Name: measuring protein binding to f-actin by co-sedimentation
Uploaded: 2017-05-18T12:30:00
Duration: 6 min 17 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Protein Binding to F-actin by Co-sedimentation at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health Grant HL127711 til AVK.

<ol>
	<li>Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+and+Actin-Binding+Proteins.">Actin and Actin-Binding Proteins.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 8 (8), (2016).</li><li>Hansen, M. D., Kwiatkowski, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+actin+dynamics+by+allosteric+regulation+of+actin+binding+proteins.">Control of actin dynamics by allosteric regulation of actin binding proteins.</a> Int Rev Cell Mol Biol. 303, 1-25 (2013).</li><li>Lappalainen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin-binding+proteins:+the+long+road+to+understanding+the+dynamic+landscape+of+cellular+actin+networks.">Actin-binding proteins: the long road to understanding the dynamic landscape of cellular actin networks.</a> Mol Biol Cell. 27 (16), 2519-2522 (2016).</li><li>Mullins, R. D., Hansen, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+studies+of+actin+filament+and+network+dynamics.">In vitro studies of actin filament and network dynamics.</a> Curr Opin Cell Biol. 25 (1), 6-13 (2013).</li><li>Miller, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Danio+rerio+alphaE-catenin+is+a+monomeric+F-actin+binding+protein+with+distinct+properties+from+Mus+musculus+alphaE-catenin.">Danio rerio alphaE-catenin is a monomeric F-actin binding protein with distinct properties from Mus musculus alphaE-catenin.</a> J Biol Chem. 288 (31), 22324-22332 (2013).</li><li>Wickline, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=alphaT-Catenin+Is+a+Constitutive+Actin-binding+alpha-Catenin+That+Directly+Couples+the+Cadherin.Catenin+Complex+to+Actin+Filaments.">alphaT-Catenin Is a Constitutive Actin-binding alpha-Catenin That Directly Couples the Cadherin.Catenin Complex to Actin Filaments.</a> J Biol Chem. 291 (30), 15687-15699 (2016).</li><li>Simpson, R. J., Adams, P. D., Golemis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Basic methods in protein purification and analysis : a laboratory manual. , (2009).</li><li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4.">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li><li>Dyballa, N., Metzger, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+and+sensitive+colloidal+coomassie+G-250+staining+for+proteins+in+polyacrylamide+gels.">Fast and sensitive colloidal coomassie G-250 staining for proteins in polyacrylamide gels.</a> J Vis Exp. (30), (2009).</li><li>Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+simple+and+informative+binding+assays.">A guide to simple and informative binding assays.</a> Mol Biol Cell. 21 (23), 4061-4067 (2010).</li><li>Hansen, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=alphaE-catenin+actin-binding+domain+alters+actin+filament+conformation+and+regulates+binding+of+nucleation+and+disassembly+factors.">alphaE-catenin actin-binding domain alters actin filament conformation and regulates binding of nucleation and disassembly factors.</a> Mol Biol Cell. 24 (23), 3710-3720 (2013).</li><li>Perrin, B. J., Ervasti, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+actin+gene+family:+function+follows+isoform.">The actin gene family: function follows isoform.</a> Cytoskeleton (Hoboken). 67 (10), 630-634 (2010).</li><li>Tondeleir, D., Vandamme, D., Vandekerckhove, J., Ampe, C., Lambrechts, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+isoform+expression+patterns+during+mammalian+development+and+in+pathology:+insights+from+mouse+models.">Actin isoform expression patterns during mammalian development and in pathology: insights from mouse models.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 66 (10), 798-815 (2009).</li><li>Prochniewicz, E., Janson, N., Thomas, D. D., Dela Cruz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cofilin+increases+the+torsional+flexibility+and+dynamics+of+actin+filaments.">Cofilin increases the torsional flexibility and dynamics of actin filaments.</a> J Mol Biol. 353 (5), 990-1000 (2005).</li><li>Kuhn, J. R., Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+measurements+of+actin+filament+polymerization+by+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy.">Real-time measurements of actin filament polymerization by total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Biophys J. 88 (2), 1387-1402 (2005).</li><li>Hansen, S. D., Zuchero, J. B., Mullins, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+actin:+purification+and+single+molecule+assembly+assays.">Cytoplasmic actin: purification and single molecule assembly assays.</a> Methods Mol Biol. 1046, 145-170 (2013).</li></ol>

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.

