Name: anatomically inspired three-dimensional micro-tissue engineered neural networks for nervous system reconstruction, modulation, and modeling
Uploaded: 2017-05-31T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Anatomically Inspired Three-dimensional Micro-tissue Engineered Neural Networks for Nervous System Reconstruction, Modulation, and Modeling at JoVE.com

Finansiellt stöd tillhandahölls av National Institute of Health U01-NS094340 (Cullen), T32-NS043126 (Harris) och F31-NS090746 (Katiyar)), Michael J. Fox Foundation (Therapeutic Pipeline Program # 9998 (Cullen) Penny Medicine Neuroscience Center Pilot Award (Cullen), National Science Foundation (forskarutbildning stipendier DGE-1321851 (Struzyna och Adewole)), Veteransfrågor (RR &amp; D Merit Review # B1097-I (Cullen)), American Association Neurologiska kirurger och kongress för neurologiska kirurger (Codman Society of Neurotrauma och Critical Care, 2015-2016) och US Army Medical Research and Materials Command (# W81XWH-13-207004 (Cullen) och W81XWH-15-1- 0466 (Cullen)).

Alla förfaranden som involverar djur godkändes av institutionella djurvårds- och användarkommittéer vid University of Pennsylvania och Michael J. Crescenz Veterans Affairs Medical Center och följde de riktlinjer som anges i NIH: s folkhälso-servicepolicy om humanvård och användning av laboratorium Djur (2015). 1. Utveckling av agaroshydrogelen (acellulär komponent av mikro-TENN) <ol><li> Agaroslösningspreparat <ol><li> Inom ett biosäkerhetsskåp skapar man rese...

CNS-skada och sjukdom resulterar typiskt i förlust eller dysfunktion hos de långväga axonala vägarna som innefattar hjärnans anslutning, med eller utan samtidig neuronal degenerering. Detta förhöjs av den begränsade kapaciteten hos CNS för att främja neurogenes och regenerering. Trots strävan efter reparationsstrategier, såsom tillväxtfaktor, cell- och biomaterialleverans som individuella eller kombinatoriska tillvägagångssätt, misslyckas dessa tekniker samtidigt för att ta hänsyn till både degenerati...

