Name: anatomically inspired three-dimensional micro-tissue engineered neural networks for nervous system reconstruction, modulation, and modeling
Uploaded: 2017-05-31T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Anatomically Inspired Three-dimensional Micro-tissue Engineered Neural Networks for Nervous System Reconstruction, Modulation, and Modeling at JoVE.com

Mali destek, Michael J. Fox Vakfı (Terapötik Boru Hattı Programı # 9998 (Cullen)), Ulusal Sağlık Enstitüleri U01-NS094340 (Cullen), T32-NS043126 (Harris) ve F31-NS090746 (Katiyar)) tarafından sağlandı. (Cullen), Penn Sciences Neuroscience Merkezi Pilot Ödülü (Cullen), Ulusal Bilim Vakfı (Yüksek Lisans Araştırma Bursu DGE-1321851 (Struzyna ve Adewole)), Gazi İşleri Departmanı (RR &amp; D Merit İncelemesi # B1097-I (Cullen)), Amerikan Derneği Nörolojik Cerrahlar Kongresi ve Nörolojik Cerrahlar Kongresi (2015-2016 Nörotravma ve Kritik Bakımda Kod Adam Bursu (Petrov)) ve ABD Ordusu Tıbbi Araştırma ve Materiel Komutanlığı (# W81XWH-13-207004 (Cullen) ve W81XWH-15-1- 0466 (Cullen)).

Hayvanlarla ilgili tüm prosedürler, Pennsylvania Üniversitesi&#39;ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komiteleri ve Michael J. Crescenz Gaziler İşleri Tıp Merkezi tarafından onaylandı ve NIH Kamu Sağlığı Hizmet Politikası&#39;nda yer alan ilkelere uyuldu ve İnsani Bakım ve Laboratuar Kullanımı Hayvanlar (2015). 1. Agaroz Hidrojelinin Geliştirilmesi (mikro-TEN&#39;lerin Uç Faz Komponenti) <ol><li> Agaroz çözeltisi hazırlama <ol><li> Biyogüvenl...

CNS yaralanması ve hastalığı tipik olarak, birlikte görülen nöronal dejenerasyon ile veya olmadan, beyin connectome&#39;yu içeren uzun mesafeli aksonal yolların kaybedilmesi veya işlevinde aksama ile sonuçlanır. Bu nörojenez ve yenilenmeyi teşvik etmek için CNS&#39;in sınırlı kapasitesi ile karışıktır. Bireysel veya kombinatoryal yaklaşımlar olarak büyüme faktörü, hücre ve biyomalzeme sunumu gibi onarım stratejilerinin peşinde olmasına rağmen, bu teknikler aynı anda hem nöronal hücrel...

