Name: measuring protein binding to f-actin by co-sedimentation
Uploaded: 2017-05-18T12:30:00
Duration: 6 min 17 s
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यह काम नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ ग्रांट एचएल 127711 एवीके द्वारा समर्थित था।

<ol>
	<li>Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+and+Actin-Binding+Proteins.">Actin and Actin-Binding Proteins.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 8 (8), (2016).</li><li>Hansen, M. D., Kwiatkowski, A. 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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+studies+of+actin+filament+and+network+dynamics.">In vitro studies of actin filament and network dynamics.</a> Curr Opin Cell Biol. 25 (1), 6-13 (2013).</li><li>Miller, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Danio+rerio+alphaE-catenin+is+a+monomeric+F-actin+binding+protein+with+distinct+properties+from+Mus+musculus+alphaE-catenin.">Danio rerio alphaE-catenin is a monomeric F-actin binding protein with distinct properties from Mus musculus alphaE-catenin.</a> J Biol Chem. 288 (31), 22324-22332 (2013).</li><li>Wickline, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=alphaT-Catenin+Is+a+Constitutive+Actin-binding+alpha-Catenin+That+Directly+Couples+the+Cadherin.Catenin+Complex+to+Actin+Filaments.">alphaT-Catenin Is a Constitutive Actin-binding alpha-Catenin That Directly Couples the Cadherin.Catenin Complex to Actin Filaments.</a> J Biol Chem. 291 (30), 15687-15699 (2016).</li><li>Simpson, R. J., Adams, P. D., Golemis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Basic methods in protein purification and analysis : a laboratory manual. , (2009).</li><li>Laemmli, U. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cofilin+increases+the+torsional+flexibility+and+dynamics+of+actin+filaments.">Cofilin increases the torsional flexibility and dynamics of actin filaments.</a> J Mol Biol. 353 (5), 990-1000 (2005).</li><li>Kuhn, J. R., Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+measurements+of+actin+filament+polymerization+by+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy.">Real-time measurements of actin filament polymerization by total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Biophys J. 88 (2), 1387-1402 (2005).</li><li>Hansen, S. D., Zuchero, J. B., Mullins, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+actin:+purification+and+single+molecule+assembly+assays.">Cytoplasmic actin: purification and single molecule assembly assays.</a> Methods Mol Biol. 1046, 145-170 (2013).</li></ol>

लेखकों ने घोषणा की कि उनके पास कोई प्रतिस्पर्धात्मक वित्तीय हित नहीं है

एक्टिन सह-अवसादन परख एक सीधा तकनीक है जो जल्दी से निर्धारित कर सकता है कि प्रोटीन एफ-एक्टिन को बांधता है या नहीं। कुछ संशोधनों के साथ, इस तकनीक का इस्तेमाल बातचीत के संबंध को मापने के लिए भी किया जा सकता है। उपर्युक्त प्रोटोकॉल में उठाए गए अंकों के अलावा, परख की डिजाइनिंग, संचालन और व्याख्या करते समय निम्नलिखित मुद्दों पर विचार किया जाना चाहिए। ब्याज की प्रोटीन ताजा तैयार या जमी प्रोटीन परख में इस्तेमाल किया जा सकता है। यदि जमी प्रोटीन का इस्तेमाल किया जाता है, तो यह अत्यधिक अनुशंसा की जाती है कि परिणाम ताजा (कभी जमी) प्रोटीन के साथ तुलना न करें ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि फ्रीजिंग एफ-एक्टिन बंधन को प्रभावित नहीं करती है। जी-एटिन स्रोत कई पेलेटिंग प्रयोगों में जी-एक्टिन का उपयोग