Name: high-resolution imaging and analysis of individual astral microtubule dynamics in budding yeast
Uploaded: 2017-04-20T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-resolution Imaging and Analysis of Individual Astral Microtubule Dynamics in Budding Yeast at JoVE.com

Wij danken Kerry Bloom (Universiteit van North Carolina), Kyung Lee (NCI), Steven Markus (Colorado State University) en Elmar Schiebel (Universität Heidelberg) voor het delen van diverse FP-TUB1 plasmiden. We zijn dankbaar voor Melissa Gardner (Universiteit van Minnesota) voor ons trainen in de schuif kamer bereidingswijze. Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health (NIH) verlenen R01GM112893-01A1 (naar JKM) en T32GM008730 (CE).

1. Voorbereiding Leu Dropout Plates <ol><li> Voeg 800 ml steriel, gedeïoniseerd water (Dih 2 O) in een 2 L kolf. Voeg 26.71 g uitval base (DOB) poeder, 0,69 g CSM-Leu, en 20 g agar. Mengen met een magnetische roerstaaf. Breng op 1 L met dih 2 O. </li><li> Autoclaaf bij 121 ° C en 19 psi gedurende 30 min. </li><li> Neem de kolf uit de autoclaaf laten afkoelen tot -65 ° C onder zacht roeren. </li><li> Giet 30 ml / plaat in 100 mm platen. Laat deze staan ​​bij kamertemperatuur gedurende 36-48...