Actin-co-sedimentationsassayet er en simpel teknik, der hurtigt kan bestemme, om et protein binder F-actin. Med nogle ændringer kan teknikken også bruges til at måle interaktionens affinitet. Ud over de punkter, der er rejst i protokollen ovenfor, bør følgende spørgsmål overvejes ved udformning, gennemførelse og tolkning af analysen. Protein af interesse Frisklavet eller frosset protein kan anvendes i analysen. Hvis der anvendes frosset protein, anbefales det stærkt, at resultaterne sammenlignes med frisk (aldrig frosset) protein for at sikre, at frysning ikke påvirker F-actinbindingen. G-actin Kilde Mange pelleteringsforsøg bruger G-actin isoleret fra muskel på grund af dets relative overflod. Der er tre hovedaktinisotyper hos pattedyr - alpha, beta og gamma - der er bemærkelsesværdigt ens (&gt; 90% sekvensidentifikatorty). Ikke desto mindre er der funktionelle forskelle mellem isotyperne 12 , 13 . Hvis det er muligt, bør G-actin-isotypen anvendt i bindingsassayet matche in vivo- isotypen. For eksempel, hvis man tester et protein udtrykt i skeletmuskulatur, er alpha-actin det bedste valg; Hvis man undersøger et protein udtrykt i fibroblaster, anbefales beta-actin. Phalloidin anvendelse Da phalloidin binder F-actin, kan det forstyrre eller endog blokere bindingen af ​​nogle F-actinbindende proteiner (fxoidoidin blokker cofilin fra binding til actinfilamenter) 14 . Phalloidin bør således anvendes med forsigtighed, og resultaterne sammenlignes med ikke-phalloidin-behandlede prøver, når det er muligt. Høj baggrund Det er ikke ualmindeligt for proteiner at sedimentere i fravær af F-actin ( Figur 1A , ingen F-aktin pellet prøves). Imidlertid kan høje niveauer af baggrundssedimentering maskere ægte aktinsam-sedimentering og gøre det vanskeligt, om ikke umuligt at bestemme, om et protein binder F-actin eller for at måle interaktionens affinitet. Tilsætning af polidicanol til reaktionsbufferen (trin 4.1) kan reducere baggrunden væsentligt og er en nem løsning. Hvis det ikke reducerer baggrunden, kan justering af reaktionsbufferen, saltkoncentrationen og / eller inkubationstemperaturen hjælpe. Bindende kurve For at generere en bindende kurve er det nødvendigt at variere koncentrationen af ​​enten proteinet af interesse eller F-actin over en række reaktioner. I praksis er det lettere og foretrukket at opretholde F-actin ved en fast koncentration og for at variere koncentrationen af ​​proteinet af interesse. Vedligeholdelse af F-actin ved en fast koncentration ( fx 2 μM) i pelleteringsassayet begrænser ikke-specifik fangst ved højere koncentrationer af F-actin og forhindrerDepolymerisering ved lavere (&lt;0,5 μM) koncentrationer af F-actin. Depolymerisering kan forhindres under anvendelse af phalloidin, selv om dette introducerer en potentiel komplicerende faktor i systemet (se trin 3.3 og derover). Vedligeholdelse af F-actin ved en fast koncentration gør det også muligt at sammenligne (og normalisere) F-actin-pelleten