Name: precise cellular ablation approach for modeling acute kidney injury in developing zebrafish
Uploaded: 2017-06-03T13:00:00
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Gostaríamos de agradecer ao Dr. Iain Drummond e ao Dr. Vladimir Korzh por compartilhar linhas transgênicas de GFP renal. Também gostaríamos de agradecer a NYITCOM por fornecer os recursos necessários para realizar este trabalho. Este estudo foi parcialmente apoiado por subvenções: K08DK082782, R03DK097443 (NIH) e HSCI Pilot Grant (AV).

Este estudo foi realizado de acordo com as recomendações do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório dos Institutos Nacionais de Saúde. O protocolo foi aprovado pelo Comitê de Uso e Cuidados de Animais Institucionais da Universidade de NYIT College of Osteopathic Medicine (NYITCOM IACUC). Toda a cirurgia e experimentação in vivo foi realizada sob anestesia tricaína, e todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento. 1. Obtendo e mantendo embriões <o...

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C., Bollig, F., Englert, C., Hildebrandt, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+mesonephric+development+and+regeneration+using+transgenic+zebra+fish.">Characterization of mesonephric development and regeneration using transgenic zebra fish.</a> Am J Physiol. 299 (5), F1040-F1047 (2010).</li><li>Fisher, S., Grice, E. A., Vinton, R. M., Bessling, S. L., McCallion, A. 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F., Traver, D., Zhu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+thrombocyte+development+in+CD41-GFP+transgenic+zebrafish.">Analysis of thrombocyte development in CD41-GFP transgenic zebrafish.</a> Blood. 106 (12), 3803-3810 (2005).</li><li>Choo, B. G., Kondrichin, I., Parinov, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+transgenic+Enhancer+TRAP+line+database+(ZETRAP).">Zebrafish transgenic Enhancer TRAP line database (ZETRAP).</a> BMC Dev Biol. 6 (1), 5 (2006).</li><li>Parinov, S., Kondrichin, I., Korzh, V., Emelyanov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tol2+transposon-mediated+enhancer+trap+to+identify+developmentally+regulated+zebrafish+genes+in+vivo.">Tol2 transposon-mediated enhancer trap to identify developmentally regulated zebrafish genes in vivo.</a> Dev Dyn. 231 (2), 449-459 (2004).</li></ol>

Deve-se notar que a potência total do laser varia entre os sistemas. No entanto, o uso de porcentagem de fotoblocos GFP permite uma leitura da energia total entregue ao rim fluorescente, independente da variação na potência do laser e compensada pelo período de exposição. Tenha em mente, no entanto, que a resposta de diferentes tecidos a este método de fotoablação varia. Mesmo durante a maturação do rim, é significativamente mais difícil obter uma redução de 50% na fluorescência de GFP em embriões mais...