<ol>
	<li>Zanic, M., Widlund, P. O., Hyman, A. A., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergy+between+XMAP215+and+EB1+increases+microtubule+growth+rates+to+physiological+levels.">Synergy between XMAP215 and EB1 increases microtubule growth rates to physiological levels.</a> Nat Cell Biol. 15 (6), 688-693 (2013).</li><li>Mimori-Kiyosue, Y., Shiina, N., Tsukita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamic+behavior+of+the+APC-binding+protein+EB1+on+the+distal+ends+of+microtubules.">The dynamic behavior of the APC-binding protein EB1 on the distal ends of microtubules.</a> Curr Biol. 10 (14), 865-868 (2000).</li><li>Byers, B., Goetsch, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavior+of+spindles+and+spindle+plaques+in+the+cell+cycle+and+conjugation+of+Saccharomyces+cerevisiae.">Behavior of spindles and spindle plaques in the cell cycle and conjugation of Saccharomyces cerevisiae.</a> J Bacteriol. 124 (1), 511-523 (1975).</li><li>Marschall, L. G., Jeng, R. L., Mulholland, J., Stearns, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Tub4p,+a+yeast+gamma-tubulin-like+protein:+implications+for+microtubule-organizing+center+function.">Analysis of Tub4p, a yeast gamma-tubulin-like protein: implications for microtubule-organizing center function.</a> J Cell Biol. 134 (2), 443-454 (1996).</li><li>Spang, A., Geissler, S., Grein, K., Schiebel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=gamma-Tubulin-like+Tub4p+of+Saccharomyces+cerevisiae+is+associated+with+the+spindle+pole+body+substructures+that+organize+microtubules+and+is+required+for+mitotic+spindle+formation.">gamma-Tubulin-like Tub4p of Saccharomyces cerevisiae is associated with the spindle pole body substructures that organize microtubules and is required for mitotic spindle formation.</a> J Cell Biol. 134 (2), 429-441 (1996).</li><li>Winey, M., Bloom, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+spindle+form+and+function.">Mitotic spindle form and function.</a> Genetics. 190 (4), 1197-1224 (2012).</li><li>Gupta, M. L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=beta-Tubulin+C354+mutations+that+severely+decrease+microtubule+dynamics+do+not+prevent+nuclear+migration+in+yeast.">beta-Tubulin C354 mutations that severely decrease microtubule dynamics do not prevent nuclear migration in yeast.</a> Mol Biol Cell. 13 (8), 2919-2932 (2002).</li><li>Moore, J. K., Cooper, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinating+mitosis+with+cell+polarity:+Molecular+motors+at+the+cell+cortex.">Coordinating mitosis with cell polarity: Molecular motors at the cell cortex.</a> Semin Cell Dev Biol. 21 (3), 283-289 (2010).</li><li>Gartz Hanson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+alpha-tubulin+mutation+disrupts+neural+development+and+tubulin+proteostasis.">Novel alpha-tubulin mutation disrupts neural development and tubulin proteostasis.</a> Dev Biol. 409 (2), 406-419 (2016).</li><li>Fees, C. P., Aiken, J., O'Toole, E. T., Giddings, T. H. J., Moore, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+negatively+charged+carboxy-terminal+tail+of+beta-tubulin+promotes+proper+chromosome+segregation.">The negatively charged carboxy-terminal tail of beta-tubulin promotes proper chromosome segregation.</a> Mol Biol Cell. 27 (11), 1786-1796 (2016).</li><li>Song, S., Lee, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+function+of+Saccharomyces+cerevisiae+CDC5+in+cytokinesis.">A novel function of Saccharomyces cerevisiae CDC5 in cytokinesis.</a> J Cell Biol. 152 (3), 451-469 (2001).</li><li>Knop, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epitope+tagging+of+yeast+genes+using+a+PCR-based+strategy:+more+tags+and+improved+practical+routines.">Epitope tagging of yeast genes using a PCR-based strategy: more tags and improved practical routines.</a> Yeast. 15 (10B), 963-972 (1999).</li><li>Kosco, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+microtubule+dynamics+by+Stu2p+is+essential+for+spindle+orientation+and+metaphase+chromosome+alignment+in+yeast.">Control of microtubule dynamics by Stu2p is essential for spindle orientation and metaphase chromosome alignment in yeast.</a> Mol Biol Cell. 12 (9), 2870-2880 (2001).</li><li>Toso, R. J., Jordan, M. A., Farrell, K. W., Matsumoto, B., Wilson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+stabilization+of+microtubule+dynamic+instability+in+vitro+by+vinblastine.">Kinetic stabilization of microtubule dynamic instability in vitro by vinblastine.</a> Biochemistry. 32 (5), 1285-1293 (1993).</li><li>Aiken, J., Sept, D., Costanzo, M., Boone, C., Cooper, J. A., Moore, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+reveals+novel+and+discrete+functions+for+tubulin+carboxy-terminal+tails.">Genome-wide analysis reveals novel and discrete functions for tubulin carboxy-terminal tails.</a> Curr Biol. 24 (12), 1295-1303 (2014).</li><li>Straight, A. F., Marshall, W. F., Sedat, J. W., Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitosis+in+living+budding+yeast:+anaphase+A+but+no+metaphase+plate.">Mitosis in living budding yeast: anaphase A but no metaphase plate.</a> Science. 277 (5325), 574-578 (1997).</li><li>Khmelinskii, A., Lawrence, C., Roostalu, J., Schiebel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdc14-regulated+midzone+assembly+controls+anaphase+B.">Cdc14-regulated midzone assembly controls anaphase B.</a> J Cell Biol. 177 (6), 981-993 (2007).</li><li>Markus, S. M., Omer, S., Baranowski, K., Lee, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+Plasmids+for+Fluorescent+Protein+Tagging+of+Microtubules+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Improved Plasmids for Fluorescent Protein Tagging of Microtubules in Saccharomyces cerevisiae.</a> Traffic. 16 (7), 773-786 (2015).</li></ol>

De gist model biedt grote voordelen voor het verzamelen van hoge-resolutie metingen van de dynamiek van microtubuli in een in vivo setting, inclusief de mogelijkheid om enkel beeld microtubules loop van de tijd en het vermogen om tubulines en microtubule toezichthouders gebruik van de tools van gist genetica te manipuleren. De concanavaline A-beklede kamers bieden een aantal voordelen ten opzichte van eerder beschreven inrichtingen, met inbegrip van gesmolten agar pads. Objectglaasj...

