Name: measuring protein binding to f-actin by co-sedimentation
Uploaded: 2017-05-18T12:30:00
Duration: 6 min 17 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Protein Binding to F-actin by Co-sedimentation at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות גרנט HL127711 ל AVK.

<ol>
	<li>Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+and+Actin-Binding+Proteins.">Actin and Actin-Binding Proteins.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 8 (8), (2016).</li><li>Hansen, M. D., Kwiatkowski, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+actin+dynamics+by+allosteric+regulation+of+actin+binding+proteins.">Control of actin dynamics by allosteric regulation of actin binding proteins.</a> Int Rev Cell Mol Biol. 303, 1-25 (2013).</li><li>Lappalainen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin-binding+proteins:+the+long+road+to+understanding+the+dynamic+landscape+of+cellular+actin+networks.">Actin-binding proteins: the long road to understanding the dynamic landscape of cellular actin networks.</a> Mol Biol Cell. 27 (16), 2519-2522 (2016).</li><li>Mullins, R. D., Hansen, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+studies+of+actin+filament+and+network+dynamics.">In vitro studies of actin filament and network dynamics.</a> Curr Opin Cell Biol. 25 (1), 6-13 (2013).</li><li>Miller, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Danio+rerio+alphaE-catenin+is+a+monomeric+F-actin+binding+protein+with+distinct+properties+from+Mus+musculus+alphaE-catenin.">Danio rerio alphaE-catenin is a monomeric F-actin binding protein with distinct properties from Mus musculus alphaE-catenin.</a> J Biol Chem. 288 (31), 22324-22332 (2013).</li><li>Wickline, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=alphaT-Catenin+Is+a+Constitutive+Actin-binding+alpha-Catenin+That+Directly+Couples+the+Cadherin.Catenin+Complex+to+Actin+Filaments.">alphaT-Catenin Is a Constitutive Actin-binding alpha-Catenin That Directly Couples the Cadherin.Catenin Complex to Actin Filaments.</a> J Biol Chem. 291 (30), 15687-15699 (2016).</li><li>Simpson, R. J., Adams, P. D., Golemis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Basic methods in protein purification and analysis : a laboratory manual. , (2009).</li><li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4.">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li><li>Dyballa, N., Metzger, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+and+sensitive+colloidal+coomassie+G-250+staining+for+proteins+in+polyacrylamide+gels.">Fast and sensitive colloidal coomassie G-250 staining for proteins in polyacrylamide gels.</a> J Vis Exp. (30), (2009).</li><li>Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+simple+and+informative+binding+assays.">A guide to simple and informative binding assays.</a> Mol Biol Cell. 21 (23), 4061-4067 (2010).</li><li>Hansen, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=alphaE-catenin+actin-binding+domain+alters+actin+filament+conformation+and+regulates+binding+of+nucleation+and+disassembly+factors.">alphaE-catenin actin-binding domain alters actin filament conformation and regulates binding of nucleation and disassembly factors.</a> Mol Biol Cell. 24 (23), 3710-3720 (2013).</li><li>Perrin, B. J., Ervasti, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+actin+gene+family:+function+follows+isoform.">The actin gene family: function follows isoform.</a> Cytoskeleton (Hoboken). 67 (10), 630-634 (2010).</li><li>Tondeleir, D., Vandamme, D., Vandekerckhove, J., Ampe, C., Lambrechts, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+isoform+expression+patterns+during+mammalian+development+and+in+pathology:+insights+from+mouse+models.">Actin isoform expression patterns during mammalian development and in pathology: insights from mouse models.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 66 (10), 798-815 (2009).</li><li>Prochniewicz, E., Janson, N., Thomas, D. D., Dela Cruz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cofilin+increases+the+torsional+flexibility+and+dynamics+of+actin+filaments.">Cofilin increases the torsional flexibility and dynamics of actin filaments.</a> J Mol Biol. 353 (5), 990-1000 (2005).</li><li>Kuhn, J. R., Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+measurements+of+actin+filament+polymerization+by+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy.">Real-time measurements of actin filament polymerization by total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Biophys J. 88 (2), 1387-1402 (2005).</li><li>Hansen, S. D., Zuchero, J. B., Mullins, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+actin:+purification+and+single+molecule+assembly+assays.">Cytoplasmic actin: purification and single molecule assembly assays.</a> Methods Mol Biol. 1046, 145-170 (2013).</li></ol>