Travmatik beyin hasarı (TBI), omurilik yaralanması (SCI), inme, Alzheimer hastalığı ve Parkinson hastalığı gibi merkezi sinir sistemi hastalıklarının (MSS) ortak bir özelliği, aksonal yolların ve nöronal hücrenin kopukluğudur Kayıp 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . Örneğin, iskemik bir inme tedavi edilmezse, aksonların dakikada 7 mil akson hızında kaybolduğu tahmin edilir. Her yıl yaklaşık 1.7 milyon insanın her yıl ABD&#39;de deneyimlediği TBI vakasında, aksonal bozulmalar travmadan sonra yıllar sonra devam edebilir, çünkü ilk hasar uzun vadede nörodejeneratif bir duruma neden olur 4 . Bu zararlı etkileri ağırlaştıran MSS ciddi ölçüde sınırlı bir kapaa sahiptirRejenerasyon için şehir 1 , 7 , 8 , 9 . Yaralanmadan sonra, uzak hedeflere yöneltilen rehberlik eksikliği, nörit büyümesini engelleyen miyelin ile ilişkili inhibitörlerin varlığı ve reaktif astrositler 8 , 10 , 11 , 12 tarafından bir glial skar oluşumu ile karakterize bir inhibitör ortam gelişir. Glial skar, yenilenmeye karşı biyokimyasal ve fiziksel bir bariyer görevi görür ve kondroitin sülfat proteoglikanlar gibi akson büyümesini engelleyen moleküller bulunur 8 , 11 . Dahası, yetişkin MSS&#39;de sinir kök hücreleri bulunsa da, yeni nöronların üretimi sınırlıdır çünkü tutarlı nevrojenez bulgusu yalnızca koku alma ampulünde, hipokampalde bulunurSubgranular bölge, periventriküler alan ve omuriliğin merkezi kanalı 13 , 14 . Bu engeller, yaralanma ya da hastalığın ardından kayıp nöronların ve beyaz cevher mimarisinin işlevsel olarak iyileştirilmesini önler ve bu durumların yaşamı değişen ve uzayan etkileriyle sonuçlanır. Yetişkin MSS&#39;de rejeneratif kapasitenin olmamasına rağmen, konakçı nöronlarına 15 , 16 , 17 , 18 yeterli çevresel ipuçları verildiğinde aksonal rejenerasyonun mümkün olduğu gösterilmiştir. Araştırmacılar, büyüme faktörlerini ( örn., Sinir büyüme faktörü, epidermal büyüme faktörü, glial bağımlı büyüme faktörü ve nörotrofik faktör-3) ve diğer rehberlik moleküllerini, plastisite ve akson rejenerasyonunu uyarmak için sunmaya ve bunları manipüle etmeye teşebbüs ettiler14 ,/ Sup&gt; 18 , 19 . Bu çalışmalar yetişkin aksonların büyüme faktörlerine cevap verebildiklerini doğrulasa da, bu stratejiler, kan-beyin bariyerinin düşük permeabilitesi ve rejenerasyonu teşvik etmek için gereken spesifik uzaysal ve zamansal gradyanlar ile sınırlandırılmıştır 14,18,19. Diğer yaklaşımlar, CNS nöronlarında rejenerasyona bağlı transkripsiyon faktörlerinin hiperaktivasyonuna dayanmaktadır. Örneğin, Stat3 transkripsiyon faktörünün aşırı ekspresyonu optik sinir 20&#39;de aksonal rejenerasyonu uyardı. Bununla birlikte, hem biyomolekülün verilmesi hem de transkripsiyon faktörlerinin aşırı ekspresyonu kayıp nöronal popülasyonların yerini alamaz. Hücre temelli stratejiler esas olarak merkezi sinir sistemi kök hücrelerine (CNS nöronları) yer değiştirme kapasitelerinden yararlanarak merkezi sinir sistemi kök hücrelerine (NSC) nakledilmeyi, trofik faktörleri serbest bırakmayı,Ve yaralanma sonrası meydana gelen nörojenez girişimlerini desteklemek 17 . Buna rağmen, transplante nöral hücrelerin hayatta kalma, konakçıya entegre olma ve fiziksel olarak yaralı bölgeye 6 , 14 , 17 , 21 ile sınırlı kalma gibi engellenmiş yetenekleri de içeren bu yaklaşımı engelleyen zorlayıcı zorluklar hala var. Buna ek olarak, hücre iletiminin tek başına hasar görmüş ya da kaybolmuş aksonal yolların sitrik mimarisini eski haline getirememesi mümkündür. Hücre ve ilaç / kimyasal dağıtım stratejilerinin karşılaştığı problemleri ele alan alternatif bir yaklaşım, bu yaklaşımları biyomalzemelerin 14 , 22 , 23 kullanımı ile birleştirmektir. Hidrojenler gibi biyomalzemeler, hücre dışına matrisin (ECM) biyokimyasal ve fiziksel özelliklerini öykünme yeteneğine sahiptir ve hücre dağıtımına yardımcı olur veD sakat bölgede tutulması ve kontrollü salınımlı büyüme faktörleri ve diğer biyoaktif moleküller sağlanması 22 . Bu biyo materyal temelli stratejilerin çekici özellikleri, iskeleleri lezyon alanına 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 nakledildikten sonra in vivo aksonal rejenerasyon kanıtıyla sonuçlanmıştır. Bununla birlikte, hücresel olmayan biyomalzeme stratejileri kayıp nöronal popülasyonların yerini tutmaz; Nöronal, glial veya nöronal öncü hücreler için iletim araçları olarak kullanıldığında, biyomalzemeler uzun mesafeli aksonal ağları yeniden yapılandıramazlar. Hem aksonal patikada bozulma, hem de MSS hasarı ve hastalığına bağlı nöronal kaybı ele alan bir yaklaşım geliştirmenin zorluğu &lt;Sup class = &quot;xref&quot;&gt; 31. Araştırma grubumuz, bir agaroz hidrojel-ECM mikro sütununun bir veya her iki ucuyla sınırlandırılmış nöronal hücre cisimciklerinden oluşan bir &quot;canlı iskelet&quot; türü olan implante edilebilir mikro doku mühendislik sinir ağlarının (mikro-TENN&#39;lerin) gelişimini daha önce rapor etmiştir , Bu üç boyutlu (3D) kaplamanın 1 , 10 , 31 , 32 iç kısmı boyunca uzanan hizalı aksonal yollarla