En vanlig egenskap hos störningar och sjukdomar i centrala nervsystemet (CNS), såsom traumatisk hjärnskada (TBI), ryggmärgsskada (SCI), stroke, Alzheimers sjukdom och Parkinsons sjukdom är avbrytandet av axonala vägar och neuronal cell Förlust 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . När exempelvis en ischemisk stroke går obehandlad uppskattas det att axoner förloras med en hastighet av 7 miles axon per minut 5 . När det gäller TBI, som ungefär 1,7 miljoner människor upplever varje år i USA ensam, kan axonal degeneration fortsätta att inträffa år efter trauma, eftersom den initiala skaden utfäller ett långtids neurodegenerativt tillstånd 4 . Försvårande av dessa skadliga effekter har CNS en kraftigt begränsad capaStad för regenerering 1 , 7 , 8 , 9 . Efter skada utvecklas en hämmande miljö som kännetecknas av brist på riktad vägledning till avlägsna mål, närvaron av myelinhämmande hämmare som hindrar neuritutväxten och bildandet av ett glialär av reaktiva astrocyter 8 , 10 , 11 , 12 . Glialärret tjänar som en biokemisk och fysisk barriär mot regenerering, med molekyler som kondroitinsulfatproteoglykaner som hindrar axonutväxten 8 , 11 . Dessutom, även om neurala stamceller har hittats i vuxna CNS, är produktionen av nya neuroner begränsad, eftersom konsekventa bevis på neurogenes endast har hittats i luktlampan, den hippocampalaSubgranulär zon, periventrikulärt område och ryggmärgs 13 , 14 centrala kanal. Dessa hinder hindrar funktionell återhämtning av förlorade neuroner och vit materia arkitektur efter skada eller sjukdom, vilket resulterar i de ofta livsförändrande och långvariga effekterna av dessa tillstånd. Trots bristen på regenerativ kapacitet hos vuxna CNS har det visat sig att axonal regenerering är möjlig om adekvata miljöanpassningar presenteras för värdvärdena neuroner 15 , 16 , 17 , 18 . Forskare har försökt leverera och manipulera tillväxtfaktorer ( t.ex. nervtillväxtfaktor, epidermal tillväxtfaktor, glialberoende tillväxtfaktor och neurotrofisk faktor-3) och andra vägledningsmolekyler för att stimulera plasticitet och axonregenerering 14 , &lt;/ Sup&gt; 18 , 19 . Trots att dessa studier har bekräftat att vuxna axoner är kapabla att reagera på tillväxtfaktorer begränsas dessa strategier av lågt permeabilitet hos blod-hjärnbarriären och de specifika rumsliga och temporala gradienterna som krävs för att främja regenerering 14 , 18 , 19 . Andra tillvägagångssätt har åberopat hyperaktivering av regenerationsrelaterade transkriptionsfaktorer i CNS-neuroner. Till exempel stimulerade överuttryck av stat3-transkriptionsfaktorn axonal regenerering i optisk nerv 20 . Ändå misslyckas både biomolekylavgivning och överuttryck av transkriptionsfaktorer att ersätta förlorade neuronpopulationer. Cellbaserade strategier har huvudsakligen koncentrerat sig på transplantation av neurala stamceller (NSC) i CNS, med fördel av deras förmåga att ersätta CNS-neuroner, frigöra trofiska faktorer,Och stödja försöken på neurogenes som uppträder efter skada 17 . Trots detta finns det fortfarande pressande utmaningar som hindrar detta tillvägagångssätt, inklusive de transplanterade neurala cellernas hämmade förmåga att överleva, integrera med värden och förbli spatialt begränsad till det skadade området 6 , 14 , 17 , 21 . Dessutom är celltillförsel enbart oförmögen att återinföra cytoarkitekturen av skadade eller förlorade axonala vägar. Ett alternativt tillvägagångssätt som behandlar problemen med cell- och läkemedels- och kemikalieleveransstrategier är att kombinera dessa metoder med användningen av biomaterial 14 , 22 , 23 . Biomaterial som hydrogeler kan emulera de biokemiska och fysikaliska egenskaperna hos den extracellulära matrisen (ECM), som hjälper till vid celltillförsel enD retention inom det skadade området och leverera tillväxtfaktorer och andra bioaktiva molekyler med kontrollerat frisättning 22 . De attraktiva egenskaperna hos dessa biomaterialbaserade strategier har resulterat i bevis på in vivo axonal regenerering efter transplantation av byggnadsställningar till det belastade området 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 . Emellertid ersätter acellulära biomaterialstrategier inte förlorade neuronala populationer; När de används som leveransfordon för neuron-, glial- eller neuronprekursorceller, är biomaterialen inte kapabla att rekonstituera axonala nätverk på lång avstånd. Utmaningen att utveckla ett tillvägagångssätt som tacklar både den axonala vävnadsdegenerationen och neuronförlusten i samband med CNS-skada och sjukdom kvarstår &lt;Sup class = &quot;xref&quot;&gt; 31. Vår forskningsgrupp rapporterade tidigare utvecklingen av implanterbara mikrovågsmetallerade neurala nätverk (mikro-TENN), som är en typ av &quot;levnadsställare&quot; som består av neuroncellceller som är bundna till en eller båda ändarna av en agaroshydrogel-ECM-mikrokolonn , Med orienterade axonala kanaler som sträcker sig genom det inre av denna tredimensionella (3D) inneslutning 1 , 