fluids is of great importance in assessing nervous system function and ...

Nanothermite with Meringue-like Morphology: From Loose Powder to Ultra-porous Objects

Nanothermite con merengue-como morfología: de polvo suelto a objetos ultra porosos

The goal of the protocol described in this article is to prepare aluminothermic compositions (nanothermites) in the form of porous, monolithic objects. ...

Separation of Aldehydes and Reactive Ketones from Mixtures Using a Bisulfite Extraction Protocol

Separación de aldehidos y cetonas reactivas de mezclas mediante un protocolo de extracción de bisulfito

The purification of organic compounds is an essential component of routine synthetic operations. The ability to remove contaminants into an aqueous layer ...

Extraction of Lignin with High &#946;-O-4 Content by Mild Ethanol Extraction and Its Effect on the Depolymerization Yield

Extraction of Lignin with High ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-O-4 Content by Mild Ethanol Extraction and Its Effect on the Depolymerization Yield

Extracción de la lignina con alto contenido de β-O-4 por la extracción de etanol suave y su efecto sobre el rendimiento de despolimerización

Lignin valorization strategies are a key factor for achieving more economically competitive biorefineries based on lignocellulosic biomass. Most of the ...

Synthesis and Bioconjugation of Thiol-Reactive Reagents for the Creation of Site-Selectively Modified Immunoconjugates

Síntesis y Bioconjugation de tioles reactivos reactivos para la creación de sitio selectivamente modificados Immunoconjugates

Maleimide-bearing bifunctional probes have been employed for decades for the site-selective modification of thiols in biomolecules, especially antibodies. ...