birlikte. Bu teknik ile daha önceki yaklaşımlar arasındaki temel farklardan biri, mikro-TENN&#39;lerin sitolojisinin in vitro olarak tamamen oluşturulduğu ve daha sonra 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 ,Sup class = &quot;xref&quot;&gt; 39 , 40 , 41 . In vitro üretim, hücre iskeletinin ve oryantasyonunun, mekanik / fiziksel özelliklerin, biyokimyasal ipuçlarının ve eksojen faktörlerin kapsamlı mekansal ve zamansal kontrolünü sağlar ve implantasyon sonrası konakçıya bu iskeletlerin entegrasyonunu sağlar 41,42. Mikro-TEN&#39;ler anatomik olarak esinlenmiştir, çünkü beyin nöroanatomisini taklit ederler, beyindeki farklı işlevsel bölgelere köprü yapanlara benzer aksonal yollar görüntüler ( Şekil 1A ) 1 . Bu nedenle, bu strateji lezyonlu bir bölgeye implantasyon sonrası kaybedilen beyaz cevher yollarını ve nöronları fiziksel olarak değiştirebilir. Bu teknik aynı zamanda radyal glial hücreler ve öncü aksonlar tarafından oluşturulan &quot;doğal canlı iskele&quot; nin hücre için yol bulma kılavuzları rolündeki gelişim mekanizmalarından esinlenmiştir.Subventriküler bölgeden göç ve aksonal büyüme, sırasıyla 43 . Bu mekanizmalar, akson aracılı aksonal büyümeyle ( Şekil 1C ) nöral hücre göçü ve aksonal rejenerasyon için canlı yollar sunabilen mikro-TENN&#39;lerin hizalı aksonal yollarında tekrarlar. Dahası, bu strateji, mikro-TENN nöronları ve doğal devre arasındaki sinaptik bütünleşmeden yararlanarak işlevsel toparlanmaya katkıda bulunabilecek yeni röleler oluşturur ( Şekil 1B ) 43 . Sinaps oluşumu kapasitesi, bu yaklaşıma, MSS&#39;yi modüle etme ve ağ geri bildirimine göre ev sahibi dokuya yanıt verme becerisi de verebilir. Örneğin canlı iskele içindeki optogenetik olarak aktif nöronlar, sinaptik etkileşimler yoluyla konakçı nöronlarını modüle etmek için uyarılabilir ( Şekil 1D ). Buna ek olarak, biyomalzeme esaslı boru şekilli konstrüksiyonMikro-TENN&#39;lerin kullanılması yapıların minyatür boyutları, minimal invaziv implantasyona izin verir ve kademeli olarak beyne entegrasyon için kısmen kenetlenmiş bir mikro ortam sağlarken hücre yapışması, büyüme, nevrit ekspansiyonu ve sinyalizasyon için uygun bir ortam sunar. Nitekim, son yayınlar sıçan beynine yerleştirildikten sonra mikro-TEN&#39;lerin sinir yollarını taklit etme potansiyeli olduğunu göstermiştir. Stereotaksik mikroenjeksiyon sonrasında daha önce, mikro-TENN nöronal sağkalımı, aksonal bölge mimarisi bakımından ve konakçı kortekse in vivo 10 , 31 en az 1 ay boyunca nörit uzatmanın kanıtlarını bildirdik. Dahası, synapsin ile etiketleme, doğal doku 10,31 ile sinaptik entegrasyonun histolojik kanıtı sağladı. Genel olarak, mikro-TENN&#39;ler, hasarın yeniden yapılandırılması ve modülasyonu için benzersiz şekilde uygun olabilirKaybedilmiş nöronları değiştirerek, ana devre ile sinaptik olarak bütünleşerek, kaybedilen aksonal sitolojiyi geri yükleyerek ve bazı durumlarda uygun yol bulma ipuçlarını içeren yenilenen aksonları sağlayarak MSS. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/55609/55609fig1.jpg" /> Şekil 1: Mikro-doku ile tasarlanmış sinir ağı (mikro-TEN) gelişimi arkasındaki ilkeler ve ilham. ( A ) Mikro-TENN&#39;ler işlevsel olarak farklı bölgelerin tek yönlü (kırmızı, yeşil) veya iki yönlü (mavi) şekilde uzun, hizalanmış aksonal yollarla bağlandığı beynin bağlanmasını (mor) simüle eder. Örnek olarak, mikro-TENN&#39;ler, kortikotalamik ve nigrostriatal yollarda veya entorinal korteksten hipokampusa (struzyna ve diğerleri, 2015&#39;den adapte edilmiş) perforant yolda kaybedilen bağlantıları yeniden oluşturabilir 1 . ( B ) Tek yönlü bir diyagramL ve her lezyonun her iki ucu arasında fonksiyonel bir röle olarak görev yapmak üzere ana devre (mor) ile sinaptik olarak entegre olan çift yönlü mikro-TENN (sırasıyla kırmızı ve mavi). ( C ) Mikro-TENN&#39;in etkileşimde bulunduğu bir hedefe doğru ana aksonların (mor) akson kolaylaştırılmış rejenerasyonu için bir kılavuz olarak hizmet eden, tek yönlü bir mikro-TENN&#39;in (yeşil) aksonal yollarının şeması. ( D ) Neşredici veya inhibe edici nöronlar (alt) ile sinaptik entegrasyon yararlanarak, nöromodülatörler olarak optogenetik olarak aktif mikro-TENNS kullanımı kavramsal diyagram. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55609/55609fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> Mevcut el yazması, embriyonik olarak türetilen serebral kortikal nöronları kullanarak mikro-TEN&#39;lerin imalinde kullanılan metodolojiyi ayrıntılarıyla anlatmaktadır. Özellikle, mikro-TEN&#39;ler diğer nöral hücreler türleriyle birlikte üretilebilir. Eski içinBaşarılı, mikro-TENN gelişiminin ilk raporlarında sırt kök gangliyon (DRG) nöronları 32 bulunmaktadır. Hidrojel mikro sütunları, sıvı ile şekillendirilmiş, lazerle kesilmiş bir silindirik kanal dizisine veya kılcal tüplere, her ikisi de hizalı akupunktur iğnelerini içeren sıvı agaroz eklenerek üretilebilir ( Şekil 2A ). İğne lümeni oluşturur ve mikro-kolonun iç çapını (ID) belirler; buna karşın kılcal tüp