Name: measuring protein binding to f-actin by co-sedimentation
Uploaded: 2017-05-18T12:30:00
Duration: 6 min 17 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Protein Binding to F-actin by Co-sedimentation at JoVE.com

وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منحة HL127711 ل أفك.

<ol>
	<li>Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+and+Actin-Binding+Proteins.">Actin and Actin-Binding Proteins.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 8 (8), (2016).</li><li>Hansen, M. D., Kwiatkowski, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+actin+dynamics+by+allosteric+regulation+of+actin+binding+proteins.">Control of actin dynamics by allosteric regulation of actin binding proteins.</a> Int Rev Cell Mol Biol. 303, 1-25 (2013).</li><li>Lappalainen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin-binding+proteins:+the+long+road+to+understanding+the+dynamic+landscape+of+cellular+actin+networks.">Actin-binding proteins: the long road to understanding the dynamic landscape of cellular actin networks.</a> Mol Biol Cell. 27 (16), 2519-2522 (2016).</li><li>Mullins, R. D., Hansen, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+studies+of+actin+filament+and+network+dynamics.">In vitro studies of actin filament and network dynamics.</a> Curr Opin Cell Biol. 25 (1), 6-13 (2013).</li><li>Miller, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Danio+rerio+alphaE-catenin+is+a+monomeric+F-actin+binding+protein+with+distinct+properties+from+Mus+musculus+alphaE-catenin.">Danio rerio alphaE-catenin is a monomeric F-actin binding protein with distinct properties from Mus musculus alphaE-catenin.</a> J Biol Chem. 288 (31), 22324-22332 (2013).</li><li>Wickline, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=alphaT-Catenin+Is+a+Constitutive+Actin-binding+alpha-Catenin+That+Directly+Couples+the+Cadherin.Catenin+Complex+to+Actin+Filaments.">alphaT-Catenin Is a Constitutive Actin-binding alpha-Catenin That Directly Couples the Cadherin.Catenin Complex to Actin Filaments.</a> J Biol Chem. 291 (30), 15687-15699 (2016).</li><li>Simpson, R. J., Adams, P. D., Golemis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Basic methods in protein purification and analysis : a laboratory manual. , (2009).</li><li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4.">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li><li>Dyballa, N., Metzger, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+and+sensitive+colloidal+coomassie+G-250+staining+for+proteins+in+polyacrylamide+gels.">Fast and sensitive colloidal coomassie G-250 staining for proteins in polyacrylamide gels.</a> J Vis Exp. (30), (2009).</li><li>Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+simple+and+informative+binding+assays.">A guide to simple and informative binding assays.</a> Mol Biol Cell. 21 (23), 4061-4067 (2010).</li><li>Hansen, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=alphaE-catenin+actin-binding+domain+alters+actin+filament+conformation+and+regulates+binding+of+nucleation+and+disassembly+factors.">alphaE-catenin actin-binding domain alters actin filament conformation and regulates binding of nucleation and disassembly factors.</a> Mol Biol Cell. 24 (23), 3710-3720 (2013).</li><li>Perrin, B. J., Ervasti, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+actin+gene+family:+function+follows+isoform.">The actin gene family: function follows isoform.</a> Cytoskeleton (Hoboken). 67 (10), 630-634 (2010).</li><li>Tondeleir, D., Vandamme, D., Vandekerckhove, J., Ampe, C., Lambrechts, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+isoform+expression+patterns+during+mammalian+development+and+in+pathology:+insights+from+mouse+models.">Actin isoform expression patterns during mammalian development and in pathology: insights from mouse models.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 66 (10), 798-815 (2009).</li><li>Prochniewicz, E., Janson, N., Thomas, D. D., Dela Cruz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cofilin+increases+the+torsional+flexibility+and+dynamics+of+actin+filaments.">Cofilin increases the torsional flexibility and dynamics of actin filaments.</a> J Mol Biol. 353 (5), 990-1000 (2005).</li><li>Kuhn, J. R., Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+measurements+of+actin+filament+polymerization+by+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy.">Real-time measurements of actin filament polymerization by total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Biophys J. 88 (2), 1387-1402 (2005).</li><li>Hansen, S. D., Zuchero, J. B., Mullins, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+actin:+purification+and+single+molecule+assembly+assays.">Cytoplasmic actin: purification and single molecule assembly assays.</a> Methods Mol Biol. 1046, 145-170 (2013).</li></ol>

ويعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

و أكتين المشارك الترسيب الفحص هو تقنية واضحة التي يمكن أن تحدد بسرعة ما إذا كان البروتين يربط F- أكتين. مع بعض التعديلات، ويمكن أيضا أن تستخدم تقنية لقياس تقارب التفاعل. بالإضافة إلى النقاط التي أثيرت في البروتوكول أعلاه، ينبغي النظر في القضايا التالية عند تصميم وإجراء وتفسير الفحص. بروتين الفائدة بروتين الطازجة أو المجمدة يمكن استخدامها في الفحص. إذا تم استخدام البروتين المجمد، فمن المستحسن أن تتم مقارنة النتائج مع الطازجة (أبدا المجمدة) البروتين لضمان أن التجميد لا يؤثر F- أكتين ملزمة. مصدر أكتين G العديد من التجارب التكوير استخدام G- أكتين معزولة عن العضلات بسبب وفرة النسبية. هناك ثلاثة أنماط أساسية أكتين في الثدييات - ألفا، بيتا وجاما - التي هي مشابهة بشكل ملحوظ (&gt; 90٪ تسلسل إيدنتيتي واي). ومع ذلك، هناك اختلافات وظيفية بين إيزوتيبس 12 ، 13 . إذا كان ذلك ممكنا، يجب أن يكون إيزوتيب G- أكتين المستخدمة في فحص ملزمة تطابق النمط الظاهري في الجسم الحي . على سبيل المثال، إذا اختبار البروتين أعرب في العضلات والهيكل العظمي، ألفا أكتين هو الخيار الافضل. إذا فحص البروتين أعرب في الخلايا الليفية، ينصح بيتا أكتين. استخدام فالويدين منذ فالويدين يربط F- أكتين، فإنه يمكن أن تتدخل أو حتى منع ربط بعض البروتينات ملزم F- أكتين (على سبيل المثال، كتل فالويدين كوفيلين من ربط خيوط أكتين) 14 . وهكذا، فالويدين ينبغي أن تستخدم بحذر والنتائج مقارنة مع عينات غير فالويدين المعالجة عندما يكون ذلك ممكنا. خلفية عالية ليس من غير المألوف للبروتينات إلى الرواسب في غياب F- أكتين ( الشكل 1A ، لا F- أكتين بيليه عينةق). ومع ذلك، يمكن لمستويات عالية من الترسيب الخلفية أن تخفي ترسيب الأكتين المشترك الحقيقي وتجعل من الصعب، إن لم يكن من المستحيل، تحديد ما إذا كان البروتين يربط F- أكتين أو لقياس تقارب التفاعل. إضافة بوليديكانول إلى المخزن المؤقت رد فعل (الخطوة 4.1) يمكن أن تقلل بشكل كبير من الخلفية، وهو حل سهل. إذا كان هذا لا يقلل من الخلفية، وضبط المخزن المؤقت رد فعل، تركيز الملح، و / أو درجة حرارة الحضانة قد يساعد. منحنى ملزم لتوليد منحنى ملزمة، فمن الضروري أن تختلف تركيز إما البروتين من الفائدة أو F- أكتين على مدى سلسلة من ردود الفعل. في الممارسة العملية، فإنه من الأسهل والأفضل للحفاظ على F- أكتين في تركيز ثابت وتختلف تركيز البروتين من الفائدة. الحفاظ على F- أكتين في تركيز ثابت (على سبيل المثال، 2 ميكرومتر) في مقايسة تكوير حدود محاصرة غير محددة في تركيزات أعلى من F- أكتين ويمنعإزالة البلمرة في تركيزات أقل من (0.5 ميكرومتر) من F- أكتين. يمكن منع إزالة البلمرة باستخدام فالويدين، على الرغم من أن هذا يدخل عامل تعقيد محتمل في النظام (انظر الخطوة 3.3 وما فوق). كما أن الحفاظ على F-أكتين عند تركيز ثابت يسمح لمقارنة (وتطبيع) بيليه F- أكتين عبر العينات وتحديد التجارب الفاشلة ( أي حيث يكون بيليه F- أكتين متغير بدرجة كبيرة، مما يمنع التحليل عبر التركيزات). وأخيرا، والحفاظ على F- أكتين في تركيز ثابت يسمح واحد لتحديد ما إذا كان ملزم خيوط أكتين تعاونية ( الشكل 1C ). مشبعة ملزمة كما هو الحال في جميع التجارب ملزمة، فمن الأهمية بمكان أن الربط إلى F- الأكتين مشبعة وأن تركيز البروتين زائد الهضاب F- أكتين ( الشكل 1C ). دون هضبة، فإنه ليس من الممكن لحساب ثابت التفكك ثابت ثابت. وهكذا، فإنهمن المهم أن تخطط بعناية لسلسلة التخفيف ليتم اختبارها ودائما تشمل تركيزات أعلى من البروتين ( أي، على الأقل 5- إلى 10 أضعاف أعلى من المتوقع K د ). تحليل ملزم من أجل الثوابت التفكك قياس أن تكون حاسمة، وينبغي إجراء الفحص باستخدام تركيز F- الأكتين الذي يسمح لتركيز مواقع ملزمة على F- أكتين للبروتين من الفائدة لتكون أقل بكثير من تقارب. للتحقق من ما إذا تم استيفاء هذا المعيار، تقدير تركيز مواقع الربط من B ماكس . على سبيل المثال، إذا كان [F- أكتين] 2 ميكرومتر و B ماكس = 0.5، ثم [مواقع ملزمة] ≈ 1 ميكرومتر. وينبغي أن يكون K d على الأقل من 5 إلى 10 أضعاف أكبر من [المواقع الملزمة]. إذا كان المقياس K d من نفس الحجم من حيث [المواقع الملزمة]، فمن الممكن أن يمثل منحنى ملاحظ لوحظ معايرة من عالية تقارب ملزمة سيتيس بدلا من إيسوثرم ملزمة حقيقية. إذا لوحظ هذا، كرر الفحص باستخدام انخفاض 10 أضعاف تركيز F- الأكتين لقياس تقارب دقيق. للتفاعلات عالية تقارب، فالويدين الاستقرار (الخطوة 3.3) قد يكون ضروريا لتحقيق تركيز F- أكتين منخفضة بما فيه الكفاية لقياس تقارب بدقة. وأخيرا، هناك قيود أساسية مع الفحص المشترك الترسيب أن الباحثين يجب أن يكون على بينة من عند إجراء وتقييم الفحص. الأهم من ذلك، فإن مقايسة الترسيب المشترك لا تنتج ثابت التوازن الحقيقي. يتم فصل المنتجات من ملزمة ( أي البروتين زائد F- أكتين) من المواد المتفاعلة أثناء الطرد المركزي، وعندها يمكن للمنتجات ثم فصل لخلق توازن جديد. ونتیجة لذلك، یمکن أن یخطئ مقیاس الترسیب المشترك أو یخفق في الکشف عن التفاعلات المنخفضة الألفة. منذ العديد من البروتينات المرتبطة أكتين لديها تقارب منخفض ( أي، ميكرومولار) ل F- أكتين، نتيجة سلبية ( <eم&gt; أي، لا يمكن الكشف عنها ملزمة) في الفحص لا يعني بالضرورة أن البروتين لا ربط F- أكتين. كبديل، تيرف القائم على الفحص المجهري، وفحوصات واحدة خيوط ملزمة هي أكثر حساسية وأكثر دقة لتحديد ثابت التفكك (للاستعراضات على هذه التقنية، انظر المراجع 15،16 ). وعلى الرغم من هذه القيود، فإن فحص التكوير هو ضمن وسائل معظم الباحثين، وهو أداة فعالة لتحديد ما إذا كان البروتين يربط F- أكتين وقياس تقارب التفاعل.

