Name: anatomically inspired three-dimensional micro-tissue engineered neural networks for nervous system reconstruction, modulation, and modeling
Uploaded: 2017-05-31T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Anatomically Inspired Three-dimensional Micro-tissue Engineered Neural Networks for Nervous System Reconstruction, Modulation, and Modeling at JoVE.com

Financiële steun is verstrekt door de National Institute of Health U01-NS094340 (Cullen), T32-NS043126 (Harris) en F31-NS090746 (Katiyar)), de Michael J. Fox Foundation (Therapeutische Pijpleiding Programma 9998 (Cullen) De Cullen, de National Science Foundation (DN-1321851, Struzyna en Adewole), de afdeling Veteranenzaken (RR &amp; D Merit Review # B1097-I (Cullen)), de American Association Neurologische Chirurgen en Congres van Neurologische Chirurgen (Codman Fellowship in Neurotrauma en Critical Care) (2015-2016) en het Amerikaanse Geneeskunde-onderzoeks- en materiaalkommando (# W81XWH-13-207004 (Cullen) en W81XWH-15-1- 0466 (Cullen)).

Alle procedures die dieren betreffen, werden goedgekeurd door de Institusionele Diervoeder- en Gebruikscommissies aan de Universiteit van Pennsylvania en het medisch centrum van Michael J. Crescenz Veterans Affairs en voerden zich aan de richtlijnen die zijn uiteengezet in het NIH Public Health Service Beleid inzake Humane Care and Laboratory Dieren (2015). 1. Ontwikkeling van de Agarose Hydrogel (Acellulaire Component van Micro-Tenns) <ol><li> Bereiding van de agaroseoplossing</st...

CNS letsel en ziekte resulteert typisch in het verlies of de disfunctie van de long-distance axonale pathways die de hersenverbinding omvatten, met of zonder gelijktijdige neuronale degeneratie. Dit wordt gecompenseerd door de beperkte capaciteit van het CNS om neurogenese en regeneratie te bevorderen. Ondanks het streven naar herstelstrategieën zoals groeifactor-, cel- en biomateriaalafgifte als individuele of combinatorische benaderingen, falen deze technieken tegelijkertijd niet alleen de degeneratie van neuronale c...