Lesão renal aguda (LRA) 1 , 2 , que também pode ser referida como insuficiência renal aguda, é amplamente definida como uma deficiência súbita na função renal 3 . Embora o nível de compreensão desta condição tenha sido melhorado notavelmente ao longo dos anos, as taxas de morbidade e mortalidade permaneceram altas 1 , 2 . O tratamento atual para esta condição é principalmente solidário, já que os resultados de vários ensaios clínicos de terapia medicamentosa foram negativos 4 , 5 . O rim é único, pois tem a capacidade de se reparar. Portanto, a terapia de suporte após um diagnóstico precoce da IRA é a melhor maneira de limitar a morbidade 6 . No entanto, é difícil detectar a IRA precoce e a taxa de mortalidade é um escalonamento de 50-80% para aqueles que necessitam de diálise 5. Com a capacidade dos rins para reparar e a falta de opções de tratamento para esta condição, é importante desenvolver métodos para melhorar este processo de regeneração de néphron. Houve muitos modelos diferentes utilizados para pesquisa de AKI que inclui diferentes agentes de lesões e modelos de animais. Em termos de agentes de danos nos rins, o antibiótico gentamicina aminoglicosídeo tem sido utilizado como agente nefrotóxico que leva a AKI 7 , 8 . No entanto, vários grupos descobriram que o tratamento com gentamicina é letal para o embrião de peixe-zebra 9 . Causa dano tubular muito grave para a recuperação do embrião, dificultando o estudo da regeneração sem algum tipo de intervenção. Os modelos de mamíferos, como o rato e o rato, também são considerados valiosos, mas enfrentam muitas limitações durante o estudo da IRA. Talvez a principal desvantagem dos modelos de roedores seja a dificuldade em visuaLizing o rim dos roedores e, assim, determinando os processos espaciotemporais precisos que levam à morte epitelial e ao reparo. Johnson et al. Relataram uma técnica baseada em ablação a laser para induzir lesão renal aguda em peixe zebra embrionário e larval 9 . Eles usaram ablação a laser pulsada para danificar o rim após uma injeção intramuscular com conjugados de dextrano. A fluorescência dos conjugados de dextrano permite a visualização de dano e regeneração no epitélio tubular 9 . Este modelo supera as duas limitações mencionadas acima, mas não permite níveis graduados de lesão e é difícil de realizar em grandes grupos de células arbitrárias. O novo modelo de AKI, descrito em ablação a laser, descrito aqui aborda todas as limitações acima. O rim pronefrico no peixe zebra larval é um órgão maduro e funcional que contém segmentos similares à nebulosa de mamíferoPhron, incluindo um glomérulo, túbulos proximais e distal, e um ducto colector 10 . As larvas de zebrafish também são opticamente transparentes, tornando possível observar o rim através de técnicas de fluorescência. Assim, o peixe-zebra é um valioso modelo in vivo de IRA, e o rim pronefrico larval (5-12 dias após a fertilização (dpf)) pode ser usado para estudar os processos celulares e moleculares envolvidos em lesão renal e reparação. Este artigo apresenta um método através do qual os segmentos de Nephron específicos de proteína fluorescente verde (GFP) podem ser fotoablados usando uma luz laser violeta de baixa energia (em comparação com um sistema de laser pulsado) (405 nm). A fluorescência GFP permite a segmentação de um grupo de células, tornando as mudanças que se tornam visíveis através da observação do fotobloco GFP. Além disso, o GFP (absorvendo a luz violeta) serve como um coletor de energia para potencializar a lesão em células renais que expressam GFP. Microfones de lapso de tempoA cópia pode então ser usada para estudar o processo de reparo. Estudos têm encontrado proliferação celular, migração celular e metaplasia celular 11 , 12 , 13 para todos ser processos potenciais que podem desempenhar um papel importante na reparação renal. No entanto, a importância relativa desses processos e os detalhes de sua interação foram difíceis de descobrir devido às limitações dos modelos existentes de AKI. Usando essa abordagem inovadora, foi possível mostrar que a migração celular desempenha um papel central no reparo renal após lesão aguda 14 .

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Petri Dishes, 35 x 10mm</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>32-103</td>
			<td>Procedural Usage: Step 2.4,2.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes, 100 x 15mm</td>
			<td>Midwest Scientific</td>
			<td>910</td>
			<td>Procedural Usage: Step 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>De-chorination forceps- Electron Microscopy Sciences Dumont Tweezers 5 Dumostar</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>50-241-57</td>
			<td>Procedural Usage: Step 2.1.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Transfer Pipet</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>135030</td>
			<td>Procedural Usage: Step 2.5, 3.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A5040-25G</td>
			<td>Procedural Usage: Step 2.3, 3.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BP165-25</td>
			<td>Procedural Usage: Step 2.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pulled glass probe (manufactured manually from glass capillary tubes)</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>21-1640-2C</td>
			<td>Procedural Usage: Step 2.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ1270</td>
			<td>Procedural Usage: Step 1.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOLA Light Engine</td>
			<td>Lumencor</td>
			<td>SOLA SM-5-LCR-SB</td>
			<td>Procedural Usage: Step 1.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse C2 Plus Confocal Microscope System</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Procedural Usage: Step 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x E3 Solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Recipe used to generate: 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl 2 , 0.33 mM MgSO 4 Procedural Step Usage: 1.2, 1.3, 2.2, 2.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTU</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7629-10G</td>
			<td>Procedural Step Usage: 1.3, 2.2, 3.4, and 4.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elements Software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>C2+</td>
			<td>Procedural Usage: Step 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Unit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>MLC 400</td>
			<td>Procedural Step 3.11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4170-100MG</td>
			<td>Procedural Step Usage: 4.2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

precise cellular ablation approach for modeling acute kidney injury in developing zebrafish