ID&#39;si ve lazer kesme cihazındaki silindirlerin çapı yapıların dış çapını (OD) belirler. OD ve ID, sırasıyla, cihaz / kılcal tüpler ve akupunktur iğneleri için farklı çaplar seçerek istenen uygulamaya göre seçilebilir. Mikro kolonların uzunluğu da değiştirilebilir; Bugüne kadar, uzunluğu 20 mm&#39;ye kadar olan mikro-TEN&#39;lerin yapımını bildirdik ve aktif olarak daha uzun uzunluklarda ilerliyoruz. Agaroz jellerinden ve akupunkturdan sonra nEedles kaldırılır, genellikle tip I kollajen ve laminin içeren bir ECM çözeltisi yapıların lümenine eklenir ( Şekil 2C ). ECM çekirdeği, nöronal hücre yapışmasını ve aksonal gelişimini desteklemek için bir iskelet sağlar. Başlangıçta, primer sıçan kortikal nöronları, ayrılmış hücre süspansiyonları 10 , 31 , 32 kullanılarak mikro-kolonlara kaplandı. Bununla birlikte, bu yaklaşım, merkezi lümen saf hizalanmış aksonal yollardan oluşan, mikro kolonların uçlarıyla sınırlı nöronal hücre cisimcikleri olarak tanımlanan her durumda hedef cyto mimari yapı oluşturmadı. O günden bu yana, (Ungrin ve arkadaşlarının uyarladığı protokollere dayalı olarak) zorlanmış bir nöronal toplama yönteminin kullanılması, ideal yapı ( Şekil 2B ) 44 ile daha güvenilir ve tutarlı bir mikro-TENN imalatı sağlamıştır. Mevcut durumu tanımlamanın yanı sıraMetodoloji ile bu makalede zamanla aksonal yolların oluşumunu gösteren mikro-TENN&#39;lerin temsili faz kontrastı ve konfokal görüntülerinin yanı sıra sonuçlandırılmış hedef hücre mimarisi de gösterilecektir. Bu el yazması, protokolün kayda değer yönleri ve kalan teknolojilerin ve gelecekteki mikro-TENN teknolojisinin yöneliminde de genişleyecektir. <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/55609/55609fig2.jpg" /> Şekil 2: Üç aşamalı mikro-TENN imalat sürecinin şematik diyagramı. ( A ) Agaroz hidrojelinin gelişimi: (i) Başlangıçta, küçük bir akupunktur iğnesi ( örn. , 180-350 μm çapında), ısmarlama lazerle kesilmiş kalıp veya kılcal borunun silindirik kanallarına yerleştirilir ( örn. , 380-700 μm çapında). Bir sonraki adımda, DPBS içindeki sıvı agaroz silindirik kanallara veya kılcal tüplere sokulur. (Ii) Agaroz jellerinden sonra, iğne çıkarılır veKalıp boşaltılmış agaroz mikro sütunları elde etmek için söküldü. (Iii) Bu yapılar daha sonra sterilize edilir ve DPBS&#39;de saklanır. ( B ) Primer nöron kültürü ve agrega yöntemi: (i) Nöronal agregasyon, 12-çukurlu bir kültür plakasının oyuklarına uyan 3D baskılı kalıplardan dökülen piramidal mikro-kuyu dizilerinde gerçekleştirilir. (Ii) Mikro-TENN&#39;ler, embriyonik-gün-18 sıçanların fetal beyinlerinden ayrılan birincil sıçan nöronlarını içerir. Tripsin-EDTA ve DNaz I ile doku ayrışmasının ardından, 1.0-2.0 x 106 hücre / mL yoğunluğa sahip bir hücre çözeltisi hazırlanır. (Iii) Bu çözeltiden 12 uL, piramidal mikro-kuyu dizisindeki her kuyuya aktarılır. Bu mikro kuyuları içeren plaka, hücre agregaları üretmek üzere santrifüje tabi tutulur. (Iv) Bunlar daha sonra mikro-kolonlara kaplamadan önce gece boyunca inkübe edilir. ( C ) ECM çekirdek imalatı ve hücre tohumlaması: (i) Hücre tohumlamadan önce, 1 mg / mL tip I kollajen ve 1 mg / mLLaminin, mikro-TENNlerin içine aktarılır ve polimerize olmasına izin verilir. (Ii) Tek yönlü veya çift yönlü mikro-TEN&#39;lerin imal edilip edilmediklerine bağlı olarak, bir agrega sırasıyla mikro-kolonun bir veya her iki ucuna yerleştirilir. (Iii) Yapışma kabiliyetini arttırmak için inkübasyon süresinin ardından, mikro-TENN&#39;ler eklenmiş embriyonik nöronal bazal ortam ile sızdırılmış Petri kaplarında kültürlenir. (Iv) Kültürde 3-5 gün sonra nihai mikro-TENN yapısı, akson kanallarının uzunluğunu uzatarak mikro kolonun uçlarında hücre agregalarını göstermelidir. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55609/55609fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1571">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Laser cutter</td>
			<td style="width:195px;">Universal Laser Systems</td>
			<td style="width:119px;">PLS4.75</td>
			<td style="width:944px;">Used to fabricate the laser-cut micro-channel mold.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Laser-cut micro-column fabrication device</td>
			<td style="width:195px;">Custom-made</td>
			<td style="width:119px;">--------------</td>
			<td>Contact our research group if interested. Dimensions and blueprints provided in the manuscript.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Screws</td>
			<td style="width:195px;">--------------</td>
			<td style="width:119px;">--------------</td>
			<td>#4-40 with a thread diameter of 3.05 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Nuts</td>
			<td style="width:195px;">--------------</td>
			<td style="width:119px;">--------------</td>
			<td>#4-40 with a thread diameter of 3.05 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Acupuncture needle (180 &#181;m diameter)</td>
			<td style="width:195px;">Lhasa Medical</td>
			<td>sj.16X40</td>