på tværs af prøver og for at identificere mislykkede forsøg ( dvs. hvor F-actin-pellet er stærkt variabel, hvilket forhindrer analyse på tværs af koncentrationer). Endelig tillader vedligeholdelse af F-actin ved en fast koncentration at bestemme, om bindingen til actinfilamentet er kooperativ ( figur 1C ). Mættet binding Som i alle bindende eksperimenter er det kritisk, at bindingen til F-actin er mættet, og at koncentrationen af ​​protein plus F-actinplader ( Figur 1C ). Uden et plateau er det ikke muligt at beregne en nøjagtig dissociation-ligevægtskonstant. Således detDet er vigtigt at omhyggeligt planlægge fortyndingsserien, som skal testes, og altid medtage højere koncentrationer af protein ( dvs. mindst 5-10 gange højere end den forventede K d ). Bindingsanalyse For at de målte dissociationskonstanter skal være afgørende skal analysen udføres ved anvendelse af en F-actinkoncentration, der tillader koncentrationen af ​​bindingssteder på F-actin for proteinet af interesse at være meget lavere end affiniteten. For at kontrollere om dette kriterium var opfyldt, estimerer koncentrationen af ​​bindingssteder fra B max . For eksempel, hvis [F-actin] var 2 μM og Bmax = 0,5, så [bindingssteder] ≈ 1 μM. K d bør være mindst 5- til 10 gange større end [bindingssteder]. Hvis den målte Kd er af samme størrelsesorden som [bindingssteder], er det muligt, at den observerede bindings kurve repræsenterer en titrering af højaffinitetsbindende siTes snarere end en sand bindende isotherm. Hvis dette observeres, gentag analysen ved hjælp af en 10 gange lavere F-actinkoncentration for at måle en nøjagtig affinitet. Til højaffinitetsinteraktioner kan phalloidin-stabilisering (trin 3.3) være nødvendig for at opnå en F-actinkoncentration, der er lav nok til nøjagtigt at måle affinitet. Endelig er der grundlæggende begrænsninger med co-sedimentationsassayet, som forskere bør være opmærksomme på, når de udfører og evaluerer analysen. Vigtigst af alt producerer co-sedimentationsassayet ikke en sand ligevægtskonstant. Produkterne af binding ( dvs. protein plus F-actin) adskilles fra reaktanterne under centrifugering, hvorefter produkterne derefter kan dissociere for at skabe en ny ligevægt. Som et resultat kan co-sedimentationsassayet fejlberegne eller undlade at detektere lavaffinitetsinteraktioner. Da mange actinbindende proteiner har en lav ( dvs. mikromolær) affinitet for F-actin, er et negativt resultat ( <eM&gt; dvs. ingen detekterbar binding) i analysen betyder ikke nødvendigvis, at et protein ikke binder F-actin. Som et alternativ er TIRF-mikroskopi-baserede, enkeltfilamentbindende assays mere følsomme og mere præcise til bestemmelse af en dissociationskonstant (for anmeldelser på denne teknik, se referencer 15,16 ). På trods af disse begrænsninger er pelleteringsassayet inden for de fleste forskeres midler, og det er et effektivt redskab til at bestemme, om et protein binder F-actin og måler affiniteten af ​​interaktionen.