10 , 31 , 32 . En av de största skillnaderna mellan denna teknik och tidigare tillvägagångssätt är att cytoarkitekturen av mikro-TENN är skapad helt in vitro och transplanteras efteråt 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 , &lt;Sup class = &quot;xref&quot;&gt; 39 , 40 , 41 . In vitro- tillverkning erbjuder omfattande rumslig och tidsmässig kontroll av cellulär fenotyp och orientering, mekaniska / fysikaliska egenskaper, biokemiska signaler och exogena faktorer, vilket gynnar integrationen av dessa byggnadsställningar med värden efter implantationen 41 , 42 . Mikro-Tenn är anatomiskt inspirerade eftersom de emulerar neuroanatomi i hjärnan, som visar axonala områden som liknar de som överbryggar distinkta funktionella regioner i hjärnan ( Figur 1A ) 1 . Därför kan denna strategi kunna fysiskt ersätta förlorade vita substansområden och neuroner efter implantation till en belastad region. Denna teknik är också inspirerad av utvecklingsmekanismer där &quot;naturliga levnadsställningar&quot; som bildas av radiella glialceller och banbrytande axoner fungerar som vägleder guider för cellMigration från subventrikulär zon och axonal utväxt, respektive 43 . Dessa mekanismer återfinns i de anpassade axonala områdena av mikro-TENN, som kan presentera levande vägar för neural cellmigration och axonal regenerering genom axonmedierad axonal utväxt ( Figur 1C ) 43 . Vidare utnyttjar denna strategi synaptisk integration mellan mikro-TENN-neuronerna och de inhemska kretsarna, som bildar nya reläer som kan bidra till funktionell återhämtning ( Figur 1B ) 43 . Kapaciteten för synapsbildning kan också ge detta tillvägagångssätt förmågan att modulera CNS och reagera på värdvävnad enligt nätverksåterkoppling. Till exempel kan optogenetiskt aktiva neuroner i de levande ställningarna stimuleras för att modulera värdneuroner genom synaptiska interaktioner ( Figur 1D ). Dessutom är den biomaterialbaserade rörformigaUgn av mikro-TENN erbjuder en lämplig miljö för celladhesion, tillväxt, neuritillägg och signalering, medan konstruktionens miniatyrdimensioner möjliggör minimalt invasiv implantering och ger en delvis sekvestrerad mikromiljö för gradvis integration i hjärnan. Faktum är att senaste publikationer har visat potentialen hos mikro-tenn att efterlikna neurala vägar efter implantation i råtthjärnan. Efter stereotaxisk mikroinjektion rapporterade vi tidigare bevis på mikro-TENN-neuronal överlevnad, underhåll av axonaltraktionsarkitektur och neuritillförsel i värdcortexen till minst 1 månad in vivo 10 , 31 . Vidare gav märkning med synapsin histologiska bevis på synaptisk integration med nativ vävnad 10 , 31 . Sammantaget kan mikro-tenn vara unikt anpassade för att rekonstruera och modulera skadadeCNS genom att ersätta förlorade neuroner, synaptiskt integrera med värdkretsen, återställa förlorad axonal cytoarkitektur och, i vissa fall, tillhandahålla regenererande axoner med lämpliga sökvägsljus. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/55609/55609fig1.jpg" /> Figur 1: Principer och inspiration bakom utvecklingen av mikrovävnadstekniska neurala nätverk (mikro-TENN). ( A ) Micro-TENNs efterliknar cytoarkitekturen i hjärnans anslutning (lila), i vilken funktionellt distinkta regioner är kopplade med långa, inriktade axonala områden i enriktad (röd, grön) eller dubbelriktad (blå) väg. Till exempel kan mikro-tenn rekonstruera förlorade förbindelser i kortikotalamiska och nigrostriatala vägar eller i perforantvägen från entorhinal cortex till hippocampus (anpassad från Struzyna et al. , 2015) 1 . ( B ) Diagram över en enhetlig riktningL och dubbelriktad mikro-TENN (röd respektive blå) synaptiskt integrera med värdkretsen (lila) för att fungera som ett funktionellt relä mellan båda ändarna av en lesion. ( C ) Schematisk av axonaltraktionerna i en enriktad mikro-TENN (grön) som tjänar som en vägledning för axon-underlättad regenerering av värdaxoner (lila) mot ett mål som mikro-TENN interagerar med. ( D ) Konceptuellt diagram över användningen av optogenetiskt aktiva mikro-TENNS som neuromodulatorer, utnyttja synaptisk integration med excitatoriska eller hämmande neuroner (botten). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55609/55609fig1large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.