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

אקטין שיתוף assay משקע היא טכניקה פשוטה שיכולה לקבוע במהירות אם חלבון נקשר F- אקטין. עם כמה שינויים, הטכניקה יכולה לשמש גם כדי למדוד את הזיקה של האינטראקציה. בנוסף נקודות שהועלו בפרוטוקול לעיל, הנושאים הבאים יש לקחת בחשבון בעת ​​תכנון, ניסוי, ופרשנות assay. חלבון של עניין חלבון מוכן טרי או קפוא ניתן להשתמש assay. אם חלבון קפוא משמש, מומלץ מאוד להשוות את התוצאות עם חלבון טרי (מעולם לא קפוא) כדי להבטיח כי הקפאה אינה משפיעה על F- אקטין מחייב. מקור G- אקטין רבים ניסויים peliting להשתמש G- אקטין מבודדים מן השריר בגלל השפע היחסי שלה. ישנם שלושה אסתטינים אקטין עיקריים ביונקים - אלפא, ביתא וגאמא - דומים להפליא (&gt; 90% רצף מזהיםTy). עם זאת, ישנם הבדלים תפקודיים בין האיזוטופים 12 , 13 . אם אפשר, אקטין G- אקטין המשמש assay מחייב צריך להתאים את איסוטיפ in vivo . לדוגמה, אם בדיקת חלבון לידי ביטוי שריר השלד, אקטין אלפא הוא הבחירה הטובה ביותר; אם בוחנים חלבון לידי ביטוי fibroblasts, בטא אקטין מומלץ. השימוש Phalloidin מאז phalloidin נקשר F- אקטין, זה יכול להפריע או אפילו לחסום את הכריכה של כמה חלבונים F- אקטין מחייב ( למשל, בלוקים phalloidin cofilin מחייב לחוטים actin) 14 . לכן, phalloidin יש להשתמש בזהירות עם התוצאות לעומת דגימות שאינן phalloidin שטופלו כאשר אפשרי. רקע גבוה אין זה נדיר עבור חלבונים משקעים בהעדר F- אקטין ( איור 1 א , לא F- אקטין גלולה מדגםS). עם זאת, רמות גבוהות של שקיעה ברקע יכול להסוות שיתוף פעולה אקטין אמיתי ולהקשות, אם לא בלתי אפשרי, כדי לקבוע אם חלבון נקשר F- אקטין או למדוד את הזיקה של האינטראקציה. הוספת polidicanol למאגר התגובה (שלב 4.1) יכול להפחית באופן משמעותי את הרקע הוא פתרון קל. אם זה לא להפחית את הרקע, התאמת למאגר התגובה, ריכוז מלח, ו / או טמפרטורת הדגירה עשוי לעזור. עקומה מחייב כדי ליצור עקומה מחייב, יש צורך לשנות את הריכוז של החלבון או של עניין או F- אקטין על פני סדרה של תגובות. בפועל, זה קל יותר עדיף לשמור F- אקטין בריכוז קבוע כדי לשנות את הריכוז של חלבון של עניין. שמירה F- אקטין בריכוז קבוע ( למשל, 2 מיקרומטר) ב assay pelleting גבולות שאינם ספציפיים השמנה בריכוזים גבוהים יותר של F- אקטין ומונעדה-פולימריזציה בריכוז נמוך יותר (&lt;0.5 מיקרומטר) של F-actin. דה-פולימריזציה ניתן למנוע באמצעות phalloidin, אם כי זה מציג גורם סיבוך פוטנציאלי לתוך המערכת (ראה שלב 3.3 ומעלה). שמירה על F- אקטין בריכוז קבוע גם מאפשרת להשוות (לנרמל) את F- אקטין גלולה על פני דגימות לזהות ניסויים נכשלו ( כלומר, כאשר גלולה F- אקטין משתנה מאוד, מניעת ניתוח על פני ריכוזים). לבסוף, שמירה F- אקטין בריכוז קבוע מאפשר אחד כדי לקבוע אם מחייב נימה אקטין הוא שיתופי ( איור 1 ג ). כריכה רוויה כמו בכל הניסויים מחייב, זה קריטי כי מחייב F- אקטין רווי וכי ריכוז חלבון פלוס F- אקטין plateaus ( איור 1 ג ). ללא רמה, לא ניתן לחשב קבוע שיווי משקל דיסוציאציה קבוע. לכן, זהחשוב לתכנן בקפידה את סדרת הדילול שייבדקו ותמיד לכלול ריכוזים גבוהים יותר של חלבון ( כלומר, לפחות פי 5 עד פי 10 גבוה מהצפוי). ניתוח מחייב על מנת קבועי דיסוציאציה נמדד להיות חד משמעית, assay צריך להתבצע באמצעות ריכוז F- אקטין המאפשר ריכוז של אתרי קשירה ב- F- אקטין לחלבון של עניין להיות הרבה יותר נמוך מאשר זיקה. כדי לבדוק אם קריטריון זה נענה, להעריך את ריכוז של אתרי קשירה מ מקסימום B. לדוגמה, אם [F- אקטין] היה 2 מיקרומטר ו- B מקסימום = 0.5, ואז [מחייב אתרים] ≈ 1 מיקרומטר. K K צריך להיות לפחות 5 עד פי 10 גדול יותר מאשר [אתרי מחייב]. אם K K הנמדד הוא בסדר גודל זהה לזה של [קשירת אתרים], אזי ייתכן שהעקומה המחוברת הנצפית מייצגת טיטרציה של siTes ולא איסתרם מחייב אמיתי. אם זה נצפה, לחזור על assay באמצעות 10 פי נמוך ריכוז אקטין F כדי למדוד זיקה מדויקת. עבור אינטראקציות זיקה גבוהה, ייצוב phalloidin (שלב 3.3) עשוי להיות נחוץ כדי להשיג ריכוז F- אקטין נמוך מספיק כדי למדוד במדויק זיקה. לבסוף, יש מגבלות היסוד עם assay שיתוף שקיעה כי החוקרים צריכים להיות מודעים בעת ביצוע והערכת assay. והכי חשוב, assay שיתוף שקיעה לא לייצר קבוע שיווי משקל קבוע. המוצרים של מחייב ( כלומר, חלבון פלוס F- אקטין) מופרדים מן המגיבים במהלך צנטריפוגה, ואז המוצרים יכולים ואז לנתק ליצור שיווי משקל חדש. כתוצאה מכך, assay co-sedmentation יכול לחשב או להיכשל לגלות אינטראקציות זיקה נמוכה. מאחר וחלבונים רבים של אקטין מחייב זיקה נמוכה ( כלומר, מיקרומטר) ל- F-actin, תוצאה שלילית ( <eמ &#39;&gt; כלומר, לא מחייב לזיהוי) ב assay לא בהכרח אומר כי חלבון אינו לאגד F- אקטין. כחלופה, TIRF מיקרוסקופיה מבוססי, בודד נימה מחייב מבחני רגישים יותר מדויק יותר לקביעת קבוע דיסוציאציה (עבור ביקורות על טכניקה זו, ראה הפניות 15,16 ). למרות המגבלות הללו, assay גלולה הוא בתוך האמצעים של רוב החוקרים הוא כלי יעיל כדי לקבוע אם חלבון נקשר F- אקטין וכדי למדוד את הזיקה של האינטראקציה.

