Name: precise cellular ablation approach for modeling acute kidney injury in developing zebrafish
Uploaded: 2017-06-03T13:00:00
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신장 GFP 형질 전환 계통을 공유 한 Dr. Iain Drummond와 Vladimir Korzh 박사에게 감사드립니다. 또한 NYITCOM이이 작업을 수행하는 데 필요한 자원을 제공 한 것에 대해 감사드립니다. 이 연구의 일부는 K08DK082782, R03DK097443 (NIH) 및 HSCI Pilot Grant (AV) 보조금으로 지원되었습니다.

이 연구는 국립 보건원 (National Institutes of Health)의 실험실 동물의 관리와 사용에 관한 가이드의 권장 사항에 따라 수행되었습니다. 이 프로토콜은 정형 외과 의학 기관 동물 관리 및 사용위원회 (NYITCOM IACUC)의 NYIT 대학에서 승인되었습니다. 모든 수술과 생체 내 실험은 트리 케인 마취하에 수행되었으며 고통을 최소화하기위한 모든 노력이 이루어졌습니다. 1. 배아 확보 ?...

<ol>
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F., Traver, D., Zhu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+thrombocyte+development+in+CD41-GFP+transgenic+zebrafish.">Analysis of thrombocyte development in CD41-GFP transgenic zebrafish.</a> Blood. 106 (12), 3803-3810 (2005).</li><li>Choo, B. G., Kondrichin, I., Parinov, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+transgenic+Enhancer+TRAP+line+database+(ZETRAP).">Zebrafish transgenic Enhancer TRAP line database (ZETRAP).</a> BMC Dev Biol. 6 (1), 5 (2006).</li><li>Parinov, S., Kondrichin, I., Korzh, V., Emelyanov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tol2+transposon-mediated+enhancer+trap+to+identify+developmentally+regulated+zebrafish+genes+in+vivo.">Tol2 transposon-mediated enhancer trap to identify developmentally regulated zebrafish genes in vivo.</a> Dev Dyn. 231 (2), 449-459 (2004).</li></ol>

전체 레이저 출력은 시스템마다 다릅니다. 그러나 % GFP 광 표백을 사용하면 레이저 출력의 변화와 관계없이 형광 신장에 전달 된 총 에너지를 판독 할 수 있고 노출 시간으로 보정 할 수 있습니다. 그러나이 방법에 대한 다른 조직의 반응은 다양합니다. 신장이 성숙하는 동안에도 성숙한 유충보다 젊은 배아에서 GFP 형광을 50 % 감소시키는 것이 훨씬 더 어렵습니다. 이 프로토콜을 수정하고 다른 응...