</a> Det nuvarande manuskriptet beskriver den metod som används för att tillverka mikro-TENN med användning av embryonellt härledda cerebrala kortikala nervceller. Speciellt kan mikro-tenn tillverkas med andra typer av neurala celler. För exRiklig, de första rapporterna om framgångsrik mikro-TENN-utveckling presenterade dorsala root ganglion (DRG) neuroner 32 . Hydrogelmikrokolumnerna kan alstras ( Figur 2A ) genom att tillsätta flytande agaros till en skräddarsydd, laserskärd cylindrisk kanalgrupp eller till kapillärrör, vilka båda innehåller inriktade akupunkturnålor. Nålen bildar lumen och bestämmer mikrokolonnens innerdiameter (ID), medan kapillärrörets ID och diametern hos cylindrarna i den laserskärda anordningen dikterar konstrukternas ytterdiameter (OD). OD och ID kan väljas enligt önskad applikation genom att välja olika diametrar för anordning / kapillärrör respektive akupunkturnålar. Längden på mikrokolumnerna kan också varieras; Hittills har vi rapporterat konstruktionen av mikro-tenn upp till 20 mm i längd 10 och arbetar aktivt med längre längder. Efter agarosgelerna och akupunkturen nEedlar avlägsnas, en ECM-lösning som i allmänhet består av kollagen av typ I och laminin tillsätts till konstruktionens lumen ( figur 2C ). ECM-kärnan ger en byggnadsställning som stödjer neuronal celladhesion och axonal utväxt. Ursprungligen pläterades primära råtta-kortikala neuroner i mikrokolonnerna med användning av dissocierade cellsuspensioner 10 , 31 , 32 . Detta tillvägagångssätt producerade emellertid inte målcytoarkitekturen i alla fall, som definierades som neuroncellcellerna begränsade till ändarna av mikrokolumnerna, varvid den centrala lumen bestod av rena inriktade axonala kanaler. Sedan dess har användningen av en tvungen neuronal aggregeringsmetod (baserat på protokoll anpassade från Ungrin et al .) Möjliggjort en mer pålitlig och konsekvent tillverkning av mikro-TENN med den ideala strukturen ( Figur 2B ) 44 . Förutom att beskriva strömmenMetodik, kommer denna artikel att visa representativa faskontrast och konfokala bilder av mikro-TENN som visar bildandet av axonala kanaler över tiden, såväl som den slutliga målcytokarchitecturen. Detta manuskript kommer också att expandera på anmärkningsvärda aspekter av protokollet och återstående utmaningar och framtida riktningar för mikro-TENN-tekniken. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/55609/55609fig2.jpg" /> Figur 2: Schematiskt diagram över tre-stegs mikro-TENN-tillverkningsprocessen. ( A ) Utveckling av agaroshydrogelen: (i) Initialt införs en liten akupunkturnål ( t.ex. 180-350 um diameter) i de cylindriska kanalerna av en skräddarsydd, laserskärd form eller ett kapillärrör ( t.ex. , 380-700 pm i diameter). I nästa steg införs flytande agaros i DPBS i de cylindriska kanalerna eller kapillärrören. (Ii) Efter agarosgelerna avlägsnas nålen ochFormen avmonteras för att ge de ihåliga agarosmikolonnerna. (Iii) Dessa konstruktioner steriliseras sedan och lagras i DPBS. ( B ) Primär neuronkultur och aggregatmetoden: (i) Neuronal aggregering utförs i pyramidala mikrobrunnsarrayer, gjutna av 3D-tryckta formar, som passar in i brunnarna i en 12-brunns odlingsplatta. (Ii) Mikro-TENN inkluderar primära råttneuroner dissocierade från fostrets hjärnor av embryonala-18-råttor. Efter vävsdissociation med trypsin-EDTA och DNas I framställs en celllösning med en densitet av 1,0-2,0 x 106 celler / ml. (Iii) 12 | il av denna lösning överförs till varje brunn i den pyramidala mikrobrunnmatrisen. Plattan innehållande dessa mikrobrunnar centrifugeras för framställning av cellaggregat. (Iv) Dessa inkuberas sedan över natten före plätering i mikrokolonnerna. ( C ) ECM-kärntillverkning och cellsåning: (i) Före cellsåkning fick en ECM-lösning innehållande 1 mg / ml typ I-kollagen och 1 mg / mlLaminin överförs till det inre av mikro-tenn och tillåts polymerisera. (Ii) Beroende på huruvida enriktad eller dubbelriktad mikro-TENN tillverkas, placeras ett aggregat vid respektive ena eller båda extremiteterna av mikrokolonnen. (Iii) Efter en inkubationsperiod för att främja vidhäftning odlas mikro-TENN i petriskålar som översvämmas med kompletterat embryonalt neuronalt basalt medium. Iv) Efter 3-5 dagar i odling bör den slutliga mikro-TENN-strukturen demonstrera cellaggregat vid ytterkolumnerna, med axonala kanaler som sträcker sig över längden. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55609/55609fig2large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.</a>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1571">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Laser cutter</td>
			<td style="width:195px;">Universal Laser Systems</td>
			<td style="width:119px;">PLS4.75</td>
			<td style="width:944px;">Used to fabricate the laser-cut micro-channel mold.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Laser-cut micro-column fabrication device</td>
			<td style="width:195px;">Custom-made</td>
			<td style="width:119px;">--------------</td>
			<td>Contact our research group if interested. Dimensions and blueprints provided in the manuscript.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Screws</td>
			<td style="width:195px;">--------------</td>
			<td style="width:119px;">--------------</td>
			<td>#4-40 with a thread diameter of 3.05 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Nuts</td>
			<td style="width:195px;">--------------</td>
			<td style="width:119px;">--------------</td>
			<td>#4-40 with a thread diameter of 3.05 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Acupuncture needle (180 &#181;m diameter)</td>
			<td style="width:195px;">Lhasa Medical</td>
			<td>sj.16X40</td>