Een algemeen kenmerk van aandoeningen en ziekten van het centrale zenuwstelsel (CNS), zoals traumatisch hersenletsel (TBI), ruggenmergletsel (SCI), beroerte, de ziekte van Alzheimer en de ziekte van Parkinson, is de ontkoppeling van axonale wegen en neuronale cellen Verlies 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . Bijvoorbeeld, wanneer een ischemische beroerte onbehandeld wordt, wordt geschat dat axonen verloren gaan met een snelheid van 7 mijl axonen per minuut 5 . In het geval van TBI, die ongeveer 1,7 miljoen mensen elk jaar alleen in de VS ervaren, kan axonale degeneratie jaar na trauma blijven optreden, aangezien de aanvankelijke verwonding een langdurige neurodegeneratieve toestand 4 neigt. Versterking van deze schadelijke effecten, het CNS heeft een zeer beperkte capaStad voor regeneratie 1 , 7 , 8 , 9 . Na aanleiding van het letsel ontstaat een remmende omgeving die wordt gekenmerkt door een gebrek aan gerichte begeleiding naar verre doelen, de aanwezigheid van myeline geassocieerde remmers die neuritale uitgroei verhinderen en de vorming van een glialeire door reactieve astrocyten 8 , 10 , 11 , 12 . Het gliaire doet dienst als een biochemische en fysieke barrière voor regeneratie, met moleculen zoals chondroïtinesulfaatproteoglycanen die axongroei 8 , 11 belemmeren. Bovendien, hoewel neurale stamcellen zijn gevonden in het volwassen CNS, is de productie van nieuwe neuronen beperkt, aangezien consistent bewijs van neurogenese alleen is gevonden in de olfactorische bol, de hippocampaleSubgranulaire zone, het periventriculaire gebied en het centrale kanaal van het ruggenmerg 13 , 14 . Deze obstakels verhinderen het functionele herstel van verloren neuronen en witte materie architectuur als gevolg van letsel of ziekte, wat resulteert in de vaak veranderende en langdurige effecten van deze omstandigheden. Ondanks het gebrek aan regeneratieve capaciteit in het volwassen CNS, is aangetoond dat axonale regeneratie mogelijk is als adequate milieueisen worden voorgesteld aan de gastheer neuronen 15 , 16 , 17 , 18 . Onderzoekers hebben geprobeerd groeifactoren te leveren en te manipuleren ( bijv. De zenuwgroeifactor, de epidermale groeifactor, de glial-afhankelijke groeifactor en de neurotrofische factor-3) en andere begeleidingsmoleculen om de plasticiteit en axonregeneratie te stimuleren 14 , &lt;/ Sup&gt; 18 , 19 . Hoewel deze studies hebben bevestigd dat volwassen axonen in staat zijn om op groeifactoren te reageren, worden deze strategieën beperkt door de lage permeabiliteit van de bloed-hersenbarrière en de specifieke ruimtelijke en temporale gradiënten die nodig zijn om regeneratie 14 , 18 , 19 te bevorderen. Andere benaderingen zijn gebaseerd op de hyperactivatie van regeneratie gerelateerde transcriptiefactoren in CNS neuronen. Bijvoorbeeld stimuleerde overexpressie van de stat3 transcriptiefactor axonale regeneratie in de optische zenuw 20 . Desalniettemin slaan zowel de biomoleculeafgifte als de overexpressie van transcriptiefactoren in de plaats van verloren neuronale populaties. Cell-based strategieën hebben vooral betrekking op transplantatie van neurale stamcellen (NSC&#39;s) in het CNS, waarbij zij profiteren van hun capaciteit om CNS neuronen te vervangen, trofische factoren te vrijgeven,En ondersteun de pogingen op neurogenese die zich voordoen na verwonding 17 . Ondanks dit zijn er nog steeds uitdagende uitdagingen die deze aanpak verhinderen, inclusief het belemmerde vermogen van getransplanteerde neurale cellen om te overleven, integreren met de gastheer en blijven ruimtelijk beperkt tot het gewond gebied 6 , 14 , 17 , 21 . Daarnaast is de levering van cellen alleen niet in staat om de cytoarchitectuur van beschadigde of verloren axonale wegen te herstellen. Een alternatieve benadering die betrekking heeft op de problemen die cel- en drug / chemische afleverstrategieën voordoen, combineert deze benaderingen met het gebruik van biomaterialen 14 , 22 , 23 . Biomaterialen zoals hydrogelen kunnen de biochemische en fysische eigenschappen van de extracellulaire matrix (ECM) emulerenD retentie binnen het gewond gebied, en het leveren van groeifactoren en andere bioactieve moleculen met gereguleerde afgifte 22 . De aantrekkelijke kenmerken van deze biomaterialen gebaseerde strategieën hebben geleid tot bewijs van in vivo axonale regeneratie na de transplantatie van steigers naar het lesion gebied 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 . Echter, acellulaire biomaterialestrategieën vervangen geen verloren neuronale populaties; Bij gebruik als leveringsvoertuigen voor neuronale, gliale of neuronale precursorcellen, zijn biomaterialen niet in staat om axonale netwerken op lange afstand te reconstrueren. De uitdaging om een ​​aanpak te ontwikkelen die zowel de axonale wegdegeneratie als neuronale verlies in verband met CNS-letsel en ziekte bestrijkt, blijft &lt;Sup class = &quot;xref&quot;&gt; 31. Onze onderzoeksgroep heeft eerder de ontwikkeling van implanteerbare microweefselgemanipuleerde neurale netwerken (micro-TENN&#39;s) gemeld, die een type &quot;levende steiger&quot; zijn die bestaat uit neuronale cellichamen die beperkt zijn tot één of beide uiteinden van een agarose hydrogel-ECM microkolom , Met uitgelijnd axonale tracten die zich uitstrekken over het binnenste van deze driedimensionale (3D) omhulling 1 , 10 , 31 , 32 . Een van de belangrijkste verschillen tussen deze techniek en eerdere benaderingen is dat de cytoarchitectuur van micro-TENNEN volledig in vitro wordt gecreëerd en daarna 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 wordt getransplanteerd &lt;Sup class = &quot;xref&quot;&gt; 39 , 40 , 41 . In vitro fabricage biedt uitgebreide ruimtelijke en temporale controle van cellulaire fenotype en oriëntatie, mechanische / fysische eigenschappen, biochemische signalen en exogene factoren, die de integratie van deze steigers bij de gastheer na de implantatie 41 , 42 ten goede komen . Micro-Tenns zijn anatomisch geïnspireerd omdat ze neuroanatomie van de hersenen emuleren, waarbij axonale tracten worden weergegeven die vergelijkbaar zijn met die welke verschillende functionele gebieden van de hersenen gebruiken ( Figuur 1A ) 1 . Daarom kan deze strategie fysieke vervanging van verloren witte materiaalkanalen en neuronen na implantatie in een gewaarschelde regio vervangen. Deze techniek wordt ook geïnspireerd door ontwikkelingsmechanismen waarin &quot;natuurlijke levende stellingen&quot; gevormd door radiale gliale cellen en pioniers axonen fungeren als pathfinding gidsen voor celMigratie uit de subventriculaire zone en axonale uitgroei, respectievelijk 43 . Deze mechanismen worden teruggevonden in de uitgelijste axonale tracten van micro-TENNs, die leefwegen voor neurale celmigratie en axonale regeneratie kunnen voorstellen door axon-gemedieerde axonale uitgroei ( Figuur 1C ) 43 . Bovendien maakt deze strategie gebruik van synaptische integratie tussen de micro-TENN-neuronen en de inheemse schakelingen, waarbij nieuwe relais worden gevormd die kunnen bijdragen tot functioneel herstel ( Figuur 1B ) 43 . De capaciteit voor synapsvorming kan deze aanpak ook de mogelijkheid bieden om het CNS te moduleren en te reageren op gastheerweefsel volgens netwerk feedback. Optogenetisch actieve neuronen in de levende stellingen kunnen bijvoorbeeld gestimuleerd worden om gastheerneuronen te moduleren door middel van synaptische interacties ( Figuur 1D ). Daarnaast heeft de biomaterial-gebaseerde buisvormige constrUitvoering van micro-TENNs biedt een adequate omgeving voor celadhesie, groei, neurietuitbreiding en signalering, terwijl de miniatuurafmetingen van de constructen mogelijk minimaal invasieve implantatie toestaan ​​en een gedeeltelijk gesekwestreerde microomgeving voor geleidelijke integratie in de hersenen mogelijk maken. Inderdaad hebben recente publicaties het potentieel van micro-TENNEN aangetoond om neurale trajecten na implantatie in de ratbrein te nabootsen. Na stereotaxische microinjectie hebben we eerder bewijs van micro-TENN neuronale overleving, onderhoud van axonale tractarchitectuur en neurietuitbreiding in de gastheercortex tot tenminste 1 maand in vivo 10 , 31 gemeld. Bovendien gaf etikettering met synapsine histologisch bewijs van synaptische integratie met natief weefsel 10 , 31 . In het algemeen kunnen micro-TENNES uniek geschikt zijn om beschadigd te reconstrueren en te modulerenCNS door verloren neuronen te vervangen, synaptisch te integreren met gastheercircuits, herstel van verloren axonale cytoarchitectuur en, in bepaalde gevallen, het regenereren van axonen met de juiste pathfinding cues. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/55609/55609fig1.jpg" /> Figuur 1: Principes en inspiratie achter de ontwikkeling van micro-tissue engineered neurale netwerken (micro-TENNs). ( A ) Micro-Tenns nabootsen de cytoarchitectuur van de hersenverbindingen (paars), waarbij functionele afzonderlijke gebieden door middel van lange, uitgelijste axonale tracten in eenrichtingsbewerking (rood, groen) of tweerichtings (blauw) verbonden zijn. Bijvoorbeeld, micro-TENN&#39;s kunnen verloren verbindingen in corticothalamus- en nigrostriatale trajecten of in de perforante weg van de entorhinaire cortex tot de hippocampus reconstrueren (aangepast uit Struzyna et al. , 2015) 1 . ( B ) Diagram van een unidirectionaL en bidirectionele micro-TENN (respectievelijk rood en blauw) synaptisch integreren met de gastheercircuit (paars) om als een functioneel relais tussen beide uiteinden van een letsel te dienen. ( C ) Schematisch van de axonale tracten van een unidirectionele micro-TENN (groen), die dienen als een geleiding voor axon-gefaciliteerde regeneratie van host axons (paars) naar een doel waarmee de micro-TENN in wisselwerking is. ( D ) Conceptueel diagram van het gebruik van optogenetisch actieve micro-TENNS als neuromodulators, die profiteren van synaptische integratie met excitatoire of remmende neuronen (bodem). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55609/55609fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> Het huidige manuscript detaileert de methodologie die wordt gebruikt om micro-TENNEN te vervaardigen met behulp van embryonaal afgeleide cerebrale corticale neuronen. Met name kunnen micro-TENNEN worden vervaardigd met andere soorten neurale cellen. Voor exRuim, de initiële rapporten van succesvolle micro-TENN ontwikkeling gekenmerkt door dorsale root ganglion (DRG) neuronen 32 . De hydrogelmicrokolommen kunnen gegenereerd worden ( Figuur 2A ) door vloeibare agarose aan te voegen aan een op maat gemaakte, lasersnijdende cilindrische kanaalschikking of naar capillaire buizen, die beide uitgelijnd acupunctuurnaalden bevatten. De naald vormt het lumen en bepaalt de binnendiameter (ID) van de microkolom, terwijl de capillaire buis ID en de diameter van de cilinders in het lasergesneden apparaat de buitendiameter (OD) van de constructies dicteren. De OD en ID kunnen volgens de gewenste toepassing worden gekozen door respectievelijk verschillende diameters voor de inrichting / capillaire buizen en de acupunctuurnaalden te selecteren. De lengte van de microkolommen kan ook worden gevarieerd; Tot op heden hebben we de constructie van micro-TENNEN tot 20 mm lang 10 gerapporteerd en actief nog langere lengtes volgen. Na de agarose gels en de acupunctuur nEedles worden verwijderd, een ECM oplossing die in het algemeen bestaat uit type I collageen en laminine wordt toegevoegd aan het lumen van de constructen ( Figuur 2C ). De ECM-kern biedt een steiger ter ondersteuning van neuronale celadhesie en axonale uitgroei. Aanvankelijk werden primaire ratcorticale neuronen geplateerd in de microkolommen met behulp van gedissocieerde cel suspensies 10 , 31 , 32 . Deze aanpak produceerde echter niet in alle gevallen de target cytoarchitectuur, die werd gedefinieerd als de neuronale cellichamen die beperkt waren tot de uiteinden van de microkolommen, waarbij het centrale lumen bestaat uit zuivere uitgelijnd axonale tracten. Sindsdien is het gebruik van een gedwongen neuronale aggregatie methode (gebaseerd op protocols aangepast aan Ungrin et al .) Een betrouwbare en consistente fabricage van micro-TENNEN mogelijk gemaakt met de ideale structuur ( Figuur 2B ) 44 . Naast het beschrijven van de huidigeMethodologie, zal dit artikel representatieve fasecontrast- en confocale beelden van micro-TENNs tonen die de vorming van axonale tracten over de tijd tonen, evenals de gefinaliseerde doelcytoorarchitectuur. Dit manuscript zal ook uitbreiden op opmerkelijke aspecten van het protocol en de resterende uitdagingen en toekomstige aanwijzingen van de micro-TENN-technologie. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/55609/55609fig2.jpg" /> Figuur 2: Schematisch diagram van het driedimensionale micro-TENN fabricageproces. ( A ) Ontwikkeling van de agarosehydrogel: (i) Aanvankelijk wordt een kleine acupunctuurnaald ( bijv . 180-350 μm in diameter) in de cilindrische kanalen van een op maat gemaakte, lasergesneden vorm of een kapillair buis geplaatst ( bijv. , Diameter 380-700 μm). In de volgende stap wordt vloeibare agarose in DPBS geïntroduceerd in de cilindrische kanalen of capillaire buizen. (Ii) Na de agarosegels wordt de naald verwijderd enDe vorm wordt gedemonteerd om de holle agarose microkolommen te geven. (Iii) Deze constructies worden dan gesteriliseerd en opgeslagen in DPBS. ( B ) Primaire neuroncultuur en de aggregaatmethode: (i) Neuronale aggregatie wordt uitgevoerd in pyramidale micro-well arrays, gegoten uit 3D-gedrukte schimmels, die passen in de putjes van een 12-wells kweekplaat. (Ii) Micro-TENNs omvatten primaire ratneuronen die zijn losgelaten van foetale hersenen van embryonale-dag-18 ratten. Na afloop van weefseldissociatie met trypsine-EDTA en DNase I wordt een celoplossing met een dichtheid van 1,0-2,0 x 106 cellen / ml bereid. (Iii) 12 μl van deze oplossing worden overgebracht naar elke put in de pyramidale micro-put-array. De plaat die deze microputjes bevat, wordt gecentrifugeerd om celaggregaten te produceren. (Iv) Deze worden vervolgens overnacht geïncubeerd voorafgaand aan plating in de microkolommen. ( C ) ECM-kernfabrikatie en celzaden: (i) Vóór het zaaien van een cel, een ECM-oplossing die 1 mg / ml type I collageen en 1 mg / ml bevatLaminine wordt overgebracht naar het interieur van de micro-TENNEN en mag polymeriseren. (Ii) Afhankelijk van de vraag of unidirectionele of bidirectionele micro-TENNEN worden vervaardigd, wordt een aggregaat geplaatst op respectievelijk één of beide uitersten van de microkolom. Iii) Na een periode van incubatie om adhesie te bevorderen, worden micro-TENNEN gekweekt in Petri-schalen die zijn overspoeld met aangevulde embryonale neuronale basale media. Iv) Na 3-5 dagen in de cultuur, moet de uiteindelijke micro-TENN-structuur celaggregaten aantonen bij de uitersten van de microkolom, met axonale tracten die zijn lengte overspannen. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55609/55609fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1571">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Laser cutter</td>
			<td style="width:195px;">Universal Laser Systems</td>
			<td style="width:119px;">PLS4.75</td>
			<td style="width:944px;">Used to fabricate the laser-cut micro-channel mold.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Laser-cut micro-column fabrication device</td>
			<td style="width:195px;">Custom-made</td>
			<td style="width:119px;">--------------</td>
			<td>Contact our research group if interested. Dimensions and blueprints provided in the manuscript.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Screws</td>