			<td>The diameter may be varied according to the desired size for the micro-column lumen.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Petri dish</td>
			<td style="width:195px;">Fisher</td>
			<td>08772B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline (DPBS)</td>
			<td style="width:195px;">Invitrogen</td>
			<td>14200075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Polystyrene disposable serological pipet</td>
			<td style="width:195px;">Fisher</td>
			<td>13-678-11D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9539-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Capillary tube (398 &#181;m diameter)</td>
			<td style="width:195px;">Fisher</td>
			<td>21170D</td>
			<td>The diameter may be varied according to the desired size for the micro-column shell.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Hot plate</td>
			<td style="width:195px;">Fisher</td>
			<td>SP88857200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Magnetic bar</td>
			<td style="width:195px;">Fisher</td>
			<td>1451352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Micropipette</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td>Z683884-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">25 mm gauge needle</td>
			<td style="width:195px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">14-826-49</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Microscalpel</td>
			<td style="width:195px;">Roboz Surgical</td>
			<td>RS-6270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Scissors</td>
			<td style="width:195px;">Fine Science Tools</td>
			<td>14081-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Hot bead sterilizer</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td>Z378550-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Stereoscope</td>
			<td style="width:195px;">Nikon</td>
			<td>SMZ800N</td>
			<td>Used for all dissection steps and for micro-TENN fabrication.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Rat tail type I collagen</td>
			<td style="width:195px;">Corning</td>
			<td>354236</td>
			<td>Maintain at 4 &#186;C and remove only when needed.&#160; Use ice to preserve its temperature when in use.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Microcentrifuge tube</td>
			<td style="width:195px;">Fisher</td>
			<td>02-681-256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Mouse laminin</td>
			<td style="width:195px;">Corning</td>
			<td>354232</td>
			<td>Maintain at 4 &#186;C and remove only when needed.&#160; Use ice to preserve its temperature when in use.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Neurobasal medium</td>
			<td style="width:195px;">Invitrogen</td>
			<td>21103049</td>
			<td>Basal medium for the culture of pre-natal and embryonic neuronal cells. Store at 4&#186;C and warm at 37 &#186;C before use.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td style="width:195px;">Fisher</td>
			<td>SS2661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Hydrochloric acid (HCl)</td>
			<td style="width:195px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">SA48-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Litmus paper</td>
			<td style="width:195px;">Fisher</td>
			<td>09-876-18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Hank&#39;s balanced salt solution (HBSS)</td>
			<td style="width:195px;">Invitrogen</td>
			<td>14170112</td>
			<td>Store at 4 &#186;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">0.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:195px;">Invitrogen</td>
			<td>25200056</td>
			<td>Store at -20 &#186;C and warm at 37 &#186;C before use.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:315px;">Bovine pancreatic deoxyribonuclease (DNase) I</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td>10104159001</td>
			<td>Store at -20 &#186;C and warm at 37 &#186;C before use.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">B-27 Supplement</td>
			<td style="width:195px;">Invitrogen</td>
			<td>12587010</td>
			<td>Supplement added to Neurobasal medium for the culture of hippocampal and cortical neurons. Store at -20 &#186;C and warm at 37 &#186;C before use.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">L-glutamine&#160;</td>
			<td style="width:195px;">Invitrogen</td>
			<td>35050061</td>
			<td>Store at -20 &#186;C and warm at 37 &#186;C before use.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Sprague Dawley embryonic day 18 rats</td>
			<td style="width:195px;">Charles River</td>
			<td style="width:119px;">Strain 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Pasteur pipette</td>
			<td style="width:195px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">22-042816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">15 mL centrifuge tube</td>
			<td style="width:195px;">EMESCO</td>
			<td>1194-352099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Vortex</td>
			<td style="width:195px;">Fisher</td>