			<td>The diameter may be varied according to the desired size for the micro-column lumen.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Petri dish</td>
			<td style="width:195px;">Fisher</td>
			<td>08772B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline (DPBS)</td>
			<td style="width:195px;">Invitrogen</td>
			<td>14200075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Polystyrene disposable serological pipet</td>
			<td style="width:195px;">Fisher</td>
			<td>13-678-11D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9539-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Capillary tube (398 &#181;m diameter)</td>
			<td style="width:195px;">Fisher</td>
			<td>21170D</td>
			<td>The diameter may be varied according to the desired size for the micro-column shell.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Hot plate</td>
			<td style="width:195px;">Fisher</td>
			<td>SP88857200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Magnetic bar</td>
			<td style="width:195px;">Fisher</td>
			<td>1451352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Micropipette</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td>Z683884-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">25 mm gauge needle</td>
			<td style="width:195px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">14-826-49</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Microscalpel</td>
			<td style="width:195px;">Roboz Surgical</td>
			<td>RS-6270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Scissors</td>
			<td style="width:195px;">Fine Science Tools</td>
			<td>14081-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Hot bead sterilizer</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td>Z378550-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Stereoscope</td>
			<td style="width:195px;">Nikon</td>
			<td>SMZ800N</td>
			<td>Used for all dissection steps and for micro-TENN fabrication.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Rat tail type I collagen</td>
			<td style="width:195px;">Corning</td>
			<td>354236</td>
			<td>Maintain at 4 &#186;C and remove only when needed.&#160; Use ice to preserve its temperature when in use.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Microcentrifuge tube</td>
			<td style="width:195px;">Fisher</td>
			<td>02-681-256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Mouse laminin</td>
			<td style="width:195px;">Corning</td>
			<td>354232</td>
			<td>Maintain at 4 &#186;C and remove only when needed.&#160; Use ice to preserve its temperature when in use.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Neurobasal medium</td>
			<td style="width:195px;">Invitrogen</td>
			<td>21103049</td>
			<td>Basal medium for the culture of pre-natal and embryonic neuronal cells. Store at 4&#186;C and warm at 37 &#186;C before use.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td style="width:195px;">Fisher</td>
			<td>SS2661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Hydrochloric acid (HCl)</td>
			<td style="width:195px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">SA48-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Litmus paper</td>
			<td style="width:195px;">Fisher</td>
			<td>09-876-18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Hank&#39;s balanced salt solution (HBSS)</td>
			<td style="width:195px;">Invitrogen</td>
			<td>14170112</td>
			<td>Store at 4 &#186;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">0.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:195px;">Invitrogen</td>
			<td>25200056</td>
			<td>Store at -20 &#186;C and warm at 37 &#186;C before use.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:315px;">Bovine pancreatic deoxyribonuclease (DNase) I</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td>10104159001</td>
			<td>Store at -20 &#186;C and warm at 37 &#186;C before use.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">B-27 Supplement</td>
			<td style="width:195px;">Invitrogen</td>
			<td>12587010</td>
			<td>Supplement added to Neurobasal medium for the culture of hippocampal and cortical neurons. Store at -20 &#186;C and warm at 37 &#186;C before use.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">L-glutamine&#160;</td>
			<td style="width:195px;">Invitrogen</td>
			<td>35050061</td>
			<td>Store at -20 &#186;C and warm at 37 &#186;C before use.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Sprague Dawley embryonic day 18 rats</td>
			<td style="width:195px;">Charles River</td>
			<td style="width:119px;">Strain 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Pasteur pipette</td>
			<td style="width:195px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">22-042816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">15 mL centrifuge tube</td>
			<td style="width:195px;">EMESCO</td>
			<td>1194-352099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Vortex</td>
			<td style="width:195px;">Fisher</td>