אקטין הוא חלבון cytoskeletal חיוני אשר ממלא תפקיד קריטי בתהליכים סלולריים מרובים, כולל תנועתיות, התכווצות, הדבקה, מורפולוגיה 1 . אקטין קיים בשתי צורות: אקטין כדורית מונומריקית (G- אקטין) ו actin נימול polymerized (F- אקטין). בתוך התאים, F- אקטין הארגון נשלט על ידי אוסף גדול של חלבונים המווסתים את נוקלאציה, צמיחה, cross-linking, ופירוק של חוטים אקטין 2 , 3 , 4 . עם זאת, כמה מרובות אקטין מחייב תפקוד בתיאום כדי להסדיר ארגון רשת אקטין עדיין לא ברור במידה רבה. מדידת האינטראקציות בין חלבונים לחלבון היא גישה חשובה להבנה כיצד חלבונים מפעילים את השפעתם על ההתנהגות הסלולרית ברמה הביוכימית. מבחני רבים יכולים לשמש כדי לזהות אינטראקציות בין חלבונים מטוהרים.גישות נפוצות עבור חלבונים מסיסים כוללים משיכות, קיטוב פלואורסצנציה, calorimetry טיטרציה איזותרמית, תהודה פלסמון פני השטח. חשוב לציין, כל מבחני אלה דורשים חלבונים להיות מסיסים, ולכן הם קשים להסתגל לשימוש עם חלבון פילמנטי, פילמנטי כגון F- אקטין. כאן, אנו מתארים טכניקה - אקטין שיתוף שקיעה, או גלולה, assay - כדי לקבוע אם חלבון או חלבון תחום נקשר F- אקטין וכדי למדוד את הזיקה של האינטראקציה. אקטין pelleting assay היא טכניקה פשוטה יחסית שאינה דורשת ציוד מיוחד, מלבד ultracentrifuge. כל ריאגנטים יכול להיעשות, בהנחה של ידע ביוכימיה בסיסית, או לרכוש. לאחר מחייב F- אקטין הוקמה, assay ניתן להשתמש כדי למדוד את הזיקה לכאורה ( כלומר, שיווי המשקל דיסוציאציה קבוע) 5 . כמו כן, ברגע זיקה היא הוקמה, assay pelletingהוא כלי שימושי כדי למדוד כיצד שינויים החלבון של עניין ( כלומר , שינויים לאחר translational, מוטציות, או ליגנד מחייב) להשפיע על האינטראקציה שלה עם F-actin 6 . טכניקה יש מגבלות (ראה דיון ) כי החוקר צריך להיות מודע לפני שתנסה assay.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="842">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Sorvall MTX 150 Micro-Ultracentrifuge</td>
			<td style="width:224px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">46960</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">S100-AT3 rotor</td>
			<td style="width:224px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">45585</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Ultracentrifuge tubes - 0.2 ml</td>
			<td style="width:224px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">45233</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Actin, rabbit skeletal muscle</td>
			<td style="width:224px;">Cytoskeleton</td>
			<td style="width:119px;">AKL99</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:224px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A8531</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Polidicanol (Thesit)&#160;</td>
			<td style="width:224px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">88315</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Phalloidin</td>
			<td style="width:224px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">P3457</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td style="width:224px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">R0862</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Adenosine triphosphate (ATP)</td>
			<td style="width:224px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A2383</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Imidazole</td>
			<td style="width:224px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">O3196</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td style="width:224px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP358</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Magnesium Chloride (MgCl2)</td>
			<td style="width:224px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">M33</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td style="width:224px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">P217</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Ethylene glycol-bis(&#946;-aminoethyl ether)-N,N,N&#39;,N&#39;-tetraacetic acid (EGTA)</td>
			<td style="width:224px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">3779</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Odyssey CLx Imaging System</td>
			<td style="width:224px;">LI-COR</td>
			<td style="width:119px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Coomassie Brilliant Blue R-250 Dye</td>
			<td style="width:224px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">20278</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Colloidal Blue Staining Kit</td>
			<td style="width:224px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">LC6025</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring protein binding to f-actin by co-sedimentation

אקטין אקטין (F- אקטין) ארגון בתוך תאים מוסדר על ידי מספר רב של חלבונים אקטין מחייב השולטים אקטין נוקלאציה, צמיחה, חוצה קישור ו / או פירוק. פרוטוקול זה מתאר טכניקה - אקטין שיתוף שקיעה, או גלולה, assay - כדי לקבוע אם חלבונים או חלבון תחום נקשר F- אקטין וכדי למדוד את הזיקה של האינטראקציה ( כלומר, שיווי המשקל דיסוציאציה קבוע). בטכניקה זו, חלבון של עניין מודגרת הראשונה עם F- אקטין בפתרון. ואז, צנטריפוגה דיפרנציאלי משמש משקעים את החוטים אקטין, ואת החומר גלולה מנותח על ידי SDS-PAGE. אם חלבון של עניין נקשר F- אקטין, זה יהיה שיתוף משקעים עם חוטים אקטין. את המוצרים של התגובה מחייב ( כלומר, F- אקטין וחלבון של עניין) ניתן לכמת כדי לקבוע את הזיקה של האינטראקציה. אקטין pelleting assay היא טכניקה פשוטה לקביעתאם חלבון של עניין נקשר F-actin ולהעריך כיצד שינויים חלבון זה, כגון קשירת ליגנד, להשפיע על האינטראקציה שלה עם F- אקטין.

בדקנו αE-catenin homodimer מחייב F- אקטין assay שיתוף שקיעה. מאז ניסויים בעבר הראו כי זיקה של הומודימר αE-catenin עבור F- אקטין הוא סביב 1 מיקרומטר ו מקסימום B ליד 1 11 , ביצענו את assay עם ריכוז נמוך של אקטין F (0.2 מיקרומטר ולא 2 מיקרומטר, ראה הדיון). מאז 0.2 מיקרומטר הוא מתחת לריכוז קריטי, phalloidin נוספה לייצב את F- אקטין פולימר מ שריר השלד שריר G- אקטין (שלב 3.3). ריכוזים הולכים וגדלים של הומודימר αE-catenin (0.125-12.0 מיקרומטר) הודגמו בנוכחות או היעדר של 0.2 מיקרומטר F- אקטין. הדגימות היו centrifuged, וכתוצאה מכך pellets נותחו ( איור 1 א ). כצפוי, הומודימר αE-catenin שיתוף sedimented עם רקע F- אקטין מעל ( איור 1 א &#39; , להשוות את F- אקטין גלולות דגימות לא- F- ACדגימות פח). BSA היה לרוץ כמו שליטה שלילית ( איור 1 ב ). חלבון Bound היה לכמת זממו על חלבון חינם כדי לחשב את הזיקה של האינטראקציה ( איור 1C ). הנתונים המתויגים מתאימים ביותר למשוואת היל. K מחושב D היה 2.9 מיקרומטר, מקסימום B היה 0.2, ואת מקדם היל (ח) היה 4.8. לפיכך, הומודימר αE-catenin נקשר F- אקטין במשותף עם זיקה מיקרומטר נמוכה, עולה בקנה אחד עם עבודה קודמת (K ד של 2.9 מיקרומטר לעומת ~ 1.0 מיקרומטר) 11 . <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/55613/55613fig1.jpg" /> איור 1: מהירות גבוהה F- אקטין co- שקיעה assay. ( א ) הגדלת ריכוזי (0.125-12.0 מיקרומטר) של הומודימר αE-catenin הודגרו עם (פאנלים שמאל) או ללא (מימין לוחות) 0.2 מיקרומטר F- אקטין התייצב עם phalloidiנ. הם הודגרו במשך 30 דקות ב RT ו centrifuged. סך הכל (7.5% מהחומר המוצא) וחומר pelleted (50% של חומר pelleted) הופרדו על ידי SDS-PAGE ומוכתמים עם צבע קומאסי. ( ב ) 4 מיקרומטר BSA היה להפעיל כמו שליטה שלילית. סך הכל גלולה דגימות, עם (+) או בלי (-) F- אקטין, הופרדו על ידי SDS-PAGE ומוכתמים עם צבע קומאסי. ( C ) Bound αE-catenin (μM / מיקרומטר actin) מ- A היה זממו נגד חינם αE-catenin (מיקרומטר), ואת הנתונים מתאימים למשוואת היל (קו אדום). K K, B מקסימום ומקדם היל (h) מפורטים. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55613/55613fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/55613/55613fig2.jpg" /> איור 2: אקטין pelleting כימות </sתרשים זרימה. סכמטי זה מתאר את שלבי המפתח בסעיף 5, עם דוגמאות של דגימות סך ו גלולה ( A , CE ) ואת עקומת תקן ( ב ) המשמש לכימות. 5.13 צעדים: 1 ) למדוד את כמות החלבון של עניין במדגם הכולל (A). 2 ) ליצור עקומה סטנדרטית על ידי זומם את עוצמת הלהקה לעומת מסת חלבון (B). 3 ) למדוד את כמות החלבון עניין כי שיתוף sedimented עם F- אקטין ( ג ). 4 ) למדוד את כמות החלבון של עניין כי pelleted בהעדר F-actin ( D ). 5 ) לחסר D מ C כדי לקבוע את כמות החלבון קשור F- אקטין. 6 ) למדוד את כמות F- אקטין בכל גלולה (E), לחשב את הכמות הממוצעת של F- אקטין לכל מדגם, ולחלק כל מדגם על ידי הממוצע (המספרים שלהלן מראים את היחס). 7 )עבור כל דגימה, לחלק את כמות החלבון מחויב (מחושב בשלב 5) על ידי היחס גלולה F- אקטין (מחושב בשלב 6) כדי להתאים את ההבדלים גלולה. 8 ) השתמש עקומת סטנדרטי ( ב ) כדי לחשב את כמות (מסה) של חלבון מחויב מנורמל בכל מדגם (שלב 7). 9 ) לקבוע את הריכוז של חלבון חופשי וחלבון מחויב ליצור עקומה מחייב. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55613/55613fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Protein Binding to F-actin by Co-sedimentation at JoVE.com

Measuring Protein Binding to F-actin by Co-sedimentation

פרוטוקול זה מתאר שיטה לבחון את היכולת של חלבון לשיתוף משקעים עם אקטין filamentous (F- אקטין), ואם מחייב הוא ציין, כדי למדוד את הזיקה של האינטראקציה.

מדידת חלבון מחייב F- אקטין על ידי שיתוף שקיעה

Filamentous actin (F-actin) organization within cells is regulated by a large number of actin-binding proteins that control actin nucleation, growth, ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Measuring G-protein-coupled Receptor Signaling via Radio-labeled GTP Binding

מדידת G- חלבון מצמידים איתות באמצעות רדיו שכותרתו GTP מחייב

G-Protein-Coupled Receptors (GPCRs) are a large family of transmembrane receptors that play critical roles in normal cellular physiology and constitute a ...

In Vitro Polymerization of F-actin on Early Endosomes

In Vitro Polymerization of F-actin on Early Endosomes

במבחנה פלמור של F-אקטין-Endosomes מוקדם

Many early endosome functions, particularly cargo protein sorting and membrane deformation, depend on patches of short F-actin filaments nucleated onto ...

Assay for Phosphorylation and Microtubule Binding Along with Localization of Tau Protein in Colorectal Cancer Cells

וזמינותו של זרחון ואיגוד Microtubule יחד עם לוקליזציה של חלבון טאו בתאי סרטן המעי הגס

The microtubule-associated protein tau is a neuronal protein that localizes mostly in axons. Generally tau is essential for normal neuronal functioning ...

Measuring Biomolecular DSC Profiles with Thermolabile Ligands to Rapidly Characterize Folding and Binding Interactions

מדידת למערכות ביולוגיות DSC פרופילים עם Thermolabile ליגנדים לאפיין במהירות קיפול ואיגוד אינטראקציות

Differential scanning calorimetry (DSC) is a powerful technique for quantifying thermodynamic parameters governing biomolecular folding and binding ...

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

אפיון הביוכימי ומבניים של SP0092 המצע-מחייב-חלבון פחמימות תחבורה

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Rab10 Phosphorylation Detection by LRRK2 Activity Using SDS-PAGE with a Phosphate-binding Tag

Rab10 זיהוי זרחון על-ידי פעילות LRRK2 באמצעות מרחביות-דף עם תג מחייב פוספט

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of ...

Measuring Trans-Plasma Membrane Electron Transport by C2C12 Myotubes

מדידת הטרנס-פלזמה ממברנה אלקטרון תעבורה על-ידי C2C12 Myotubes

Trans-plasma membrane electron transport (tPMET) plays a role in protection of cells from intracellular reductive stress as well as protection from damage ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Microgravimetry dissipative ללמוד את הדינמיקה איגוד של פוספוליפיד איגוד חלבון Annexin A2 כדי Bilayers השומנים הנתמכות על-ידי מוצק באמצעות מהוד קוורץ

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Measuring and Interpreting Oxygen Consumption Rates in Whole Fly Head Segments

מדידת ופרשנות חמצן קצב הצריכה כולה לטוס הראש מקטעים

Regulated metabolic activity is essential for the normal functioning of living cells. Indeed, altered metabolic activity is causally linked with the ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

רגישות גבוהה מדידה של שעתוק הזיקות איגוד מקדם-DNA על ידי טיטור תחרותי באמצעות מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...