मांसपेशियों से अलग होता है क्योंकि इसकी रिश्तेदार बहुतायत। स्तनपायों - अल्फा, बीटा और गामा में तीन मुख्य एक्टिन आइसोटाइप हैं - जो असाधारण समान हैं (&gt; 90% अनुक्रम पहचानTy)। बहरहाल, आइोटाइपों 12 , 13 के बीच कार्यात्मक अंतर हैं। यदि संभव हो तो, बाध्यकारी परख में जी-एक्टिन आइसोटाइप का इस्तेमाल विवो आइसोटाइप में होना चाहिए। उदाहरण के लिए, यदि कंकाल की मांसपेशी में व्यक्त प्रोटीन का परीक्षण किया जाता है, तो अल्फा-एक्टिन सबसे अच्छा विकल्प है; अगर फाइब्रोब्लास्टों में व्यक्त प्रोटीन की जांच हो रही है, बीटा एक्टिन की सिफारिश की जाती है। Phalloidin का प्रयोग करें चूंकि phalloidin एफ-एक्टिन बांधता है, यह कुछ एफ-एक्टिन बाइंडिंग प्रोटीन ( जैसे, एफ़िनिन तंतुओं के लिए बाध्यकारी से cofilin phalloidin ब्लॉक) की बाध्यता को बाधित या अवरुद्ध कर सकता है 14 । इस प्रकार, जब संभव हो तो बिना phalloidin- इलाज के नमूने की तुलना में सावधानी के साथ phalloidin और परिणामों का उपयोग किया जाना चाहिए। उच्च पृष्ठभूमि एफ-एक्टिन ( चित्रा 1 ए , कोई एफ-एक्टिन गोली नमूना) के अभाव में प्रोटीन के तलछट के लिए असामान्य नहीं हैरों)। हालांकि, पृष्ठभूमि अवसादन के उच्च स्तर से सच एक्टिन सह-अवसादन को ढंकना पड़ सकता है और असंभव नहीं है, यह निर्धारित करने के लिए कि क्या प्रोटीन एफ-एक्टिन बांधता है या बातचीत के संबंध को मापने के लिए मुश्किल है। प्रतिक्रिया बफर (चरण 4.1) को पॉलीडेकिनोल जोड़ना पृष्ठभूमि को काफी कम कर सकता है और यह आसान समाधान है यदि यह पृष्ठभूमि को कम नहीं करता है, प्रतिक्रिया बफर, नमक एकाग्रता, और / या ऊष्मायन तापमान समायोजित करने में मदद कर सकता है। बाइंडिंग वक्र बाध्यकारी वक्र उत्पन्न करने के लिए, प्रतिक्रियाओं की एक श्रृंखला पर या तो ब्याज की प्रोटीन या एफ-एक्टिन की एकाग्रता को बदलना आवश्यक है व्यवहार में, एक स्थिर एकाग्रता में एफ-एक्टिन को बनाए रखने और ब्याज की प्रोटीन की एकाग्रता को अलग रखने के लिए यह आसान और बेहतर है। पेलेटिंग परख में एक निश्चित एकाग्रता ( उदाहरण के लिए, 2 माइक्रोग्राम) पर एफ-एक्टिन बनाए रखना एफ-एक्टिन की अधिक मात्रा में गैर-विशिष्ट फँसाने की रोकथाम करता है और रोकता हैएफ-एक्टिन के निचले (&lt;0.5 माइक्रोन) सांद्रता पर डिपोमिराइज़ेशन Depolymerization phalloidin का उपयोग कर रोका जा सकता है, हालांकि इस प्रणाली में एक संभावित जटिलता फैक्टर का परिचय (देखें कदम 3.3 और ऊपर)। एक निश्चित एकाग्रता में एफ-एक्टिन को बनाए रखने से भी एक ने एफ-एक्टिन गोली को नमूनों में (और सामान्य) बनाने और असफल प्रयोगों की पहचान करने के लिए अनुमति दी है ( यानी, एफ-एक्टिन गोली अत्यधिक चर वाली है, सांद्रता में विश्लेषण को रोकना)। अंत में, एक निश्चित एकाग्रता पर एफ-एक्टिन को बनाए रखने से यह पता चलता है कि एक्टिन फिलामेंट के लिए बाध्यकारी सहकारी है ( चित्रा -1 सी )। संतृप्त बाध्यकारी सभी बंधन प्रयोगों के अनुसार, यह महत्वपूर्ण है कि एफ-एक्टिन को बाध्य किया जाता है और प्रोटीन प्लस एफ-एक्टिन पठारों ( चित्रा 1 सी ) की एकाग्रता होती है। एक पठार के बिना, एक सटीक विस्थापन संतुलन निरंतर की गणना करना संभव नहीं है। इस प्रकार, यहमहत्वपूर्ण है कि सावधानीपूर्वक कमजोर पड़ने वाली श्रृंखला की जांच करनी चाहिए और हमेशा प्रोटीन की उच्च सांद्रता ( यानी, अपेक्षित के डी से कम से कम 5 से 10 गुना अधिक) में शामिल होना चाहिए। बाध्यकारी विश्लेषण मापा विस्थापन स्थिरांक के लिए निर्णायक होने के लिए, एफएटीन एकाग्रता का उपयोग करके परख किया जाना चाहिए जो एफ-एक्टिन पर ब्याज की प्रोटीन के संबंध में बाध्यकारी साइटों की एकाग्रता को समानता से बहुत कम होने की अनुमति देता है। यह मानदंड पूरा हो गया है या नहीं, यह जांचने के लिए, बी मैक्स से बाध्यकारी साइटों की एकाग्रता का अनुमान है। उदाहरण के लिए, यदि [एफ-एक्टिन] 2 माइक्रोन और बी मैक्स = 0.5 था, फिर [बाइंडिंग साइट्स] ≈ 1 सुक्ष्ममापी के डी को [बंधन स्थल] से