			<td>02-215-414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:195px;">Fisher</td>
			<td>05-413-115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Hemocytometer</td>
			<td style="width:195px;">Fisher</td>
			<td>02-671-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Objet30 3D-Printer</td>
			<td style="width:195px;">Stratasys&#160;</td>
			<td>--------------</td>
			<td>Used to fabricate the pyramidal micro-well molds.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">3D-printed pyramidal well mold</td>
			<td style="width:195px;">Custom-made</td>
			<td style="width:119px;">--------------</td>
			<td>Contact our research group if interested. Dimensions and blueprints provided in the manuscript.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:315px;">Polydimethylsiloxane (PDMS) and curing agent</td>
			<td style="width:195px;">Fisher</td>
			<td>NC9285739</td>
			<td>Comes as kit with elastomer and curing agent. Use inside a chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Funnel</td>
			<td style="width:195px;">Fisher</td>
			<td>10-348C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">1 ml pipette bulb</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td>Z509035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Micro-spatula</td>
			<td style="width:195px;">Fisher</td>
			<td>S50821</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">12-well culture plate</td>
			<td style="width:195px;">EMESCO</td>
			<td>1194-353043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Oven</td>
			<td style="width:195px;">Fisher</td>
			<td>11-475-154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Incubator</td>
			<td style="width:195px;">Fisher</td>
			<td>13 998 076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AAV1.Syn.GCaMP6f.WPRE.SV40</td>
			<td style="width:195px;">UPenn Vector Core</td>
			<td style="width:119px;">36373</td>
			<td>Store at -80&#186;C. Commercially available adeno-associated virus (AAV) with the GCaMP6f calcium indicator.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Formaldehyde 40%</td>
			<td style="width:195px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">F77P-4</td>
			<td>Formaldehyde is a toxic compound known to be carcinogenic, and must be disposed of in a separate container.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T8787</td>
			<td>Non-ionic surfactant used to permeabilize cell membranes.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Horse serum</td>
			<td style="width:195px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">16050-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:315px;">Mouse anti-Tuj-1/beta-III tubulin primary antibody</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td>T8578-200UL</td>
			<td>Store at -20&#186;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Rabbit anti-synapsin 1 primary antibody</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>106-001</td>
			<td>Store at -20&#186;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Donkey anti-mouse 568 secondary antibody</td>
			<td style="width:195px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">A10037</td>
			<td>Store at 4&#186;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Donkey anti-rabbit 488 secondary antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21206</td>
			<td>Store at 4&#186;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hoechst 33342, Trihydrochloride</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H3570</td>
			<td>Store at 4&#186;C.&#160; Hoechst is a known mutagen that should be treated as a carcinogen.&#160; Therefore, it must be disposed of in a separate container.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">A1RSI Laser Scanning Confocal Microscope&#160;</td>
			<td style="width:195px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">--------------</td>
			<td>Used for taking the confocal reconstructions of immunolabeled constructs.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Eclipse Ti-S Microscope&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td style="width:119px;">--------------</td>
			<td>Used for taking the phase-contrast images.&#160; With digital image acquisition using a QiClick camera interfaced with Nikon Elements Basic Research software (4.10.01).</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">High-speed Fluorescence Microscope</td>
			<td style="width:195px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">--------------</td>
			<td>Nikon Eclipse Ti microscope paired with an ANDOR Neo/Zyla camera for calcium imaging.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NIS Elements AR 4.50.00 Software</td>
			<td style="width:195px;">Nikon Instruments</td>
			<td style="width:119px;">--------------</td>
			<td>Used to identify calcium transients from the recordings taken with the high-speed fluorescence microscope.&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