			<td style="width:195px;">--------------</td>
			<td style="width:119px;">--------------</td>
			<td>#4-40 with a thread diameter of 3.05 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Nuts</td>
			<td style="width:195px;">--------------</td>
			<td style="width:119px;">--------------</td>
			<td>#4-40 with a thread diameter of 3.05 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Acupuncture needle (180 &#181;m diameter)</td>
			<td style="width:195px;">Lhasa Medical</td>
			<td>sj.16X40</td>
			<td>The diameter may be varied according to the desired size for the micro-column lumen.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Petri dish</td>
			<td style="width:195px;">Fisher</td>
			<td>08772B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline (DPBS)</td>
			<td style="width:195px;">Invitrogen</td>
			<td>14200075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Polystyrene disposable serological pipet</td>
			<td style="width:195px;">Fisher</td>
			<td>13-678-11D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9539-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Capillary tube (398 &#181;m diameter)</td>
			<td style="width:195px;">Fisher</td>
			<td>21170D</td>
			<td>The diameter may be varied according to the desired size for the micro-column shell.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Hot plate</td>
			<td style="width:195px;">Fisher</td>
			<td>SP88857200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Magnetic bar</td>
			<td style="width:195px;">Fisher</td>
			<td>1451352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Micropipette</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td>Z683884-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">25 mm gauge needle</td>
			<td style="width:195px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">14-826-49</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Microscalpel</td>
			<td style="width:195px;">Roboz Surgical</td>
			<td>RS-6270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Scissors</td>
			<td style="width:195px;">Fine Science Tools</td>
			<td>14081-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Hot bead sterilizer</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td>Z378550-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Stereoscope</td>
			<td style="width:195px;">Nikon</td>
			<td>SMZ800N</td>
			<td>Used for all dissection steps and for micro-TENN fabrication.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Rat tail type I collagen</td>
			<td style="width:195px;">Corning</td>
			<td>354236</td>
			<td>Maintain at 4 &#186;C and remove only when needed.&#160; Use ice to preserve its temperature when in use.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Microcentrifuge tube</td>
			<td style="width:195px;">Fisher</td>
			<td>02-681-256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Mouse laminin</td>
			<td style="width:195px;">Corning</td>
			<td>354232</td>
			<td>Maintain at 4 &#186;C and remove only when needed.&#160; Use ice to preserve its temperature when in use.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Neurobasal medium</td>
			<td style="width:195px;">Invitrogen</td>
			<td>21103049</td>
			<td>Basal medium for the culture of pre-natal and embryonic neuronal cells. Store at 4&#186;C and warm at 37 &#186;C before use.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td style="width:195px;">Fisher</td>
			<td>SS2661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Hydrochloric acid (HCl)</td>
			<td style="width:195px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">SA48-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Litmus paper</td>
			<td style="width:195px;">Fisher</td>
			<td>09-876-18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Hank&#39;s balanced salt solution (HBSS)</td>
			<td style="width:195px;">Invitrogen</td>
			<td>14170112</td>
			<td>Store at 4 &#186;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">0.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:195px;">Invitrogen</td>
			<td>25200056</td>
			<td>Store at -20 &#186;C and warm at 37 &#186;C before use.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:315px;">Bovine pancreatic deoxyribonuclease (DNase) I</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td>10104159001</td>
			<td>Store at -20 &#186;C and warm at 37 &#186;C before use.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">B-27 Supplement</td>
			<td style="width:195px;">Invitrogen</td>
			<td>12587010</td>
			<td>Supplement added to Neurobasal medium for the culture of hippocampal and cortical neurons. Store at -20 &#186;C and warm at 37 &#186;C before use.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">L-glutamine&#160;</td>
			<td style="width:195px;">Invitrogen</td>
			<td>35050061</td>
			<td>Store at -20 &#186;C and warm at 37 &#186;C before use.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Sprague Dawley embryonic day 18 rats</td>
			<td style="width:195px;">Charles River</td>
			<td style="width:119px;">Strain 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Pasteur pipette</td>