			<td>02-215-414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:195px;">Fisher</td>
			<td>05-413-115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Hemocytometer</td>
			<td style="width:195px;">Fisher</td>
			<td>02-671-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Objet30 3D-Printer</td>
			<td style="width:195px;">Stratasys&#160;</td>
			<td>--------------</td>
			<td>Used to fabricate the pyramidal micro-well molds.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">3D-printed pyramidal well mold</td>
			<td style="width:195px;">Custom-made</td>
			<td style="width:119px;">--------------</td>
			<td>Contact our research group if interested. Dimensions and blueprints provided in the manuscript.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:315px;">Polydimethylsiloxane (PDMS) and curing agent</td>
			<td style="width:195px;">Fisher</td>
			<td>NC9285739</td>
			<td>Comes as kit with elastomer and curing agent. Use inside a chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Funnel</td>
			<td style="width:195px;">Fisher</td>
			<td>10-348C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">1 ml pipette bulb</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td>Z509035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Micro-spatula</td>
			<td style="width:195px;">Fisher</td>
			<td>S50821</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">12-well culture plate</td>
			<td style="width:195px;">EMESCO</td>
			<td>1194-353043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Oven</td>
			<td style="width:195px;">Fisher</td>
			<td>11-475-154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Incubator</td>
			<td style="width:195px;">Fisher</td>
			<td>13 998 076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AAV1.Syn.GCaMP6f.WPRE.SV40</td>
			<td style="width:195px;">UPenn Vector Core</td>
			<td style="width:119px;">36373</td>
			<td>Store at -80&#186;C. Commercially available adeno-associated virus (AAV) with the GCaMP6f calcium indicator.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Formaldehyde 40%</td>
			<td style="width:195px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">F77P-4</td>
			<td>Formaldehyde is a toxic compound known to be carcinogenic, and must be disposed of in a separate container.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T8787</td>
			<td>Non-ionic surfactant used to permeabilize cell membranes.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Horse serum</td>
			<td style="width:195px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">16050-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:315px;">Mouse anti-Tuj-1/beta-III tubulin primary antibody</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td>T8578-200UL</td>
			<td>Store at -20&#186;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Rabbit anti-synapsin 1 primary antibody</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>106-001</td>
			<td>Store at -20&#186;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Donkey anti-mouse 568 secondary antibody</td>
			<td style="width:195px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">A10037</td>
			<td>Store at 4&#186;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Donkey anti-rabbit 488 secondary antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21206</td>
			<td>Store at 4&#186;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hoechst 33342, Trihydrochloride</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H3570</td>
			<td>Store at 4&#186;C.&#160; Hoechst is a known mutagen that should be treated as a carcinogen.&#160; Therefore, it must be disposed of in a separate container.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">A1RSI Laser Scanning Confocal Microscope&#160;</td>
			<td style="width:195px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">--------------</td>
			<td>Used for taking the confocal reconstructions of immunolabeled constructs.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Eclipse Ti-S Microscope&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td style="width:119px;">--------------</td>
			<td>Used for taking the phase-contrast images.&#160; With digital image acquisition using a QiClick camera interfaced with Nikon Elements Basic Research software (4.10.01).</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">High-speed Fluorescence Microscope</td>
			<td style="width:195px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">--------------</td>
			<td>Nikon Eclipse Ti microscope paired with an ANDOR Neo/Zyla camera for calcium imaging.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NIS Elements AR 4.50.00 Software</td>
			<td style="width:195px;">Nikon Instruments</td>
			<td style="width:119px;">--------------</td>
			<td>Used to identify calcium transients from the recordings taken with the high-speed fluorescence microscope.&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