급성 신부전으로도 불릴 수있는 급성 신부전 (AKI) 1 , 2 는 신장 기능의 급격한 손상으로 정의됩니다 3 . 이 상태에 대한 이해 수준은 수년에 걸쳐 현저하게 향상되었지만, 이환율과 사망률은 여전히 1 , 2로 높습니다. 약물 치료의 여러 임상 시험의 결과가 음성 인 4,5 인 경우, 이 상태에 대한 현재 치료법은 대부분지지 적입니다. 신장은 스스로 회복 할 수있는 능력이 있다는 점에서 독특합니다. 따라서 AKI의 조기 진단 후지지 치료가 이환율을 제한하는 최선의 방법입니다 6 . 그러나 AKI를 조기에 발견하기는 어렵고 투석을 필요로하는 환자의 경우 사망률이 50 ~ 80 %. 신장이 스스로 회복 할 수있는 능력과이 상태에 대한 치료 옵션이 없기 때문에이 nephron 재생 과정을 향상시키는 방법을 개발하는 것이 중요합니다. 부상과 동물 모델의 다른 에이전트를 포함 AKI 연구에 사용되는 많은 다른 모델이있었습니다. 신장 손상 제제 측면에서 aminoglycoside 항생제 겐타 마이신 (gentamicin)은 신 독성 제제로 사용되어 AKI 7,8 로 이어진다. 그러나 몇몇 연구팀은 겐타 마이신 치료가 제브라 피쉬 배아에게 치명적이라는 사실을 발견했다. 그것은 배아 회복을 위해 너무 심각한 관상 손상을 일으키므로 어떤 유형의 개입없이 재생 연구를 어렵게 만듭니다. 포유류 모델은 마우스 나 쥐와 마찬가지로 귀중한 것으로 여겨지지만 AKI 연구 중에는 많은 한계가 있습니다. 아마도 설치류 모델의 주된 단점은 visua에서의 어려움이다설치류 신장을 lizing하고 따라서 상피 사망 및 수리로 이어지는 정확한 spatiotemporal 과정을 결정합니다. Johnson et al. 배아 및 애벌레 제브라 피쉬 9 에서 급성 신장 손상을 유도하는 레이저 절제 기법을 발표했다. 그들은 펄스 레이저 절제를 사용하여 덱스 트란 접합체를 근육 주사 한 후 신장을 손상시켰다. dextran conjugates의 형광은 세뇨관 상피의 손상과 재생을 시각화합니다. 이 모델은 위에서 언급 한 두 가지 한계를 극복하지만, 등급이 매겨진 부상을 허용하지 않으며 대규모의 임의 세포 그룹에서 수행하기가 어렵습니다. 여기에 설명 된 AKI의 새로운 레이저 절제 기반 zebrafish 모델은 위의 모든 제한 사항을 해결합니다. 애벌레 제브라 피쉬 (zebrafish)의 전신성 신장은 성숙한 기능성 기관으로 포유류의 nephomer는 사구체, 근위 및 원위 tubules, 그리고 수집 덕트 10 . Zebrafish 유충도 광학적으로 투명하여 형광 기술을 통해 신장을 관찰 할 수 있습니다. 따라서, 제브라 피쉬는 AKI의 귀중한 생체 내 모델이고, 유생 숙주 신장 (5-12 일 - 수정 후 (dpf))은 신장 손상 및 수리에 관련된 세포 및 분자 과정을 연구하는데 사용될 수있다. 이 백서에서는 특정 녹색 형광 단백질 (GFP) 표현 네프론 세그먼트를 저에너지 (펄스 레이저 시스템과 비교)의 보라색 레이저 빛 (405 nm)을 사용하여 광 접합 할 수있는 방법을 제시합니다. GFP 형광은 세포 그룹의 표적화를 허용하여 GFP 광 표백 (photobleaching) 관찰을 통해 가시적 인 변화를 일으킨다. 또한, GFP (보라 빛을 흡수함으로써)는 GFP- 발현 신장 세포에서 상해를 강화시키는 에너지 싱크 (sink)로서 작용한다. 저속 마이크로복사본을 사용하여 복구 프로세스를 연구 할 수 있습니다. 연구에 따르면 세포 증식, 세포 이동 및 세포 상피화가 모두 11,12,13에서 신장 복구에 중요한 역할을하는 잠재적 인 과정임을 발견했습니다. 그러나 이러한 프로세스의 상대적 중요성과 상호 작용의 세부 사항은 기존 AKI 모델의 한계로 인해 밝혀 내기가 어려웠습니다. 이 새로운 접근법을 사용하여 급성 손상 후 신장 이식에서 세포 이식이 중심 역할을한다는 것을 입증 할 수 있었다.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Petri Dishes, 35 x 10mm</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>32-103</td>
			<td>Procedural Usage: Step 2.4,2.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes, 100 x 15mm</td>
			<td>Midwest Scientific</td>
			<td>910</td>
			<td>Procedural Usage: Step 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>De-chorination forceps- Electron Microscopy Sciences Dumont Tweezers 5 Dumostar</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>50-241-57</td>
			<td>Procedural Usage: Step 2.1.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Transfer Pipet</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>135030</td>
			<td>Procedural Usage: Step 2.5, 3.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A5040-25G</td>
			<td>Procedural Usage: Step 2.3, 3.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BP165-25</td>
			<td>Procedural Usage: Step 2.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pulled glass probe (manufactured manually from glass capillary tubes)</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>21-1640-2C</td>
			<td>Procedural Usage: Step 2.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ1270</td>
			<td>Procedural Usage: Step 1.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOLA Light Engine</td>
			<td>Lumencor</td>
			<td>SOLA SM-5-LCR-SB</td>
			<td>Procedural Usage: Step 1.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse C2 Plus Confocal Microscope System</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Procedural Usage: Step 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x E3 Solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Recipe used to generate: 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl 2 , 0.33 mM MgSO 4 Procedural Step Usage: 1.2, 1.3, 2.2, 2.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTU</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7629-10G</td>
			<td>Procedural Step Usage: 1.3, 2.2, 3.4, and 4.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elements Software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>C2+</td>
			<td>Procedural Usage: Step 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Unit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>MLC 400</td>
			<td>Procedural Step 3.11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4170-100MG</td>
			<td>Procedural Step Usage: 4.2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

precise cellular ablation approach for modeling acute kidney injury in developing zebrafish