Lesão renal aguda (LRA) é uma condição médica comum com alta taxa de mortalidade. Com as habilidades de reparo do rim, é possível restaurar a função renal adequada após o tratamento de suporte. No entanto, é necessária uma melhor compreensão de como ocorre morte e reparação de células nefronas no nível celular para minimizar a morte celular e melhorar o processo regenerativo. O pronephros do peixe-zebra é um bom sistema modelo para atingir esse objetivo, pois contém segmentos anatômicos que são semelhantes à nefrona dos mamíferos. Anteriormente, o modelo mais comum usado para estudar lesão renal em peixes era o modelo farmacológico de gentamicina. No entanto, este modelo não permite um controle espaciotemporal preciso da lesão e, portanto, é difícil estudar os processos celulares e moleculares envolvidos no reparo renal. Para superar esta limitação, este trabalho apresenta um método através do qual, em contraste com a abordagem gentamicina, uma Proteína Fuorescente Verde específica (GFP) -exPressionar o segmento nephron pode ser fotoablado usando uma luz laser violeta (405 nm). Este novo modelo de AKI oferece muitas vantagens que outros métodos de lesão epitelial não possuem. Suas principais vantagens são a capacidade de &quot;marcar&quot; o nível de lesão e o controle espaciotemporal preciso no modelo robusto animal in vivo . Este novo método tem potencial para avançar significativamente o nível de compreensão dos mecanismos de lesão renal e reparação.

Observe que este protocolo foi usado com sucesso com várias linhas transgênicas de GFP renal, incluindo ET (krt8: EGFP) sqet11-9, ET (krt8: EGFP) sqet33-d10 e Tg (atp1a1a.4: GFP). Os exemplos de resultados apresentados aqui foram obtidos usando a linha ET (krt8: EGFP) sqet11-9. A Figura 1 mostra o exemplo de protocolo de fotoablação. A intensidade média de GFP é monitorada dentro da região ...

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Precise Cellular Ablation Approach for Modeling Acute Kidney Injury in Developing Zebrafish

Este trabalho apresenta um novo modelo in vivo de lesão renal segmentar usando peixe zebra transgênico GFP renal. O modelo permite a indução da ablação direcionada de células epiteliais renais para mostrar os mecanismos celulares de lesão e reparação de néphron.

Abordagem precisa de ablação celular para modelagem de lesão renal aguda no desenvolvimento de peixe-zebra

Acute Kidney Injury (AKI) is a common medical condition with a high mortality rate. With the repair abilities of the kidney, it is possible to restore ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Kidney Regeneration in Adult Zebrafish by Gentamicin Induced Injury

A regeneração renal em Zebrafish Adulto por lesão induzida pela gentamicina

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is ...

Biologia do Desenvolvimento

Mechanical Vessel Injury in Zebrafish Embryos

Lesão Vessel Mecânica em embriões Zebrafish

Zebrafish (Danio rerio) embryos have proven to be a powerful model for studying a variety of developmental and disease processes.  External development ...

Hepatocyte-specific Ablation in Zebrafish to Study Biliary-driven Liver Regeneration

Ablação específicas do hepatócito em Zebrafish para estudar a regeneração do fígado-driven biliar

The liver has a great capacity to regenerate. Hepatocytes, the parenchymal cells of the liver, can regenerate in one of two ways: hepatocyte- or ...

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Técnica ao Target microinjeção para o desenvolvimento<em&gt; Xenopus</em&gt; Kidney

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Generation of Parabiotic Zebrafish Embryos by Surgical Fusion of Developing Blastulae

Geração de parabiótica embriões Zebrafish por Fusion cirúrgica de Desenvolvimento blástulas

Surgical parabiosis of two animals of different genetic backgrounds creates a unique scenario to study cell-intrinsic versus cell-extrinsic roles for ...

Biosensing Motor Neuron Membrane Potential in Live Zebrafish Embryos

Potencial de membrana de neurônio motor biossensível em embriões vivos de peixe-zebra

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the ...

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In the study of adult stem cells and regenerative mechanisms, planarian flatworms are a staple in vivo model system. This is due in large part to their ...

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Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

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Visualização da atividade elétrica celular no Zebrafish embriões adiantados e tumores

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