			<td style="width:195px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">22-042816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">15 mL centrifuge tube</td>
			<td style="width:195px;">EMESCO</td>
			<td>1194-352099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Vortex</td>
			<td style="width:195px;">Fisher</td>
			<td>02-215-414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:195px;">Fisher</td>
			<td>05-413-115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Hemocytometer</td>
			<td style="width:195px;">Fisher</td>
			<td>02-671-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Objet30 3D-Printer</td>
			<td style="width:195px;">Stratasys&#160;</td>
			<td>--------------</td>
			<td>Used to fabricate the pyramidal micro-well molds.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">3D-printed pyramidal well mold</td>
			<td style="width:195px;">Custom-made</td>
			<td style="width:119px;">--------------</td>
			<td>Contact our research group if interested. Dimensions and blueprints provided in the manuscript.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:315px;">Polydimethylsiloxane (PDMS) and curing agent</td>
			<td style="width:195px;">Fisher</td>
			<td>NC9285739</td>
			<td>Comes as kit with elastomer and curing agent. Use inside a chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Funnel</td>
			<td style="width:195px;">Fisher</td>
			<td>10-348C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">1 ml pipette bulb</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td>Z509035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Micro-spatula</td>
			<td style="width:195px;">Fisher</td>
			<td>S50821</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">12-well culture plate</td>
			<td style="width:195px;">EMESCO</td>
			<td>1194-353043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Oven</td>
			<td style="width:195px;">Fisher</td>
			<td>11-475-154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Incubator</td>
			<td style="width:195px;">Fisher</td>
			<td>13 998 076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AAV1.Syn.GCaMP6f.WPRE.SV40</td>
			<td style="width:195px;">UPenn Vector Core</td>
			<td style="width:119px;">36373</td>
			<td>Store at -80&#186;C. Commercially available adeno-associated virus (AAV) with the GCaMP6f calcium indicator.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Formaldehyde 40%</td>
			<td style="width:195px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">F77P-4</td>
			<td>Formaldehyde is a toxic compound known to be carcinogenic, and must be disposed of in a separate container.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T8787</td>
			<td>Non-ionic surfactant used to permeabilize cell membranes.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Horse serum</td>
			<td style="width:195px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">16050-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:315px;">Mouse anti-Tuj-1/beta-III tubulin primary antibody</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td>T8578-200UL</td>
			<td>Store at -20&#186;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Rabbit anti-synapsin 1 primary antibody</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>106-001</td>
			<td>Store at -20&#186;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Donkey anti-mouse 568 secondary antibody</td>
			<td style="width:195px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">A10037</td>
			<td>Store at 4&#186;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Donkey anti-rabbit 488 secondary antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21206</td>
			<td>Store at 4&#186;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hoechst 33342, Trihydrochloride</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H3570</td>
			<td>Store at 4&#186;C.&#160; Hoechst is a known mutagen that should be treated as a carcinogen.&#160; Therefore, it must be disposed of in a separate container.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">A1RSI Laser Scanning Confocal Microscope&#160;</td>
			<td style="width:195px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">--------------</td>
			<td>Used for taking the confocal reconstructions of immunolabeled constructs.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Eclipse Ti-S Microscope&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td style="width:119px;">--------------</td>
			<td>Used for taking the phase-contrast images.&#160; With digital image acquisition using a QiClick camera interfaced with Nikon Elements Basic Research software (4.10.01).</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">High-speed Fluorescence Microscope</td>
			<td style="width:195px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">--------------</td>
			<td>Nikon Eclipse Ti microscope paired with an ANDOR Neo/Zyla camera for calcium imaging.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NIS Elements AR 4.50.00 Software</td>
			<td style="width:195px;">Nikon Instruments</td>
			<td style="width:119px;">--------------</td>
			<td>Used to identify calcium transients from the recordings taken with the high-speed fluorescence microscope.&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