Microtubuli zijn cytoskelet polymeren van αβ-tubuline eiwit subeenheden en worden gebruikt in een grote verscheidenheid aan cellulaire contexten, zoals intracellulair transport, celdeling, morfogenese en motiliteit. Om microtubule netwerken op te bouwen voor deze verschillende rollen, moet cellen zorgvuldig te reguleren waar en wanneer microtubuli vorm. Deze regeling wordt bewerkstelligd door regeling van de reacties die ofwel assembleren αβ-tubuline subeenheden in microtubule polymeren of demonteren microtubules het vrije subeenheden; dit staat bekend als de dynamiek van microtubuli. Een belangrijk doel van het veld microtubule is om de moleculaire mechanismen die de dynamica van microtubuli, waaronder studies van de αβ-tubuline subeenheden en extrinsieke toezichthouders die zich binden aan tubuline en / of aan microtubuli te reguleren op te helderen. Een gevestigde experimentele benadering om dit systeem te reconstitueren in vitro met gezuiverd tubuline αβ-eiwit, vaak combinatie met gezuiverd extrinsieke regulatoren. Hoewel dit een nuttige aanpak, is het duidelijk dat de dynamiek van microtubuli in gereconstitueerde systemen verschilt sterk van die in levende cellen. Bijvoorbeeld, microtubules sneller groeien en krimpen langzamer in vivo dan in vitro. Dit verschil wordt toegeschreven aan de beschikbaarheid van bekende extrinsieke regulators 1, alsmede een nog-undefined factoren in cellen. Daarom is het van cruciaal belang voor de activiteiten van de microtubule regelgevers en mutanten die dynamiek in een native cellulaire context verstoren bepalen. Hoewel metazoan modellen hebben bewezen aan de heersende systemen voor het onderzoeken van microtubule functie en hogere orde organisatie, streng een aantal praktische bezwaren het nut van deze modellen te beperken voor de precieze meting van de dynamiek van microtubuli. Ten eerste, het grote aantal microtubuli, variërend van tientallen tot duizenden per cel, maakt het moeilijk om vol vertrouwentraceren individuele microtubules in de tijd. Vele studies pakken deze uitdaging door beeldvorming eiwitten die selectief lokaliseren microtubuli doeleinden, zoals eiwitten in het einde binding (EB) familie. Echter, deze eiwitten waarvan bekend is uitsluitend gelokaliseerd aan de uiteinden van microtubuli in meercelligen 2. Daarom is het nut van deze eiwitten beperkt tot het rechtstreeks meten van groei, terwijl slechts indirect meten van andere aspecten van de dynamiek, zoals de frequentie van een catastrofe. Ten tweede, ondanks de vooruitgang in het genoom van het bewerken technologie, het creëren van cellen die stabiel fluorescent gelabeld tubuline of het introduceren van mutaties om selectief te manipuleren tubuline of microtubule toezichthouders uit te drukken blijft een belangrijke uitdaging. Bovendien is de aanwezigheid van vele tubuline isotypes in metazoa verwart de studie van hoe mutaties invloed hebben op de individuele tubuline genen. Het gist-systeem biedt een aantal belangrijke voordelen voor het meten van in vivo microtubule dynamiek. Gist een vereenvoudigd microtubule netwerk dat visualisatie van individuele microtubules toelaat. In gist microtubules afkomstig uit het organiseren centra bekend als spil poolelementen (SPBs), die zijn ingebed in de kern envelop 3. De SPBs dienen als scaffolds voor γ-tubuline kleine complexen die microtubules 4, 5 kiemen. SPBs nucleëren twee klassen van microtubuli, spindel microtubuli en astrale microtubuli. Spindel microtubuli uitsteken in de nucleoplasma en zijn belangrijk voor bevestiging aan chromosomen via kinetochoor microtubuli en voor het stabiliseren van de spil via overlappende interpolaire microtubuli 6. Daarentegen worden microtubuli stervormig naar buiten uitsteken in de cytosol en relatief zeldzaam in vergelijking met het dichte net van spindel microtubuli. Tijdens de mitose, pre-anafase cellen slechts 1-2 stervormig microtubules afkomstig van ofwel SPB; deze bestaan ​​als individuele microtubuli plaats van als bundels 7. De rol van stervormige microtubuli tijdens mitose is om de kern en spil verplaatsen naar de verbinding tussen de moeder en knop compartimenten, bekend als het gewas hals. Deze beweging gaat goed gedefinieerde paden die te genereren op stervormige microtubules, trekken de kern en de spil naar en uiteindelijk in de kiem hals 8. Een ander voordeel van het gistsysteem is het nut van de genetica, die kan worden gebruikt om microtubuli regelaars en