أكتين هو بروتين الهيكل الخلوي الضروري الذي يلعب دورا حاسما في العمليات الخلوية متعددة، بما في ذلك الحركة، والانكماش، والتصاق، والتشكل 1 . أكتين موجود في شكلين: أكتين كروي أحادي (G- أكتين) وأكتين بلمرة خيطية (F- أكتين). داخل الخلايا، يتم التحكم في التنظيم F- أكتين من قبل مجموعة كبيرة من البروتينات التي تنظم تنوي، والنمو، عبر ربط وتفكيك شعيرات أكتين 2 ، 3 ، 4 . ومع ذلك، كيف العديد من البروتينات ملزمة أكتين تعمل في الحفل لتنظيم تنظيم شبكة أكتين لا يزال غير واضح إلى حد كبير. قياس التفاعلات البروتين البروتين هو نهج مهم لفهم كيفية بروتينات تمارس آثارها على السلوك الخلوي على مستوى الكيمياء الحيوية. العديد من المقايسات المختلفة يمكن استخدامها للكشف عن التفاعلات بين البروتينات المنقى.وتشمل النهج المشتركة للبروتينات القابلة للذوبان سحب المنسدلة، الاستقطاب مضان، كالوريمتري المعايرة متساوي الحرارة، والرنين بلاسمون السطح. الأهم من ذلك، كل هذه المقايسات تتطلب البروتينات لتكون قابلة للذوبان، وبالتالي من الصعب على التكيف للاستخدام مع البوليمرية، والخيطية البروتين مثل F- أكتين. هنا، نحن تصف تقنية - أكتين المشارك الترسيب، أو التكوير، فحص - لتحديد ما إذا كان بروتين أو مجال البروتين يربط F- أكتين وقياس تقارب التفاعل. مقايسة التكوير أكتين هي تقنية بسيطة نسبيا التي لا تتطلب معدات متخصصة، وبصرف النظر عن نابذة فائقة السرعة. ويمكن إجراء جميع الكواشف، على افتراض معرفة الكيمياء الحيوية الأساسية، أو شراؤها. مرة واحدة ملزمة ل F- أكتين يتم تأسيسها، ويمكن استخدام مقايسة لقياس تقارب واضح ( أي ثابت التفكك التوازن) 5 . أيضا، مرة واحدة يتم تأسيس تقارب، فحص التكويرهو أداة مفيدة لقياس كيفية التغيرات في البروتين من الفائدة ( أي التعديلات بعد متعدية، الطفرات، أو يجند ملزمة) تؤثر على تفاعلها مع F- أكتين 6 . تقنية لديها قيود (انظر المناقشة ) أن الباحث يجب أن يكون على بينة من قبل محاولة الفحص.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="842">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Sorvall MTX 150 Micro-Ultracentrifuge</td>
			<td style="width:224px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">46960</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">S100-AT3 rotor</td>
			<td style="width:224px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">45585</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Ultracentrifuge tubes - 0.2 ml</td>
			<td style="width:224px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">45233</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Actin, rabbit skeletal muscle</td>
			<td style="width:224px;">Cytoskeleton</td>
			<td style="width:119px;">AKL99</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:224px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A8531</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Polidicanol (Thesit)&#160;</td>
			<td style="width:224px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">88315</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Phalloidin</td>
			<td style="width:224px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">P3457</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td style="width:224px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">R0862</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Adenosine triphosphate (ATP)</td>
			<td style="width:224px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A2383</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Imidazole</td>
			<td style="width:224px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">O3196</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td style="width:224px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP358</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Magnesium Chloride (MgCl2)</td>
			<td style="width:224px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">M33</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td style="width:224px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">P217</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Ethylene glycol-bis(&#946;-aminoethyl ether)-N,N,N&#39;,N&#39;-tetraacetic acid (EGTA)</td>
			<td style="width:224px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">3779</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Odyssey CLx Imaging System</td>
			<td style="width:224px;">LI-COR</td>
			<td style="width:119px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Coomassie Brilliant Blue R-250 Dye</td>
			<td style="width:224px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">20278</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Colloidal Blue Staining Kit</td>
			<td style="width:224px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">LC6025</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring protein binding to f-actin by co-sedimentation