anatomically inspired three-dimensional micro-tissue engineered neural networks for nervous system reconstruction, modulation, and modeling

Funktionell återhämtning sker sällan efter skada eller sjukdomsinducerad degenerering inom centrala nervsystemet (CNS) på grund av den inhiberande miljön och den begränsade kapaciteten för neurogenes. Vi utvecklar en strategi för att samtidigt ta itu med neuronal och axonal banaförlust inom det skadade nervsystemet. Detta manuskript presenterar tillverkningsprotokollet för mikrovävnaderstekniska neurala nätverk (mikro-TENN), implanterbara konstruktioner som består av neuroner och inriktade axonala kanaler som spänner över den extracellulära matrisen (ECM) lumen av en förformad hydrogelcylinder hundratals mikron i diameter som kan sträcka sig i centimeter i längd. Neuronala aggregat är avgränsade till ytterdimensionerna av den tredimensionella kåpan och spänns av axonala utsprång. Mikro-TENN är unikt balanserade som en strategi för återuppbyggnad av CNS, emulerande aspekter av cytomarkitektur i hjärnans kontakt och möjligen tillhandahålla medel för nätverksbyte. Den neuRonala aggregat kan synaps med värdvävnad för att bilda nya funktionella reläer för att återställa och / eller modulera saknade eller skadade kretsar. Dessa konstruktioner kan också fungera som proregenerativa &quot;levnadsställare&quot; som kan exploatera utvecklingsmekanismer för cellmigration och axonal pathfinding, vilket ger synergistiska strukturella och lösliga signaler baserat på regenereringsstatus. Mikro-tenn tillverkas genom att hälla flytande hydrogel i en cylindrisk form som innehåller en längsgående centrerad nål. När hydrogelen har gelat, avlägsnas nålen och lämnar en ihålig mikrokolonn. En ECM-lösning läggs till lumenet för att ge en miljö lämplig för neuronadhesion och axonal utväxt. Dissocierade neuroner aggregeras mekaniskt för exakt sådd i en eller båda ändarna av mikrokolonnen. Denna metod ger tillförlitligt självständiga miniatyrkonstruktioner med långprojektiva axonala områden som kan rekapitulera egenskaper hos neuroanatomi i hjärnan. Synaptisk immUnolabeling och genetiskt kodade kalciumindikatorer antyder att mikro-TENN har en omfattande synaptisk fördelning och inneboende elektrisk aktivitet. Följaktligen representerar mikro-tenn en lovande strategi för målinriktad neurokirurgisk rekonstruktion av hjärnvägar och kan även användas som biofideliska modeller för att studera neurobiologiska fenomen in vitro .