tubuline subeenheden onderzoeken met ongekende nauwkeurigheid. Gist bezitten ook een vereenvoudigde repertoire van tubuline isotypen: een β-tubuline-gen (tub2) en twee α-tubuline-genen (TUB1 en TUB3). Mutaties kunnen gemakkelijk worden ingebracht in deze genen en daardoor bestudeerd in een homogene tubuline populatie 9, 10. Er zijn een aantal grote schaalbeschikbaar constructen voor labeling microtubuli, en deze kunnen worden gericht voor integratie op chromosomale loci voor stabiele expressie (zie discussie). Het algemene doel van deze methode is enkel beeld microtubuli in levende gistcellen in vier dimensies (X, Y, Z en T) voor hoge-resolutie metingen dynamiek van microtubuli. Werkwijzen voor het integreren van constructen voor de constitutieve, lage expressie van fluorescent gelabeld tubuline in gistcellen beschreven. Voorafgaand aan beeldvorming worden levende cellen gemonteerd op slede kamers bekleed met de lectine Concanavaline A aan de cellen op lange termijn imaging stabiliseren. De optimale parameters voor beeldopname, alsook een werkstroom voor gegevensanalyse, worden ook beschreven.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>DOB (dropout bases)</td>
			<td>Sunrise science&#160;</td>
			<td>1650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CSM-Leu</td>
			<td>Sunrise science&#160;</td>
			<td>1005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Ameresco</td>
			<td>N833</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100mm polystyrene plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ssDNA (Samon Sperm)&#160; in sterile DiH2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>&#160;D7656</td>
			<td>resuspend at 10 mg/mL in DiH2O. Store aliquots at -20 &#186;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthetic Complete Media&#160;</td>
			<td>Sunrise science&#160;</td>
			<td>1459-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concanavalin A</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>L7647</td>
			<td>resuspend at 2 mg/mL in DiH2O. Store aliquots at -20 &#186;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Coverslips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-541-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-374-12</td>
			<td>paraffin film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VALAP (Equal parts of Vaseline, lanolin and paraffin)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>melt at 75 &#186;C before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forceps&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>16-100-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poyethylene glycol (PEG) 3350</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>202444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ti E inverted Perfect Focus microscope</td>
			<td>Nikon Instruments</td>
			<td>MEA53100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.45 NA 100x CFI Plan Apo objective</td>
			<td>Nikon Instruments</td>
			<td>MRD01905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Piezo electric stage&#160;</td>
			<td>Physik Instrumente</td>
			<td>P-736</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinning disk scanner</td>
			<td>Yokogawa</td>
			<td>CSU10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser combiner module</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>MCL400B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMCCD camera</td>
			<td>Andor Technology</td>
			<td>iXon Ultra 897&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elements software</td>
			<td>Nikon Instruments</td>
			<td>MQS31100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel software</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB software</td>
			<td>MathWorks, Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ64</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, http://imagej.nih.gov/ij/, 1997-2016.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Formats Importer plug-in</td>
			<td>Open Microscopy Environment</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pUC19-LEU2::GFP-TUB1</td>
			<td></td>
			<td>pSK1050</td>
			<td>reference: Song, S. and Lee, K. S. A novel function of Saccharomyces cerevisiae CDC5 in cytokinesis. J Cell Biol. 152 (3), 451-469 (2001)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-resolution imaging and analysis of individual astral microtubule dynamics in budding yeast