وينظم تنظيم أكتين الخيطية (F- أكتين) داخل الخلايا من قبل عدد كبير من البروتينات ملزمة أكتين التي تتحكم في تنوي الأكتين، والنمو، عبر ربط و / أو التفكيك. يصف هذا البروتوكول تقنية - الترسيب المشارك أكتين، أو التكوير، فحص - لتحديد ما إذا كان بروتين أو مجال البروتين يربط F- أكتين وقياس تقارب التفاعل ( أي ثابت التفكك التوازن). في هذه التقنية، يتم تحضين بروتين من الفائدة لأول مرة مع F- أكتين في الحل. ثم، يتم استخدام الطرد المركزي التفاضلي لترسيب خيوط أكتين، ويتم تحليل المواد بيليتد بواسطة سدز-بادج. إذا كان البروتين من الفائدة يربط F- أكتين، وسوف يشارك في الرواسب مع خيوط أكتين. ويمكن قياس المنتجات من رد فعل ملزمة ( أي F- أكتين والبروتين من الفائدة) لتحديد مدى تقارب التفاعل. المقايسة أكتين التكوير هو تقنية واضحة لتحديدإذا كان بروتين من الفائدة يربط F- أكتين ولتقييم كيفية التغييرات في هذا البروتين، مثل يجند ملزمة، تؤثر على تفاعلها مع F- أكتين.