anatomically inspired three-dimensional micro-tissue engineered neural networks for nervous system reconstruction, modulation, and modeling

Fonksiyonel düzelme nörojenez için inhibe edici ortam ve sınırlı kapasite nedeniyle merkezi sinir sistemi (MSS) içindeki yaralanma veya hastalığa bağlı dejenerasyon sonrasında nadiren oluşur. Hasar gören SSS&#39;de nöronal ve aksonal yol kaybını aynı anda gidermek için bir strateji geliştiriyoruz. Bu el yazması, mikro-doku mühendislik yapmış sinir ağları (mikro-TENN&#39;ler), implante edilebilen nöronlar ve santimetre uzayabilen yüzlerce mikron çapında önceden oluşturulmuş bir hidrojel silindirin hücre dışı matrisi (ECM) lümenine hizalı aksonal yollardan oluşan implantasyon yapım protokolünü sunmaktadır uzunluğunda. Nöronal agregalar üç boyutlu kaplamanın uçlarına sınırlanır ve aksonal projeksiyonlarla yayılır. Micro-TENN&#39;ler CNS yeniden yapılandırması için bir strateji olarak benzersiz bir konumdadır ve beyin bağlantılı sitrik mimarisinin özelliklerini taklit eder ve potansiyel olarak ağ değişimi için araçlar sağlar. NeuRonal agregalar eksik veya hasar görmüş devreyi restore etmek ve / veya modüle etmek için yeni fonksiyonel röleler oluşturmak üzere konakçı doku ile sinapslanabilir. Bu yapılar ayrıca, hücre yenilemesi ve aksonal yol bulma için gelişim mekanizmalarını kullanabilen, rejenerasyon durumuna dayanan sinerjik yapısal ve çözünür ipuçları sağlayan pro-rejeneratif &quot;canlı iskele&quot; olarak da işlev görebilir. Mikro-TENN&#39;ler sıvı hidrojel, uzunlamasına merkezli bir iğne içeren silindirik bir kalıba dökülüp imal edilir. Hidrojel jelleştikten sonra iğne boşaltılarak içi boş bir mikro sütun bırakılarak çıkarılır. Nöronal yapışma ve aksonal gelişim için uygun bir ortam sağlamak için lümene bir ECM çözeltisi eklenir. Ayrışmış nöronlar, mikro sütunun bir veya iki ucunda hassas tohumlama için mekanik olarak toplanır. Bu metodoloji, beyin nöroanatomisinin özelliklerini yineleyebilecek uzun projeksiyonlu aksonal yollar içeren kendi kendine yeten minyatür yapıları güvenilir bir şekilde üretir. Synaptic immEtiketsiz ve genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergeleri, mikro-TENN&#39;lerin kapsamlı sinaptik dağılımına ve elektriksel aktiviteye sahip olduğunu ortaya koymaktadır. Sonuç olarak, mikro-TENN&#39;ler, beyin yolaklarının hedefe yönelik nöroşirürji rekonstrüksiyonu için umut verici bir stratejiyi temsil eder ve nörobiyolojik olayları in vitro olarak incelemek için biyo-fidelik modeller olarak da uygulanabilir.