Actin er et essentielt cytoskeletisk protein, der spiller en kritisk rolle i flere cellulære processer, herunder bevægelighed, sammentrækning, adhæsion og morfologi 1 . Actin eksisterer i to former: monomer globulært actin (G-actin) og polymeriseret filamentous actin (F-actin). Inden for celler styres F-actin-organisationen af ​​en stor samling proteiner, der regulerer kernen, vækst, tværbinding og demontering af actinfilamenter 2 , 3 , 4 . Men hvordan flere aktinbindende proteiner fungerer sammen for at regulere actin-netværksorganisationen er stadig stort set uklart. Måling af protein-protein-interaktioner er en vigtig tilgang til forståelse for, hvordan proteiner udøver deres virkninger på cellulær adfærd på det biokemiske niveau. Mange forskellige analyser kan anvendes til at detektere interaktioner mellem oprensede proteiner.Fælles fremgangsmåder for opløselige proteiner indbefatter pull-downs, fluorescenspolarisation, isotermisk titreringskalorimetri og overfladeplasmonresonans. Det er vigtigt, at alle disse analyser kræver proteiner, der er opløselige og er således vanskelige at tilpasse til anvendelse med et polymert, filamentøst protein, såsom F-actin. Her beskriver vi en teknik - actin co-sedimentering, eller pelletering, analyse - for at bestemme, om et protein eller protein domæne binder F-actin og for at måle affiniteten af ​​interaktionen. Actinpelleteringsassayet er en forholdsvis simpel teknik, der ikke kræver specialiseret udstyr, bortset fra en ultracentrifuge. Alle reagenser kan laves, forudsat viden om grundlæggende biokemi, eller købt. Når først binding til F-actin er etableret, kan analysen anvendes til at måle den tilsyneladende affinitet ( dvs. dissociation-ligevægtskonstanten) 5 . Også, når en affinitet er etableret, er pelleteringsassayetEr et nyttigt værktøj til måling af, hvordan ændringer i proteinet af interesse ( dvs. posttranslationelle modifikationer, mutationer eller ligandbindinger) påvirker dets interaktion med F-actin 6 . Teknikken har begrænsninger (se diskussionen ), som forskeren bør være opmærksom på, før forsøget udføres.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="842">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Sorvall MTX 150 Micro-Ultracentrifuge</td>
			<td style="width:224px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">46960</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">S100-AT3 rotor</td>
			<td style="width:224px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">45585</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Ultracentrifuge tubes - 0.2 ml</td>
			<td style="width:224px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">45233</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Actin, rabbit skeletal muscle</td>
			<td style="width:224px;">Cytoskeleton</td>
			<td style="width:119px;">AKL99</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:224px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A8531</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Polidicanol (Thesit)&#160;</td>
			<td style="width:224px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">88315</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Phalloidin</td>
			<td style="width:224px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">P3457</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td style="width:224px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">R0862</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Adenosine triphosphate (ATP)</td>
			<td style="width:224px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A2383</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Imidazole</td>
			<td style="width:224px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">O3196</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td style="width:224px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP358</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Magnesium Chloride (MgCl2)</td>
			<td style="width:224px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">M33</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td style="width:224px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">P217</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Ethylene glycol-bis(&#946;-aminoethyl ether)-N,N,N&#39;,N&#39;-tetraacetic acid (EGTA)</td>
			<td style="width:224px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">3779</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Odyssey CLx Imaging System</td>
			<td style="width:224px;">LI-COR</td>
			<td style="width:119px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Coomassie Brilliant Blue R-250 Dye</td>
			<td style="width:224px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">20278</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Colloidal Blue Staining Kit</td>
			<td style="width:224px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">LC6025</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring protein binding to f-actin by co-sedimentation