فحصنا αE- كاتينين هوموديمر ملزمة ل F- أكتين في الفحص المشترك الترسيب. منذ التجارب السابقة أظهرت أن تقارب هوموديمير αE- كاتينين ل F- أكتين حوالي 1 ميكرومتر و B ماكس بالقرب 1 11 ، أجرينا الفحص مع تركيز منخفض من F- أكتين (0.2 ميكرومتر بدلا من 2 ميكرومتر، انظر المناقشة). منذ 0.2 ميكرومتر أقل من التركيز الحرج، وأضاف فالويدين لتحقيق الاستقرار في F- أكتين بلمرة من أرنب العضلات والهيكل العظمي G- أكتين (الخطوة 3.3). تم تحضين زيادة تركيزات هوموديمر αE- كاتينين (0.125-12.0 ميكرومتر) في وجود أو غياب 0.2 ميكرومتر F- أكتين. تم طرد العينات، وتم تحليل الكريات الناتجة ( الشكل 1A ). كما هو متوقع، هوموديمر αE- كاتينين المشارك الرسوبي مع F- أكتين فوق الخلفية ( الشكل 1A ، مقارنة عينات بيليه F- أكتين إلى لا F- أسالقصدير بيليه عينات). تم تشغيل بسا كسيطرة سلبية ( الشكل 1B ). تم قياس كمية البروتين وتآمر على البروتين الحر لحساب تقارب التفاعل ( الشكل 1C ). البيانات تآمر أفضل تناسب معادلة هيل. وكان K د المحسوب 2.9 ميكرومتر، وكان B ماكس 0.2، وكان معامل هيل (ح) 4.8. وهكذا، αE- كاتينين هوموديمر يربط F- أكتين بشكل تعاوني مع تقارب ميكرومولار منخفضة، بما يتفق مع العمل السابق (K د من 2.9 ميكرومتر مقابل ~ 1.0 ميكرومتر) 11 . <img alt="شكل 1" src="/files/ftp_upload/55613/55613fig1.jpg" /> الشكل 1: عالية السرعة F- أكتين المشارك الترسيب الفحص. ( أ ) زيادة التركيز (0.125-12.0 ميكرومتر) من هوموديمر αE- كاتينين مع (لوحات اليسار) أو بدون (لوحات اليمنى) 0.2 ميكرومتر F- أكتين استقرت مع فالويدين. تم احتضانهم لمدة 30 دقيقة في رت والطرد المركزي. تم فصل مجموع (7.5٪ من المواد بدءا) والمواد بيليتد (50٪ من المواد بيليه) من قبل سدز-بادج وملطخة صبغ كوماسي. ( B ) تم تشغيل 4 ميكرومتر بسا كسيطرة سلبية. تم فصل مجموع وبيليه العينات، مع (+) أو بدون (-) F- أكتين، سدز-بادج وملطخة صبغ كوماسي. ( C ) ملزمة αE- كاتينين (μM / ميكرومتر أكتين) من A تم تآمر ضد αE- كاتينين الحرة (μM)، والبيانات تناسب معادلة هيل (الخط الأحمر). يتم سرد K د ، B ماكس ، ومعامل هيل (ح). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55613/55613fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/55613/55613fig2.jpg" /> الشكل 2: أكتين التكوير الكمي </sترونغ&gt; - الرسم البياني. ويوضح هذا التخطيطي الخطوات الرئيسية في القسم 5، مع أمثلة من عينات توتال وبيليه ( A ، سي) والمنحنى القياسي ( B ) المستخدمة في القياس الكمي. 5.13 الخطوات: 1 ) قياس كمية البروتين من الفائدة في مجموع العينات (A). 2 ) توليد منحنى القياسية عن طريق التآمر كثافة الفرقة مقابل كتلة البروتين (B). 3 ) قياس كمية البروتين من الفائدة التي شاركت في الرسوبيات مع F- أكتين ( C ). 4 ) قياس كمية البروتين من الفائدة التي بيليتد في غياب F- أكتين ( D ). 5 ) طرح D من C لتحديد كمية البروتين ملزمة F- أكتين. 6 ) قياس كمية F- أكتين في كل بيليه (E)، وحساب متوسط ​​كمية F- أكتين لكل عينة، وتقسيم كل عينة حسب المتوسط ​​(الأرقام أدناه تظهر النسبة). 7 )لكل عينة، وتقسيم كمية البروتين ملزمة (المحسوبة في الخطوة 5) من قبل F- أكتين بيليه نسبة (المحسوبة في الخطوة 6) لضبط الاختلافات في بيليه. 8 ) استخدام منحنى القياسية ( B ) لحساب كمية (كتلة) من البروتين ملزمة تطبيع في كل عينة (الخطوة 7). 9 ) تحديد تركيز البروتين الحرة والبروتين ملزمة لخلق منحنى ملزمة. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55613/55613fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Protein Binding to F-actin by Co-sedimentation at JoVE.com