Mikro-TENN&#39;ler, sitografi ve aksonal gelişimlerini değerlendirmek için faz-kontrast mikroskobu kullanılarak izlendi ( Şekil 4 ). Tek yönlü, 2 mm uzunluğunda mikro-TENN&#39;lerde, nöronal agregalar mikro kolonun bir ucuyla sınırlandırılmış ve iç çekirdeğin içinden aksonlar demeti öngörülmüştür. Aksonlar, kolonun tüm uzunluğunu in vitro (DIV) 5 gün boyunca uzattı ( Şekil 4A ). Aksonlar, tüm mikro kolonu 3 DIV ile...

Watch this Scientific Journal Video about Anatomically Inspired Three-dimensional Micro-tissue Engineered Neural Networks for Nervous System Reconstruction, Modulation, and Modeling at JoVE.com

Anatomically Inspired Three-dimensional Micro-tissue Engineered Neural Networks for Nervous System Reconstruction, Modulation, and Modeling

Bu el yazması, mikro-doku ile tasarlanmış sinir ağlarının imalatını ayrıntılarıyla anlatmaktadır: boru biçiminde bir hidrojel içine konan agrega nöronal popülasyon (lar) yı kapsayan uzunlamasına hizalanmış aksonal yollardan oluşan üç boyutlu mikron boyutlu yapılar. Bu canlı iskele, sinirsel devreleri yeniden yapılandırmak veya modüle etmek için fonksiyonel röleler veya gri-beyaz madde nöroanatomisini taklit eden biyofiziksel test yatakları olarak işlev görebilir.

Sinir Sistemi Yeniden Yapılanma, Modülasyon ve Modelleme için Anatomik olarak İlham Almış Üç Boyutlu Mikro-Dokulu Mühendisli Sinir Ağları

Functional recovery rarely occurs&#160;following injury or disease-induced degeneration within the central nervous system (CNS)&#160;due to the inhibitory ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Designing and Implementing Nervous System Simulations on LEGO Robots

LEGO Robotlar Sinir Sistemi simülasyonlar Tasarlama ve uygulama

We present a method to use the commercially available LEGO Mindstorms NXT robotics platform to test systems level neuroscience hypotheses. The first step ...

Neural Circuit Recording from an Intact Cockroach Nervous System

Sinir Devre Kaydı bir Bozulmamış Hamamböceği Sinir Sistemi

The cockroach ventral nerve cord preparation is a tractable system for neuroethology experiments, neural network modeling, and testing the physiological ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Kemirgen Santral Sinir Sistemi vivo optogenetic Stimülasyon içinde

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Modeling Astrocytoma Pathogenesis In Vitro and In Vivo Using Cortical Astrocytes or Neural Stem Cells from Conditional, Genetically Engineered Mice

Modeling Astrocytoma Pathogenesis In Vitro and In Vivo Using Cortical Astrocytes or Neural Stem Cells from Conditional, Genetically Engineered Mice

Modelleme Astrositom Patogenez<em&gt; İn Vitro</em&gt; Ve<em&gt; In Vivo</em&gt; Kortikal Astrositler veya Şartlı, Genetiği fareler ile Nöral Kök Hücreler kullanma

Current astrocytoma models are limited in their ability to define the roles of oncogenic mutations in specific brain cell types during disease ...

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

Sırt kök ganglion Modeli: Kanserli Sinir Invasion Vitro Modelleme

One way that solid tumors disseminate is through neural invasion. This route is well-known in cancers of the head and neck, prostate, and pancreas. These ...

Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

Astrositler Üç boyutlu Konfokal Morfometrik Analizi Protokolü

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify ...

Quadruple Immunostaining of the Olfactory Bulb for Visualization of Olfactory Sensory Axon Molecular Identity Codes

Koku Meşfatının Olfaktör Duyusal Akson Moleküler Kimlik Kodlarının Görselleştirilmesi İçin Dörtlü İmmün Sulanması

The mouse olfactory system is often used to study mechanisms of neural circuit formation&#12288;because of its simple anatomical structure. An Olfactory ...

Simultaneous Recordings of Cortical Local Field Potentials, Electrocardiogram, Electromyogram, and Breathing Rhythm from a Freely Moving Rat

Kortikal yerel alan potansiyelleri, Elektrokardiyogram, Electromyogram ve ritim serbestçe hareket bir sıçan gelen nefes eşzamanlı kayıt

Monitoring the physiological dynamics of the brain and peripheral tissues is necessary for addressing a number of questions about how the brain controls ...

Three-Dimensional Shape Modeling and Analysis of Brain Structures

Beyin Yapılarının Üç Boyutlu Şekil Modellemesi ve Analizi

Statistical shape analysis of brain structures has been used to investigate the association between their structural changes and pathological processes. ...

Transplantation of Chemogenetically Engineered Cortical Interneuron Progenitors into Early Postnatal Mouse Brains

Erken Doğum Sonrası Fare Beyinlerine Kemogenetik Mühendislik Kortikal İnkornöron Progenitorlarının Nakli

Neuronal development is regulated by a complex combination of environmental and genetic factors. Assessing the relative contribution of each component is ...