anatomically inspired three-dimensional micro-tissue engineered neural networks for nervous system reconstruction, modulation, and modeling

Functioneel herstel komt zelden voor als gevolg van letsel of door de ziekte veroorzaakte degeneratie in het centrale zenuwstelsel (CNS) door de remmende omgeving en de beperkte capaciteit voor neurogenese. We ontwikkelen een strategie om tegelijkertijd neuronale en axonale wegverlies in het beschadigde CNS aan te pakken. Dit manuscript presenteert het fabricageprotocol voor microweefselgemanipuleerde neurale netwerken (micro-TENNs), implanteerbare constructen bestaande uit neuronen en uitgelijnd axonale tracten die het extracellulaire matrix (ECM) lumen van een voorgevormde hydrogelcilinder overspannen, honderden micron in diameter die centimeter kunnen verlengen in lengte. Neuronale aggregaten zijn afgebakend aan de extremen van de driedimensionale omhulling en worden gespannen door axonale projecties. Micro-Tenns zijn uniek gepositioneerd als een strategie voor de reconstructie van het CNS, waarbij aspecten van de hersenbindende cytoarchitectuur worden geïmplementeerd en mogelijk middelen voor netwerkvervanging bieden. De neuRonale aggregaten kunnen samenvallen met gastheerweefsel om nieuwe functionele relais te vormen voor het herstellen en / of moduleren van ontbrekende of beschadigde schakelingen. Deze constructen kunnen ook fungeren als pro-regeneratieve &quot;living scaffolds&quot; die ontwikkelingsmechanismen voor celmigratie en axonale pathfinding kunnen exploiteren, die synergistische structurele en oplosbare signalen op basis van de staat van regeneratie verschaffen. Micro-Tenns worden vervaardigd door vloeibare hydrogel te gieten in een cilindrische vorm die een longitudinale centreerde naald bevat. Zodra de hydrogel gelegerd is, wordt de naald verwijderd, waardoor een holle microkolom wordt gelaten. Een ECM oplossing wordt toegevoegd aan het lumen om een ​​omgeving te verschaffen die geschikt is voor neuronale hechting en axonale uitgroei. Gedissocieerde neuronen worden mechanisch geaggregeerd voor precies zaaien in één of beide uiteinden van de microkolom. Deze methodologie produceert betrouwbaar zelfstandige miniatuurconstructen met langwerpige axonale tracten die de kenmerken van hersenneuranatomie kunnen herkapituleren. Synaptische immNiet-etiketterende en genetisch gecodeerde calciumindicatoren suggereren dat micro-TENN&#39;s uitgebreide synaptische verdeling en intrinsieke elektrische activiteit bezitten. Bijgevolg vormen micro-TENNEN een veelbelovende strategie voor gerichte neurochirurgische reconstructie van hersenwegen en kunnen ook worden toegepast als biofidelische modellen om neurobiologische verschijnselen in vitro te bestuderen.