Measuring Protein Binding to F-actin by Co-sedimentation

يصف هذا البروتوكول طريقة لاختبار قدرة البروتين للمشاركة في الرواسب مع أكتين الخيطية (F- أكتين)، وإذا لوحظ ملزم، لقياس تقارب التفاعل.

قياس البروتين ملزمة ل F- أكتين بواسطة الترسيب المشترك

Filamentous actin (F-actin) organization within cells is regulated by a large number of actin-binding proteins that control actin nucleation, growth, ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Measuring G-protein-coupled Receptor Signaling via Radio-labeled GTP Binding

قياس إشارة مستقبلات G- البروتينات عبر الملزمة غتب المسمى راديو

G-Protein-Coupled Receptors (GPCRs) are a large family of transmembrane receptors that play critical roles in normal cellular physiology and constitute a ...

In Vitro Polymerization of F-actin on Early Endosomes

In Vitro Polymerization of F-actin on Early Endosomes

في المختبر بلمرة الأكتين و في وقت مبكر اندوسوميس

Many early endosome functions, particularly cargo protein sorting and membrane deformation, depend on patches of short F-actin filaments nucleated onto ...

Assay for Phosphorylation and Microtubule Binding Along with Localization of Tau Protein in Colorectal Cancer Cells

والرزن الفسفرة وملزمة Microtubule جنبا إلى جنب مع تعريب بروتين تاو في خلايا سرطان القولون والمستقيم

The microtubule-associated protein tau is a neuronal protein that localizes mostly in axons. Generally tau is essential for normal neuronal functioning ...

Measuring Biomolecular DSC Profiles with Thermolabile Ligands to Rapidly Characterize Folding and Binding Interactions

قياس الملامح الجزيئية البيولوجية DSC مع يغاندس ثيرمولابيلي لوصف سرعة قابلة للطي والربط التفاعلات

Differential scanning calorimetry (DSC) is a powerful technique for quantifying thermodynamic parameters governing biomolecular folding and binding ...

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

وصف SP0092 الركيزة-ملزمة-بروتين النقل الكربوهيدرات البيوكيميائية والهيكلية

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Rab10 Phosphorylation Detection by LRRK2 Activity Using SDS-PAGE with a Phosphate-binding Tag

كشف الفسفرة Rab10 بالنشاط LRRK2 باستخدام مخزونات النشر الاستراتيجي-الصفحة مع علامة ربط الفوسفات

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of ...

Measuring Trans-Plasma Membrane Electron Transport by C2C12 Myotubes

قياس الإلكترون غشاء البلازما عبر النقل بواسطة ميوتوبيس C2C12

Trans-plasma membrane electron transport (tPMET) plays a role in protection of cells from intracellular reductive stress as well as protection from damage ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

ميكروجرافيميتري المسرف لدراسة ديناميات ملزمة فسفوليبيد ملزمة البروتين أنيكسين A2 إلى بليرس الدهن الصلب-يؤيد استخدام جهاز رنان مرو

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Measuring and Interpreting Oxygen Consumption Rates in Whole Fly Head Segments

قياس وتفسير معدلات استهلاك الأوكسجين كلياً يطير رئيس قطاعات

Regulated metabolic activity is essential for the normal functioning of living cells. Indeed, altered metabolic activity is causally linked with the ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

قياس حساسية عالية من الانتماءات الملزمة الحمض النووي عامل النسخ بالتنافسية معايرة باستخدام مجهر الأسفار

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...