Filamentous actin (F-actin) organisering inden for celler reguleres af et stort antal actinbindende proteiner, der styrer actin-nucleering, vækst, tværbinding og / eller adskillelse. Denne protokol beskriver en teknik - aktinsam-sedimentering eller pelletering, analyse - for at bestemme, hvorvidt et protein eller protein domæne binder F-actin og for at måle interaktionens affinitet ( dvs. dissociation-ligevægtskonstanten). Ved denne teknik inkuberes først et protein af interesse med F-actin i opløsning. Derefter anvendes differentialcentrifugering til sedimentering af actinfilamenterne, og det pelleterede materiale analyseres ved SDS-PAGE. Hvis proteinet af interesse binder F-actin, vil det co-sedimentere med actinfilamenterne. Produkterne af bindingsreaktionen ( dvs. F-actin og proteinet af interesse) kan kvantificeres for at bestemme affiniteten af ​​interaktionen. Actinpelleteringsassayet er en retfærdig teknik til bestemmelseHvis et protein af interesse binder F-actin og til vurdering af, hvordan ændringer i proteinet, såsom ligandbinding, påvirker dets interaktion med F-actin.

Vi undersøgte aE-catenin-homodimerbinding til F-actin i co-sedimentationsassayet. Siden tidligere eksperimenter har vist, at α-catenin homodimers affinitet for F-actin er omkring 1 μM og B max nær 1 11 , gennemførte vi analysen med en lav koncentration af F-actin (0,2 μM i stedet for 2 μM; Diskussionen). Da 0,2 μM er under den kritiske koncentration blev phalloidin tilsat for at stabilisere F-actin polymeriseret fra kaninskeletmuskel G-actin (trin 3.3). Stigende koncentrationer af aE-catenin-homodimer (0,125-12,0 μM) blev inkuberet i nærvær eller fravær af 0,2 μM F-actin. Prøverne blev centrifugeret, og de resulterende pellets blev analyseret ( figur 1A ). Som forventet sammenligner aE-catenin-homodimeren co-sedimenteret med F-actin over baggrunden ( Figur 1A , F-aktinpelletprøverne til no-F-acTin pellet prøver). BSA blev kørt som en negativ kontrol ( Figur 1B ). Bundet protein blev kvantificeret og plottet over frit protein for at beregne affiniteten af ​​interaktionen ( figur 1C ). De plottede data passer bedst til en Hill-ligning. Den beregnede Kd var 2,9 μM, B max var 0,2, og Hill-koefficienten (h) var 4,8. Således binder aE-catenin-homodimer F-actin kooperativt med en lav mikromolær affinitet, der er i overensstemmelse med tidligere arbejde (en Kd på 2,9 μM versus ~ 1,0 μM) 11 . <img alt="figur 1" src="/files/ftp_upload/55613/55613fig1.jpg" /> Figur 1: High-speed F-actin co-sedimentation assay. ( A ) Øgede koncentrationer (0,125-12,0 μM) aE-catenin-homodimer blev inkuberet med (venstre panel) eller uden (højre paneler) 0,2 μM F-actin stabiliseret med phalloidin. De blev inkuberet i 30 minutter ved stuetemperatur og centrifugeret. Totalværdien (7,5% af udgangsmaterialet) og pelleteret materiale (50% af det pelleterede materiale) blev adskilt ved SDS-PAGE og farvet med Coomassie-farvestof. ( B ) 4 μM BSA blev kørt som en negativ kontrol. Samlede og pelletprøver med (+) eller uden (-) F-actin blev adskilt ved SDS-PAGE og farvet med Coomassie-farvestof. ( C ) Bundet αE-catenin (μM / μM actin) fra A blev plottet mod fri αE-catenin (μM), og dataene passer til en Hill-ligning (rød linje). Kd, Bmax og Hill-koefficienten (h) er angivet. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55613/55613fig1large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/55613/55613fig2.jpg" /> Figur 2: Actin-pelleteringskvantificering </sTrong&gt; - flow diagram. Denne skitse beskriver hovedtrin i afsnit 5 med eksempler på total- og pelletprøver ( A , CE ) og standardkurven ( B ) anvendt til kvantificering. 5.13 trin: 1 ) Mål mængden af ​​protein af interesse i de samlede prøver (A). 2 ) Generer en standardkurve ved at tegne båndintensiteten versus proteinmassen (B). 3 ) Mål mængden af ​​protein af interesse, der co-sedimenteres med F-actin ( C ). 4 ) Mål mængden af ​​protein af interesse, der pelleteres i fravær af F-actin ( D ). 5 ) Subtraher D fra C for at bestemme mængden af ​​protein bundet til F-actin. 6 ) Mål mængden af ​​F-actin i hver pellet (E), bereg den gennemsnitlige mængde F-actin pr. Prøve, og divider hver prøve med gennemsnittet (tallene nedenfor viser forholdet). 7 )For hver prøve opdele mængden af ​​bundet protein (beregnet i trin 5) ved F-aktin-pelletforholdet (beregnet i trin 6) for at justere for forskelle i pelleten. 8 ) Brug standardkurven ( B ) til at beregne mængden af ​​normaliseret bundet protein i hver prøve (trin 7). 9 ) Bestem koncentrationen af ​​frit protein og bundet protein for at skabe en bindende kurve. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55613/55613fig2large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Protein Binding to F-actin by Co-sedimentation at JoVE.com

Measuring Protein Binding to F-actin by Co-sedimentation

Denne protokol beskriver en metode til at teste proteinets evne til at co-sedimentere med filamentous actin (F-actin) og, hvis binding observeres, for at måle affiniteten af ​​interaktionen.

Måling af proteinbinding til F-actin ved co-sedimentering

Filamentous actin (F-actin) organization within cells is regulated by a large number of actin-binding proteins that control actin nucleation, growth, ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Measuring G-protein-coupled Receptor Signaling via Radio-labeled GTP Binding

Måling af G-proteinkoblet receptorreceptor via radio-mærket GTP-binding

G-Protein-Coupled Receptors (GPCRs) are a large family of transmembrane receptors that play critical roles in normal cellular physiology and constitute a ...

In Vitro Polymerization of F-actin on Early Endosomes

In Vitro Polymerization of F-actin on Early Endosomes

In Vitro Polymerisering af F-actin på tidlig Endosomes

Many early endosome functions, particularly cargo protein sorting and membrane deformation, depend on patches of short F-actin filaments nucleated onto ...

Assay for Phosphorylation and Microtubule Binding Along with Localization of Tau Protein in Colorectal Cancer Cells

Assay for fosforylering og mikrotubulus bindende sammen med lokalisering af Tau Protein i kolorektal cancerceller

The microtubule-associated protein tau is a neuronal protein that localizes mostly in axons. Generally tau is essential for normal neuronal functioning ...

Measuring Biomolecular DSC Profiles with Thermolabile Ligands to Rapidly Characterize Folding and Binding Interactions

Måling af Biomolekylær DSC profiler med termolabile ligander til hurtigt karakterisere foldning og bindende interaktioner

Differential scanning calorimetry (DSC) is a powerful technique for quantifying thermodynamic parameters governing biomolecular folding and binding ...

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

Biokemiske og strukturel karakterisering af kulhydrat Transport substrat-bindende-protein SP0092

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Rab10 Phosphorylation Detection by LRRK2 Activity Using SDS-PAGE with a Phosphate-binding Tag

Rab10 fosforylering påvisning af LRRK2 aktivitet ved hjælp af SDS-PAGE med en fosfat-bindende Tag

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of ...

Measuring Trans-Plasma Membrane Electron Transport by C2C12 Myotubes

Måling af Trans-Plasma membran elektron Transport af C2C12 Myotubes

Trans-plasma membrane electron transport (tPMET) plays a role in protection of cells from intracellular reductive stress as well as protection from damage ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Antistatiske Microgravimetry at studere bindende dynamikken i Phospholipid bindende Protein Annexin A2 til fast-understøttet Lipid dobbeltlag ved hjælp af et Quartz Resonator

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Measuring and Interpreting Oxygen Consumption Rates in Whole Fly Head Segments

Måling og fortolke ilt forbrug satser helt flyve hoved segmenter

Regulated metabolic activity is essential for the normal functioning of living cells. Indeed, altered metabolic activity is causally linked with the ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Høj følsomhed måling af transskription faktor-DNA bindende tilhørsforhold ved konkurrencedygtige titrering med Fluorescens mikroskopi

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...