Mikro-TENNs övervakades med användning av faskontrastmikroskopi för att bedöma deras cytoarkitektur och axonal utväxt ( Figur 4 ). Inom enriktad, 2 mm lång mikro-tenn begränsades neuronalaggregat till ena änden av mikrokolonnen och projicerade ett bunt av axoner genom den inre kärnan. Axonerna sträckte sig över hela längden av kolonnen med 5 dagar in vitro (DIV) ( Figur 4A ). Det fanns en större initial axonal tillväxthastighet i t...

Watch this Scientific Journal Video about Anatomically Inspired Three-dimensional Micro-tissue Engineered Neural Networks for Nervous System Reconstruction, Modulation, and Modeling at JoVE.com

Anatomically Inspired Three-dimensional Micro-tissue Engineered Neural Networks for Nervous System Reconstruction, Modulation, and Modeling

Detta manuskript beskriver tillverkningen av mikrovävnadsmetriska neurala nätverk: tredimensionella mikronstorlekskonstruktioner bestående av långlinjerade axonala kanaler som spänner över aggregerade neuronpopulationer som är inneslutna i en tubulär hydrogel. Dessa levande byggnadsställningar kan fungera som funktionella reläer för att rekonstruera eller modulera neurala kretsar eller som biofideliska testbäddar som efterliknar gråvit substans neuroanatomi.

Anatomiskt inspirerade tredimensionella mikrovävnadsgenererade neurala nätverk för nervsystemet återuppbyggnad, modulering och modellering

Functional recovery rarely occurs&#160;following injury or disease-induced degeneration within the central nervous system (CNS)&#160;due to the inhibitory ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Designing and Implementing Nervous System Simulations on LEGO Robots

Utforma och genomföra nervsystemet simuleringar på LEGO robotar

We present a method to use the commercially available LEGO Mindstorms NXT robotics platform to test systems level neuroscience hypotheses. The first step ...

Neural Circuit Recording from an Intact Cockroach Nervous System

Neural Circuit Spela in från en Intakt kackerlacka Nervsystemet

The cockroach ventral nerve cord preparation is a tractable system for neuroethology experiments, neural network modeling, and testing the physiological ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

In vivo optogenetic Stimulering av gnagare centrala nervsystemet

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Modeling Astrocytoma Pathogenesis In Vitro and In Vivo Using Cortical Astrocytes or Neural Stem Cells from Conditional, Genetically Engineered Mice

Modeling Astrocytoma Pathogenesis In Vitro and In Vivo Using Cortical Astrocytes or Neural Stem Cells from Conditional, Genetically Engineered Mice

Modellering Astrocytoma Pathogenesis<em&gt; In Vitro</em&gt; Och<em&gt; In Vivo</em&gt; Använda Kortikal Astrocyter eller neurala stamceller från Villkorlig, Genmanipulerade möss

Current astrocytoma models are limited in their ability to define the roles of oncogenic mutations in specific brain cell types during disease ...

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

I vitro Modellering av cancer Neural Invasion: dorsala ganglion Modell

One way that solid tumors disseminate is through neural invasion. This route is well-known in cancers of the head and neck, prostate, and pancreas. These ...

Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

Protokoll för Tredimensionell Confocal Morfometrisk Analys av Astrocytes

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify ...

Quadruple Immunostaining of the Olfactory Bulb for Visualization of Olfactory Sensory Axon Molecular Identity Codes

Quadruple Immunostaining av Olfactory Bulb för Visualisering av Olfactory Sensory Axon Molecular Identity Codes

The mouse olfactory system is often used to study mechanisms of neural circuit formation&#12288;because of its simple anatomical structure. An Olfactory ...

Simultaneous Recordings of Cortical Local Field Potentials, Electrocardiogram, Electromyogram, and Breathing Rhythm from a Freely Moving Rat

Samtidiga inspelningar av kortikala lokala fältet potentialer, elektrokardiogram, Elektromyogram och andas rytm från en fritt rörliga råtta

Monitoring the physiological dynamics of the brain and peripheral tissues is necessary for addressing a number of questions about how the brain controls ...

Three-Dimensional Shape Modeling and Analysis of Brain Structures

Tredimensionell form modellering och analys av hjärnstrukturer

Statistical shape analysis of brain structures has been used to investigate the association between their structural changes and pathological processes. ...

Transplantation of Chemogenetically Engineered Cortical Interneuron Progenitors into Early Postnatal Mouse Brains

Transplantation av Chemogenetiskt konstruerade kortikala Interneuron progenitorer till tidiga postnatal mus hjärnor

Neuronal development is regulated by a complex combination of environmental and genetic factors. Assessing the relative contribution of each component is ...