Dynamische microtubules zijn van fundamenteel belang voor vele cellulaire processen en nauwkeurige metingen van de dynamiek van microtubuli kan inzicht geven in hoe cellen reguleren deze processen en hoe genetische mutaties invloed regelgeving te bieden. De kwantificering van de dynamiek van microtubuli in metazoan modellen heeft een aantal bijbehorende uitdagingen, waaronder een hoge microtubule dichtheid en beperkingen van genetische manipulaties. In contrast, de gist model biedt voordelen die deze uitdagingen te overwinnen. Dit protocol beschrijft een methode om de dynamica van enkelvoudige microtubuli in levende gistcellen te meten. Cellen die fluorescent gelabeld tubuline worden nageleefd geassembleerd dia kamers, waardoor stabiele time-lapse beeldacquisitie. Een uitgebreide gids voor snelle, is het vierdimensionale acquisitie ook verschaft, evenals een protocol voor het kwantificeren van de eigenschappen van de microtubuli in confocale afbeeldingsstapels. Deze werkwijze, in combinatie met gebruikelijke gistgenetica, provIDE benadering die uniek geschikt voor het kwantitatief beoordelen van de effecten van microtubule regulators of mutaties die de activiteit van tubuline subeenheden veranderen.

Het meten van de dynamiek van microtubuli in levende gistcellen biedt een dwingende instrument om te beoordelen hoe mutaties in genen die coderen voor microtubuli regulatoren of tubuline subeenheden invloed polymerisatie en depolymerisatie tarieven, alsmede de frequentie van de overgang tussen deze toestanden. Figuur 1 toont een tijdreeks van stervormige dynamiek van microtubuli in een wildtype cel en een mutante cel met een mutatie in β-tubuline (tub2- 430Δ)....

Watch this Scientific Journal Video about High-resolution Imaging and Analysis of Individual Astral Microtubule Dynamics in Budding Yeast at JoVE.com

High-resolution Imaging and Analysis of Individual Astral Microtubule Dynamics in Budding Yeast

Gist is een voordelige model voor het bestuderen van de dynamica van microtubuli in vivo vanwege de krachtige genetica en de eenvoud van het microtubule-cytoskelet. Het volgende protocol wordt beschreven hoe om te transformeren en cultuur gistcellen, verwerven confocale microscopie afbeeldingen en kwantitatief te analyseren dynamiek van microtubuli in levende gistcellen.

Hoge-resolutie beeldvorming en analyse van individuele Astral dynamiek van microtubuli in gist

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells ...

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring Replicative Life Span in the Budding Yeast

Het meten van replicatieve levensduur in de gist

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The budding ...

Analysis of the Development of a Morphological Phenotype as a Function of Protein Concentration in Budding Yeast

Analyse van de ontwikkeling van een morfologische fenotype als een functie van de eiwitconcentratie in gist

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of ...

Acquiring Fluorescence Time-lapse Movies of Budding Yeast and Analyzing Single-cell Dynamics using GRAFTS

Het verwerven Fluorescentie Time-lapse films van Budding gist en analyseren van Single-cell Dynamics behulp enten

Fluorescence time-lapse microscopy has become a powerful tool in the study of many biological processes at the single-cell level. In particular, movies ...

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

Ontluikende Gist Protein extractie en zuivering voor de Studie van de functie, interacties, en post-translationele modificaties

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

Snelle en efficiënte zebravis Genotyping Met behulp van PCR met een hoge resolutie Melt Analyse

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

Hoge-resolutie time-lapse beeldvorming en geautomatiseerde analyse van de dynamiek van microtubuli in Living humane navelstreng endotheelcellen

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Applications of pHluorin for Quantitative, Kinetic and High-throughput Analysis of Endocytosis in Budding Yeast

Toepassingen van pHluorin voor Quantitative, Kinetic en High-throughput analyse van de Humor in gist

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal ...

Using Microfluidic Devices to Measure Lifespan and Cellular Phenotypes in Single Budding Yeast Cells

Met behulp van microfluïdische apparaten te meten Levensduur en Cellulaire Phenotypes in Single Budding gistcellen

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects ...

Examination of Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics by Fluorescence Live-cell Microscopy

Onderzoek van de kern dynamiek van de mitotische en Meiotische splijtstof gist door fluorescentie-Live-cel microscopie

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does ...

Measurement of Microtubule Dynamics by Spinning Disk Microscopy in Monopolar Mitotic Spindles

Meting van de microtubulus dynamiek door draaiende schijf microscopie in monopolaire mitotische spindels

We describe a modification of an established method to determine microtubule dynamics in living cells. The protocol is based on the expression of a ...