Micro-TENN&#39;s werden gecontroleerd met behulp van fase-contrast microscopie om hun cytoarchitectuur en axonale uitgroei te beoordelen ( Figuur 4 ). Binnen unidirectionele 2 mm lange micro-TENNEN werden neuronale aggregaten beperkt tot het ene uiteinde van de microkolom en geprojecteerd een bundel axonen door de binnenste kern. Axons strekte de volledige lengte van de kolom door 5 dagen in vitro (DIV) ( Figuur 4A ). Er was een grotere aanvanke...

Watch this Scientific Journal Video about Anatomically Inspired Three-dimensional Micro-tissue Engineered Neural Networks for Nervous System Reconstruction, Modulation, and Modeling at JoVE.com

Anatomically Inspired Three-dimensional Micro-tissue Engineered Neural Networks for Nervous System Reconstruction, Modulation, and Modeling

Dit manuscript bevat informatie over de fabricage van micro-tissue-gemanipuleerde neurale netwerken: driedimensionale micron-grootte constructies die bestaan ​​uit lange uitgelijnd axonale tracten die de geaggregeerde neuronale populatie (n) in een buisvormige hydrogel bekleden. Deze levende steigers kunnen dienen als functionele relais om neurale circuits te reconstrueren of te moduleren of als biofidelische testbedden die grijze-witte materie-neuroanatomie nabootsen.

Anatomisch Geïnspireerde Driedimensionale Microweefsel Geanimeerde Neurale Netwerken voor Nervous System Reconstructie, Modulatie en Modellering

Functional recovery rarely occurs&#160;following injury or disease-induced degeneration within the central nervous system (CNS)&#160;due to the inhibitory ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Designing and Implementing Nervous System Simulations on LEGO Robots

Ontwerpen en implementeren van het zenuwstelsel Simulaties op LEGO Robots

We present a method to use the commercially available LEGO Mindstorms NXT robotics platform to test systems level neuroscience hypotheses. The first step ...

Neural Circuit Recording from an Intact Cockroach Nervous System

Neurale Opnemen vanaf een Intact Cockroach zenuwstelsel

The cockroach ventral nerve cord preparation is a tractable system for neuroethology experiments, neural network modeling, and testing the physiological ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

In vivo optogenetische Stimulatie van de knaagdieren centrale zenuwstelsel

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Modeling Astrocytoma Pathogenesis In Vitro and In Vivo Using Cortical Astrocytes or Neural Stem Cells from Conditional, Genetically Engineered Mice

Modeling Astrocytoma Pathogenesis In Vitro and In Vivo Using Cortical Astrocytes or Neural Stem Cells from Conditional, Genetically Engineered Mice

Modeling Astrocytoom Pathogenese<em&gt; In Vitro</em&gt; En<em&gt; In Vivo</em&gt; Met behulp van corticale Astrocyten of neurale stamcellen uit Conditional, genetisch gemanipuleerde muizen

Current astrocytoma models are limited in their ability to define the roles of oncogenic mutations in specific brain cell types during disease ...

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

In Vitro Modellering van kanker zoals Neurale Invasion: De dorsale wortel ganglion Model

One way that solid tumors disseminate is through neural invasion. This route is well-known in cancers of the head and neck, prostate, and pancreas. These ...

Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

Protocol voor drie-dimensionale confocale Morfometrische Analyse van Astrocytes

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify ...

Quadruple Immunostaining of the Olfactory Bulb for Visualization of Olfactory Sensory Axon Molecular Identity Codes

Viervoudige Immunostaining van de Olfactorische Lamp voor Visualisatie van Olfactorische Sensorische Axon Moleculaire Identiteitscodes

The mouse olfactory system is often used to study mechanisms of neural circuit formation&#12288;because of its simple anatomical structure. An Olfactory ...

Simultaneous Recordings of Cortical Local Field Potentials, Electrocardiogram, Electromyogram, and Breathing Rhythm from a Freely Moving Rat

Gelijktijdige opnamen van corticale lokale veld Potentials, elektrocardiogram Electromyogram en ademhaling ritme van een vrij bewegende Rat

Monitoring the physiological dynamics of the brain and peripheral tissues is necessary for addressing a number of questions about how the brain controls ...

Three-Dimensional Shape Modeling and Analysis of Brain Structures

Driedimensionale vorm modellering en analyse van Hersenstructuren

Statistical shape analysis of brain structures has been used to investigate the association between their structural changes and pathological processes. ...

Transplantation of Chemogenetically Engineered Cortical Interneuron Progenitors into Early Postnatal Mouse Brains

Transplantatie van Chemogenetisch gemanipuleerde corticale Interneuron progenitors in vroege postnatale Muizenhersenen

Neuronal development is regulated by a complex combination of environmental and genetic factors. Assessing the relative contribution of each component is ...