급성 신부전 (AKI)은 사망률이 높은 일반적인 의학적 증상입니다. 신장의 수선 능력을 통해지지 치료 후 적절한 신장 기능을 회복시키는 것이 가능합니다. 그러나 세포 죽음을 최소화하고 재생 과정을 향상시키기 위해서는 세포 수준에서 네프론 세포의 죽음과 복구가 어떻게 발생하는지 더 잘 이해해야합니다. zebrafish pronephros는 포유류 네프론과 유사한 해부학 적 세그먼트를 포함하기 때문에이 목표를 달성하는 데 적합한 모델 시스템입니다. 이전에 물고기에서 신장 손상을 연구하는 데 사용 된 가장 일반적인 모델은 약리학 적 겐타 마이신 (gentamicin) 모델이었습니다. 그러나이 모델은 손상의 정확한 시공간 조절을 허용하지 않으므로 신장 수리와 관련된 세포 및 분자 과정을 연구하기가 어렵습니다. 이 한계를 극복하기 위해이 연구는 겐타 마이신 접근법과 달리 특정 녹색 형광 단백질 (Green Fuorescent Protein, GFP) -ex네오 프론 세그먼트를 누르는 것은 보라색 레이저 빛 (405 nm)을 사용하여 광 비화 될 수 있습니다. 이 AKI의 새로운 모델은 다른 상피 손상 방법이없는 많은 이점을 제공합니다. 주요 이점은 강력한 생체 내 동물 모델 에서 부상 수준과 정확한 시공간 조절을 &quot;다이얼&quot;할 수있는 능력입니다. 이 새로운 방법은 신장 손상 및 복구 메커니즘에 대한 이해 수준을 크게 높일 수있는 가능성이 있습니다.

이 프로토콜은 ET (krt8 : EGFP) sqet11-9, ET (krt8 : EGFP) sqet33-d10 및 Tg (atp1a1a.4 : GFP)를 비롯한 많은 신장 GFP 트랜스 제닉 라인에서 성공적으로 사용되었음을 유의하십시오. 여기에 표시된 결과는 ET (krt8 : EGFP) sqet11-9 행을 사용하여 얻은 결과입니다. 그림 1 은 광 절제 프로토콜의 예를 보여줍니다. 평균 GFP 강도는...

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Precise Cellular Ablation Approach for Modeling Acute Kidney Injury in Developing Zebrafish

이 작품은 신장 GFP 유전자 변형 제브라 피쉬를 사용하여 부분적인 신장 손상의 새로운 생체 내 모델을 제시합니다. 이 모델은 신장 상피 세포의 표적 절제를 유도하여 네프론 손상 및 수리의 세포 기작을 보여줍니다.

Zebrafish 개발에 급성 신부전 모델링을위한 정확한 세포 제거 방법

Acute Kidney Injury (AKI) is a common medical condition with a high mortality rate. With the repair abilities of the kidney, it is possible to restore ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Kidney Regeneration in Adult Zebrafish by Gentamicin Induced Injury

겐타 마이신 유도 부상으로 성인 Zebrafish의에서 신장 재생

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is ...

연구

발생학

Mechanical Vessel Injury in Zebrafish Embryos

Zebrafish의 태아에서 기계 선박 부상

Zebrafish (Danio rerio) embryos have proven to be a powerful model for studying a variety of developmental and disease processes.  External development ...

Hepatocyte-specific Ablation in Zebrafish to Study Biliary-driven Liver Regeneration

담즙 중심의 간 재생을 연구하는 Zebrafish의에서 간세포 특이 절제

The liver has a great capacity to regenerate. Hepatocytes, the parenchymal cells of the liver, can regenerate in one of two ways: hepatocyte- or ...

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

개발에 미세 주입을 대상으로 기술<em&gt; Xenopus의</em&gt; 신장

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Generation of Parabiotic Zebrafish Embryos by Surgical Fusion of Developing Blastulae

Blastulae 개발의 외과 융합에 의해 Parabiotic 제브라 피쉬 배아의 생성

Surgical parabiosis of two animals of different genetic backgrounds creates a unique scenario to study cell-intrinsic versus cell-extrinsic roles for ...

Biosensing Motor Neuron Membrane Potential in Live Zebrafish Embryos

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the ...

Surgical Ablation Assay for Studying Eye Regeneration in Planarians

수술 절제 분석 플라나리아에 아이 재생을 유학을위한

In the study of adult stem cells and regenerative mechanisms, planarian flatworms are a staple in vivo model system. This is due in large part to their ...

Histological Analyses of Acute Alcoholic Liver Injury in Zebrafish

Zebrafish에서의 급성 알코올성 간 손상의 조직 학적 분석

Alcoholic Liver Disease (ALD) refers to damage to the liver due to acute or chronic alcohol abuse. It is among the leading causes of alcohol-related ...

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

부상-유도 노화 및 골격 근육에서 프로그래밍을 Vivo에서 의 평가

Cellular senescence is a stress response that is characterized by a stable cellular growth arrest, which is important for many physiological and ...

Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

Zebrafish 초기 배아에 종양 세포 전기 활동의 시각화

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling ...