Name: measuring protein binding to f-actin by co-sedimentation
Uploaded: 2017-05-18T12:30:00
Duration: 6 min 17 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Protein Binding to F-actin by Co-sedimentation at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health Grant HL127711 naar AVK.

<ol>
	<li>Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+and+Actin-Binding+Proteins.">Actin and Actin-Binding Proteins.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 8 (8), (2016).</li><li>Hansen, M. D., Kwiatkowski, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+actin+dynamics+by+allosteric+regulation+of+actin+binding+proteins.">Control of actin dynamics by allosteric regulation of actin binding proteins.</a> Int Rev Cell Mol Biol. 303, 1-25 (2013).</li><li>Lappalainen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin-binding+proteins:+the+long+road+to+understanding+the+dynamic+landscape+of+cellular+actin+networks.">Actin-binding proteins: the long road to understanding the dynamic landscape of cellular actin networks.</a> Mol Biol Cell. 27 (16), 2519-2522 (2016).</li><li>Mullins, R. D., Hansen, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+studies+of+actin+filament+and+network+dynamics.">In vitro studies of actin filament and network dynamics.</a> Curr Opin Cell Biol. 25 (1), 6-13 (2013).</li><li>Miller, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Danio+rerio+alphaE-catenin+is+a+monomeric+F-actin+binding+protein+with+distinct+properties+from+Mus+musculus+alphaE-catenin.">Danio rerio alphaE-catenin is a monomeric F-actin binding protein with distinct properties from Mus musculus alphaE-catenin.</a> J Biol Chem. 288 (31), 22324-22332 (2013).</li><li>Wickline, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=alphaT-Catenin+Is+a+Constitutive+Actin-binding+alpha-Catenin+That+Directly+Couples+the+Cadherin.Catenin+Complex+to+Actin+Filaments.">alphaT-Catenin Is a Constitutive Actin-binding alpha-Catenin That Directly Couples the Cadherin.Catenin Complex to Actin Filaments.</a> J Biol Chem. 291 (30), 15687-15699 (2016).</li><li>Simpson, R. J., Adams, P. D., Golemis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Basic methods in protein purification and analysis : a laboratory manual. , (2009).</li><li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4.">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li><li>Dyballa, N., Metzger, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+and+sensitive+colloidal+coomassie+G-250+staining+for+proteins+in+polyacrylamide+gels.">Fast and sensitive colloidal coomassie G-250 staining for proteins in polyacrylamide gels.</a> J Vis Exp. (30), (2009).</li><li>Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+simple+and+informative+binding+assays.">A guide to simple and informative binding assays.</a> Mol Biol Cell. 21 (23), 4061-4067 (2010).</li><li>Hansen, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=alphaE-catenin+actin-binding+domain+alters+actin+filament+conformation+and+regulates+binding+of+nucleation+and+disassembly+factors.">alphaE-catenin actin-binding domain alters actin filament conformation and regulates binding of nucleation and disassembly factors.</a> Mol Biol Cell. 24 (23), 3710-3720 (2013).</li><li>Perrin, B. J., Ervasti, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+actin+gene+family:+function+follows+isoform.">The actin gene family: function follows isoform.</a> Cytoskeleton (Hoboken). 67 (10), 630-634 (2010).</li><li>Tondeleir, D., Vandamme, D., Vandekerckhove, J., Ampe, C., Lambrechts, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+isoform+expression+patterns+during+mammalian+development+and+in+pathology:+insights+from+mouse+models.">Actin isoform expression patterns during mammalian development and in pathology: insights from mouse models.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 66 (10), 798-815 (2009).</li><li>Prochniewicz, E., Janson, N., Thomas, D. D., Dela Cruz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cofilin+increases+the+torsional+flexibility+and+dynamics+of+actin+filaments.">Cofilin increases the torsional flexibility and dynamics of actin filaments.</a> J Mol Biol. 353 (5), 990-1000 (2005).</li><li>Kuhn, J. R., Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+measurements+of+actin+filament+polymerization+by+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy.">Real-time measurements of actin filament polymerization by total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Biophys J. 88 (2), 1387-1402 (2005).</li><li>Hansen, S. D., Zuchero, J. B., Mullins, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+actin:+purification+and+single+molecule+assembly+assays.">Cytoplasmic actin: purification and single molecule assembly assays.</a> Methods Mol Biol. 1046, 145-170 (2013).</li></ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

De actin co-sedimentatie test is een eenvoudige techniek die snel kan bepalen of een eiwit F-actine bindt. Met enkele wijzigingen kan de techniek ook worden gebruikt om de affiniteit van de interactie te meten. Naast de punten die in het bovenstaande protocol zijn opgeworpen, dienen de volgende problemen in aanmerking te komen bij het ontwerpen, uitvoeren en interpreteren van de test. Proteïne van belang Vers bereid of bevroren eiwit kan in de test worden gebruikt. Als bevroren eiwit wordt gebruikt, wordt het sterk aanbevolen dat de resultaten worden vergeleken met vers (nooit bevroren) eiwitten om ervoor te zorgen dat het bevriezen geen invloed heeft op F-actin binding. G-actin Bron Veel pelleteringsexperimenten gebruiken G-actine geïsoleerd van spier door zijn relatieve overvloed. Er zijn drie belangrijkste actinisotypes in zoogdieren - alfa, bèta en gamma - die opmerkelijk gelijkwaardig zijn (&gt; 90% sequentie identity). Niettemin zijn er functionele verschillen tussen de isotypen 12 , 13 . Indien mogelijk, moet het G-actin isotype dat in de bindingsassay gebruikt wordt, overeenkomen met het in vivo isotype. Bijvoorbeeld, als een eiwit in de skeletspier wordt uitgedrukt, is alpha-actine de beste keuze; Als een eiwit wordt uitgedrukt in fibroblasten, wordt beta-actine aanbevolen. Phalloidin Gebruik Aangezien phalloidin F-actine bindt, kan het de binding van sommige F-actine bindende eiwitten blokkeren of zelfs blokkeren ( bijv. Phalloidin blokken cofiline van binding aan actinfilamenten) 14 . Zo moet phalloidin met voorzichtigheid worden gebruikt en de resultaten vergeleken met monsters die niet met phalloidine behandeld zijn, indien mogelijk. Hoge Achtergrond Het is niet ongewoon dat eiwitten sedimenten in afwezigheid van F-actine ( Figuur 1A , geen F-actine pelletmonsters). Echter, hoge niveaus van achtergrond sedimentatie kunnen true actin co-sedimentatie maskeren en het moeilijk maken, of niet onmogelijk, te bepalen of een eiwit F-actine bindt of de affiniteit van de interactie meet. Het toevoegen van polidicanol aan de reactiebuffer (stap 4.1) kan de achtergrond aanzienlijk verminderen en is een makkelijke oplossing. Als dat de achtergrond niet vermindert, kan het bijstellen van de reactiebuffer, zoutconcentratie en / of incubatietemperatuur helpen. Bindende Curve Om een ​​bindingscurve te genereren, is het nodig om de concentratie van het eiwit van belang of het F-actine over een reeks reacties te variëren. In de praktijk is het gemakkelijker en beter om F-actine bij een vaste concentratie te handhaven en de concentratie van het eiwit van belang te variëren. Het handhaven van F-actine bij een vaste concentratie ( bijv. 2 μM) in de pelleteringsbepaling beperkt de niet-specifieke inhaling bij hogere concentraties van F-actine en voorkomtDepolymerisatie bij lagere (&lt;0,5 μM) concentraties van F-actine. Depolymerisatie kan voorkomen worden met gebruik van phalloidine, hoewel dit een mogelijke complicerende factor in het systeem introducert (zie stap 3.3 en hoger). Het handhaven van F-actine bij een vaste concentratie maakt het ook mogelijk om de F-actin pellet over de monsters te vergelijken (en normaliseren) en om mislukte experimenten te identificeren ( dwz waar de F-actin pellet zeer variabel is, waardoor analyses over concentraties voorkomen). Tenslotte, het handhaven van F-actine bij een vaste concentratie maakt het mogelijk om te bepalen of de binding aan het actinfilament coöperatief is ( Figuur 1C ). Verzadigde Binding Zoals bij alle bindende experimenten is het van cruciaal belang dat de binding aan F-actine verzadigd is en dat de concentratie van eiwit plus F-actine plateaus ( Figuur 1C ). Zonder een plateau is het niet mogelijk om een ​​nauwkeurige dissociatie-evenwichtskonstante te berekenen. Zo, hetHet is belangrijk om de verdovingsreeks die moet worden getest, zorgvuldig te plannen en om altijd hogere concentraties eiwitten te bevatten ( dwz ten minste 5- tot 10 keer hoger dan de verwachte K d ). Bindende analyse Om de gemeten dissociatieconstanten concluderend te zijn, moet de test worden uitgevoerd met behulp van een F-actin concentratie die de concentratie van bindingsplaatsen op F-actine toelaat voor het belang van het eiwit veel lager dan de affiniteit. Om te controleren of aan dit criterium is voldaan, schat de concentratie bindingsplaatsen van B max . Bijvoorbeeld, als [F-actin] 2 μM en Bmax = 0,5 was, dan [bindingsplaatsen] ≈ 1 μM. De K d moet ten minste 5- tot 10-voudig groter zijn dan [bindingsplaatsen]. Als de gemeten Kd van dezelfde orde van grootte als [bindingsplaatsen] is, dan is het mogelijk dat de waargenomen bindingscurve een titratie van high affiniteitsbindende si vertegenwoordigtTes dan een echte bindende isotherm. Als dit wordt waargenomen, herhaal de test met een 10-voudige lagere F-actin concentratie om een ​​nauwkeurige affiniteit te meten. Voor interacties met hoge affiniteit kan falloidine stabilisatie (stap 3.3) nodig zijn om een ​​F-actin concentratie te bereiken die laag genoeg is om nauwkeurig affiniteit te meten. Tenslotte zijn er fundamentele beperkingen met de co-sedimentatie-analyse die onderzoekers moeten bewust zijn bij het uitvoeren en evalueren van de test. Het belangrijkste is dat de co-sedimentatie-analyse geen echte evenwichtskonstante produceert. De producten van binding ( dat wil zeggen eiwit plus F-actine) worden gescheiden van de reactanten tijdens centrifugeren, waarna de producten dan kunnen dissociëren om een ​​nieuw evenwicht te creëren. Als gevolg daarvan kan de co-sedimentatie-analyse misverwerkende of onvoldoende detecties voor lage-affiniteit detecteren. Aangezien veel actine-bindende eiwitten een lage ( d.w.z. micromolaire) affiniteit voor F-actine hebben, een negatief resultaat ( <eM&gt; dat wil zeggen geen detecteerbare binding) in de test betekent niet noodzakelijk dat een eiwit niet F-actine bindt. Als alternatief zijn TIRF-microscopie-gebaseerde bindingen met enkelfilamentbindingen gevoeliger en nauwkeuriger voor het bepalen van een dissociatieconstante (voor recensies op deze techniek, zie referenties 15,16 ). Ondanks deze beperkingen is de pelletietest binnen de middelen van de meeste onderzoekers en is een effectief instrument om te bepalen of een eiwit F-actine bindt en de affiniteit van de interactie meet.

Actin is een essentieel cytoskeletaal eiwit dat een cruciale rol speelt bij meerdere cellulaire processen, waaronder motiliteit, samentrekking, adhesie en morfologie 1 . Actin bestaat in twee vormen: monomeer globair actine (G-actine) en gepolymeriseerd filamenteuze actine (F-actine). Binnen de cellen wordt de F-actin organisatie gecontroleerd door een grote verzameling eiwitten die de nucleatie, groei, crosslinking en demontage van actinfilamenten 2 , 3 , 4 regelen. Echter, hoe meerdere actine-bindende eiwitten samenwerken om de actin netwerkorganisatie te regelen is nog steeds grotendeels onduidelijk. De meting van eiwit-eiwit interacties is een belangrijke aanpak om te begrijpen hoe eiwitten hun effect op cellulaire gedrag op het biochemische niveau uitoefenen. Veel verschillende analyses kunnen worden gebruikt om interacties tussen gezuiverde eiwitten te detecteren.Gemeenschappelijke benaderingen voor oplosbare eiwitten omvatten aftrekkingen, fluorescentie polarisatie, isotherme titratie calorimetrie en oppervlakte plasmon resonantie. Het is van belang dat alle van deze analyses eiwitten oplosbaar zijn en dus moeilijk kunnen worden aangepast voor gebruik met een polymeer, filamentvormig eiwit, zoals F-actine. Hier beschrijven we een techniek - de actin co-sedimentatie, of pelletering, analyse - om te bepalen of een eiwit of eiwit domein F-actine bindt en de affiniteit van de interactie meet. De actinpelletingassay is een relatief eenvoudige techniek die geen speciale apparatuur nodig heeft, afgezien van een ultracentrifuge. Alle reagentia kunnen worden gemaakt, met inachtneming van kennis van basis biochemie, of gekocht. Zodra bindend is aan F-actine is vastgesteld, kan de test gebruikt worden om de schijnbare affiniteit te meten ( dwz de dissociatie-evenwichtskonstante) 5 . Ook, zodra een affiniteit is vastgesteld, wordt de pelletietestIs een handig hulpmiddel om te meten hoe veranderingen in het eiwit van belang ( dat wil zeggen posttranslatie modificaties, mutaties of ligandbinding) de interactie met F-actine 6 beïnvloeden. De techniek heeft beperkingen (zie de discussie ) waaraan de onderzoeker zich moet bewust zijn voordat hij de test probeert.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="842">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Sorvall MTX 150 Micro-Ultracentrifuge</td>
			<td style="width:224px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">46960</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">S100-AT3 rotor</td>
			<td style="width:224px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">45585</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Ultracentrifuge tubes - 0.2 ml</td>
			<td style="width:224px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">45233</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Actin, rabbit skeletal muscle</td>
			<td style="width:224px;">Cytoskeleton</td>
			<td style="width:119px;">AKL99</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:224px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A8531</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Polidicanol (Thesit)&#160;</td>
			<td style="width:224px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">88315</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Phalloidin</td>
			<td style="width:224px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">P3457</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td style="width:224px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">R0862</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Adenosine triphosphate (ATP)</td>
			<td style="width:224px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A2383</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Imidazole</td>
			<td style="width:224px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">O3196</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td style="width:224px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP358</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Magnesium Chloride (MgCl2)</td>
			<td style="width:224px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">M33</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td style="width:224px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">P217</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Ethylene glycol-bis(&#946;-aminoethyl ether)-N,N,N&#39;,N&#39;-tetraacetic acid (EGTA)</td>
			<td style="width:224px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">3779</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Odyssey CLx Imaging System</td>
			<td style="width:224px;">LI-COR</td>
			<td style="width:119px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Coomassie Brilliant Blue R-250 Dye</td>
			<td style="width:224px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">20278</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Colloidal Blue Staining Kit</td>
			<td style="width:224px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">LC6025</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring protein binding to f-actin by co-sedimentation

Filamenteuze actine (F-actin) organisatie binnen cellen wordt gereguleerd door een groot aantal actine-bindende eiwitten die actin nucleatie, groei, cross-linking en / of demontage beheersen. Dit protocol beschrijft een techniek - de actin-co-sedimentatie, of pelletering, analyse - om te bepalen of een eiwit- of eiwitdomein F-actine bindt en de affiniteit van de interactie meet ( dwz de dissociatie-evenwichtskonstante). In deze techniek wordt eerst een eiwit van belang geïncubeerd met F-actine in oplossing. Daarna wordt differentiële centrifugatie gebruikt om de actinfilamenten te sedimenteren en het gepelleteerde materiaal wordt geanalyseerd door SDS-PAGE. Als het eiwit van belang F-actine bindt, komt het samen met de actinfilamenten. De producten van de bindingsreactie ( dwz F-actine en het eiwit van belang) kunnen gekwantificeerd worden om de affiniteit van de interactie te bepalen. De actinpelletingassay is een eenvoudige techniek om te bepalenAls een eiwit van belang F-actine bindt en om te beoordelen hoe veranderingen in dat eiwit, zoals ligandbinding, de interactie met F-actine beïnvloeden.

We onderzochten αE-catenin homodimer binding aan F-actine in de co-sedimentatie assay. Sinds vorige experimenten hebben aangetoond dat de affiniteit van aE-catenin homodimeer voor F-actine ongeveer 1 μM en de B max nabij 1 11 is , hebben we de test uitgevoerd met een lage concentratie van F-actine (0,2 μM in plaats van 2 μM; de discussie). Aangezien 0,2 μM onder de kritische concentratie ligt, werd phalloidine toegevoegd om het F-actin te polymeriseren gepolymeriseerd uit konijnskeletspier G-actine (stap 3.3). Toenemende concentraties van aE-catenine homodimeer (0,125-12,0 μM) werden geïncubeerd in aanwezigheid of afwezigheid van 0,2 μM F-actine. De monsters werden gecentrifugeerd en de resulterende pellets werden geanalyseerd ( Figuur 1A ). Zoals verwacht, vergelijkt de aE-catenin-homodimeer die samen met F-actine boven de achtergrond ( Figuur 1A , de F-actine-pelletmonsters aan de geen-F-acTin pellet monsters). BSA werd uitgevoerd als een negatieve controle ( Figuur 1B ). Gebonden eiwit werd gekwantificeerd en geproduceerd over vrij eiwit om de affiniteit van de interactie te berekenen ( Figuur 1C ). De getekende gegevens passen het beste bij een Hill-vergelijking. De berekende K d was 2,9 μM, de B max was 0,2 en de heuvelcoëfficiënt (h) was 4,8. Aldus bindt aE-catenine homodimeer F-actine coöperatief met een lage micromolaire affiniteit, consistent met eerdere werkzaamheden (een Kd van 2,9 μM versus ~ 1,0 μM) 11 . <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/55613/55613fig1.jpg" /> Figuur 1: Hoge snelheid F-actine co-sedimentatie assay. ( A ) Verhoging van concentraties (0,125-12,0 μM) αE-catenine homodimeer werden geïncubeerd met (linker panelen) of zonder (rechter panelen) 0,2 μM F-actine gestabiliseerd met phalloidin. Ze werden 30 minuten geïncubeerd bij RT en gecentrifugeerd. Het totaal (7,5% van het uitgangsmateriaal) en gepelleteerd materiaal (50% van het gepelleteerde materiaal) werden gescheiden door SDS-PAGE en gekleurd met Coomassie-kleurstof. ( B ) 4 μM BSA werd uitgevoerd als een negatieve controle. Totale en pelletsteekproeven, met (+) of zonder (-) F-actine, werden gescheiden door SDS-PAGE en gekleurd met Coomassie-kleurstof. ( C ) Verbonden αE-catenine (μM / μM actine) van A werd getekend tegen vrij αE-catenin (μM), en de data past bij een Hill-vergelijking (rode lijn). De K d , B max en Hill coëfficiënt (h) zijn vermeld. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55613/55613fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/55613/55613fig2.jpg" /> Figuur 2: Actin pelleting kwantificatie </sTrong&gt; - flow chart. In dit schema worden de belangrijkste stappen beschreven in sectie 5, met voorbeelden van totaal- en pelletmonsters ( A , CE ) en de standaardcurve ( B ) die wordt gebruikt voor kwantificering. 5.13 stappen: 1 ) Meet de hoeveelheid eiwit van belang in de totale monsters (A). 2 ) Genereer een standaardkromme door de bandintensiteit tegen eiwitmassa (B) te plotten. 3 ) Meet de hoeveelheid eiwit van belang die mede-sedimenteert met F-actine ( C ). 4 ) Meet de hoeveelheid eiwit van belang die in de afwezigheid van F-actine ( D ) pelleteerde. 5 ) Subtract D van C om de hoeveelheid eiwit die gebonden is aan F-actine te bepalen. 6 ) Meet de hoeveelheid F-actine in elke pellet (E), bereken de gemiddelde hoeveelheid F-actine per monster en verdeel elk monster op het gemiddelde (de onderstaande aantallen tonen de verhouding). 7 )Voor elk monster verdeel de hoeveelheid gebonden eiwit (berekend in stap 5) door de F-actin pelletsverhouding (berekend in stap 6) om af te stemmen op verschillen in de pellet. 8 ) Gebruik de standaardkromme ( B ) om de hoeveelheid (massa) van genormaliseerd gebonden eiwit in elk monster te berekenen (stap 7). 9 ) Bepaal de concentratie van vrij eiwit en gebonden proteïne om een ​​bindende bocht te creëren. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55613/55613fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Protein Binding to F-actin by Co-sedimentation at JoVE.com

Measuring Protein Binding to F-actin by Co-sedimentation

Dit protocol beschrijft een methode om het vermogen van een eiwit om te co-sedimenteren met filamenteuze actine (F-actine) te testen en, als de binding wordt waargenomen, de affiniteit van de interactie te meten.

Meting van eiwitbinding aan F-actine door co-sedimentatie

Filamentous actin (F-actin) organization within cells is regulated by a large number of actin-binding proteins that control actin nucleation, growth, ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Measuring G-protein-coupled Receptor Signaling via Radio-labeled GTP Binding

Het meten van G-eiwit-gekoppelde Receptor Signaling via Radio-gelabeld GTP Binding

G-Protein-Coupled Receptors (GPCRs) are a large family of transmembrane receptors that play critical roles in normal cellular physiology and constitute a ...

In Vitro Polymerization of F-actin on Early Endosomes

In Vitro Polymerization of F-actin on Early Endosomes

In Vitro Polymerisatie van F-actine op vroege Endosomen

Many early endosome functions, particularly cargo protein sorting and membrane deformation, depend on patches of short F-actin filaments nucleated onto ...

Assay for Phosphorylation and Microtubule Binding Along with Localization of Tau Protein in Colorectal Cancer Cells

Assay voor fosforylatie en microtubulus bindende samen met lokalisatie van Tau-eiwit in Colorectal kankercellen

The microtubule-associated protein tau is a neuronal protein that localizes mostly in axons. Generally tau is essential for normal neuronal functioning ...

Measuring Biomolecular DSC Profiles with Thermolabile Ligands to Rapidly Characterize Folding and Binding Interactions

Biomoleculaire DSC profielen met Thermolabile liganden te karakteriseren snel vouwen en inbinden van interacties te meten

Differential scanning calorimetry (DSC) is a powerful technique for quantifying thermodynamic parameters governing biomolecular folding and binding ...

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

Biochemische en structurele karakterisatie van de koolhydraten vervoer substraat-bindend-proteïne SP0092

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Rab10 Phosphorylation Detection by LRRK2 Activity Using SDS-PAGE with a Phosphate-binding Tag

Rab10 fosforylering detectie door LRRK2 activiteit met behulp van SDS-pagina met een fosfaat-bindende-Tag

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of ...

Measuring Trans-Plasma Membrane Electron Transport by C2C12 Myotubes

Meten van Trans-Plasma membraan elektronentransport door C2C12 Myotubes

Trans-plasma membrane electron transport (tPMET) plays a role in protection of cells from intracellular reductive stress as well as protection from damage ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Dissipatief Microgravimetry te bestuderen van de dynamiek van de Binding van de fosfolipide bindend proteïne Annexine A2 aan lipide Solid-ondersteund Bilayers met behulp van een Resonator Quartz

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Measuring and Interpreting Oxygen Consumption Rates in Whole Fly Head Segments

Meten en interpreteren van zuurstof verbruik geheel vliegen hoofd segmenten

Regulated metabolic activity is essential for the normal functioning of living cells. Indeed, altered metabolic activity is causally linked with the ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Hoge gevoeligheid meten van transcriptie Factor-DNA-bindende affiniteiten concurrerende getitreerd wordt met behulp van fluorescentie microscopie

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...