कम से कम 5 से 10 गुना अधिक होना चाहिए। अगर मापा के डी [बाध्यकारी साइट्स] के रूप में एक ही क्रम के समान है, तो यह संभव है कि मनाया बाध्यकारी वक्र उच्च आत्मीयता बाध्यकारी सी का एक अनुमापन का प्रतिनिधित्व करता हैएक सच्चे बाध्यकारी isotherm के बजाय टीईएस यदि यह देखा जाता है, तो सटीक संबंध को मापने के लिए 10-गुना कम एफ-एक्टिन एकाग्रता का उपयोग करके परख को दोहराएं। उच्च आत्मीय संबंधों के लिए, एफ़-एक्टिन एकाग्रता को प्राप्त करने के लिए आवश्यक हो सकता है जो उचित रूप से आत्मीयता को मापने के लिए पर्याप्त है। अंत में, सह-अवसादन परख के साथ मौलिक सीमाएं हैं, जो शोधकर्ताओं को परख के प्रदर्शन और मूल्यांकन के बारे में पता होना चाहिए। सबसे महत्वपूर्ण बात, सह-अवसादन परख एक सच्चे संतुलन स्थिरता उत्पन्न नहीं करता है। बाध्यकारी ( यानी, प्रोटीन प्लस एफ-एक्टिन) के उत्पादों को सेंट्रीफ्यूगेशन के दौरान रिएक्टेंट से अलग किया जाता है, जिससे उत्पादों को एक नया संतुलन बनाने के लिए अलग-थलग हो सकता है। नतीजतन, सह-अवसादन परख कम-आत्मीयता बातचीत का पता लगाने में विफल या विफल हो सकता है। चूंकि कई एक्टिन बाध्यकारी प्रोटीन के पास एफ-एक्टिन के लिए कम ( यानी, माइक्रोमोलोलर) समानता है, एक नकारात्मक परिणाम ( <eएम&gt; यानी, कोई पता लगाने योग्य बंधन) परख में इसका मतलब यह नहीं है कि प्रोटीन एफ-एक्टिन बाँध नहीं करता है। एक विकल्प के रूप में, टीआईआरएफ माइक्रोस्कोपी-आधारित, सिंगल फिलामेंट बाइंडिंग एसेज, अधिकतर संवेदनशील और अधिक सटीक (इस तकनीक की समीक्षा के लिए, संदर्भ 15,16 देखें) के निर्धारण के लिए अधिक सटीक हैं। इन सीमाओं के बावजूद, पेलेटिंग परख ज्यादातर शोधकर्ताओं के माध्यम से है और यह निर्धारित करने के लिए एक प्रभावी उपकरण है कि क्या प्रोटीन एफ-एक्टिन को बांधता है और इंटरैक्शन के संबंध को मापने के लिए।

एक्टिन एक अनिवार्य साइटोस्केलेटल प्रोटीन है जो गतिशीलता, संकुचन, आसंजन और आकारिकी 1 सहित कई सेलुलर प्रक्रियाओं में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। एक्टिन दो रूपों में मौजूद है: मोनोमेरिक ग्लोबुलर एक्टिन (जी-एक्टिन) और पोलीमराइज्ड फिलामेंटस एक्टिन (एफ-एक्टिन)। कोशिकाओं के भीतर, एफ-एक्टिन संगठन को प्रोटीन का एक बड़ा संग्रह द्वारा नियंत्रित किया जाता है जो न्यूक्लियेशन, विकास, क्रॉस-लिंकिंग और एक्टिन filaments 2 , 3 , 4 के disassembly को विनियमित करते हैं। हालांकि, एक्टिन नेटवर्क संगठन को विनियमित करने के लिए कॉन्सर्ट में कई एक्टिन बाध्यकारी प्रोटीन कैसे काम करते हैं, यह अभी भी स्पष्ट नहीं है। प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन की माप, यह समझने के लिए एक महत्वपूर्ण तरीका है कि प्रोटीन जैव रासायनिक स्तर पर सेलुलर व्यवहार पर उनके प्रभाव कैसे लागू करते हैं। शुद्ध प्रोटीन के बीच बातचीत का पता लगाने के लिए कई अलग-अलग assays का उपयोग किया जा सकता हैघुलनशील प्रोटीन के लिए सामान्य दृष्टिकोण में पुल-डाउन, प्रतिदीप्ति ध्रुवीकरण, इओसमर्माल अनुमापन कैलोरीमेट्री, और सतह प्लसॉन अनुनाद शामिल हैं। महत्वपूर्ण रूप से, इन सभी assays में प्रोटीन घुलनशील होने की आवश्यकता होती है, और इस प्रकार एफ-एक्टिन जैसे एक बहुलक, फिलामेंटिक प्रोटीन के साथ प्रयोग के लिए अनुकूल होना मुश्किल होता है यहाँ, हम एक तकनीक का वर्णन करते हैं - एक्टिन सह-अवसादन, या पेलेटिंग, परख - यह निर्धारित करने के लिए कि प्रोटीन या प्रोटीन डोमेन एफ-एक्टिन को बांधता है और इंटरैक्शन के संबंध को मापने के लिए। एक्टिन पेलेटिंग परख एक अपेक्षाकृत सरल तकनीक है, जिसे विशेष उपकरण की आवश्यकता नहीं है, अलग-अलग एक अल्ट्रेंट्रफ़िफ़ से। सभी अभिकर्मकों, बुनियादी जीव रसायन के ज्ञान को संभालने, या खरीदा जा सकता है। एफ-एक्टिन के लिए बाध्य होने के बाद, परख को स्पष्ट संबंध ( यानी, पृथक्करण संतुलन स्थिर) को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है इसके अलावा, एक बार एक संबंध स्थापित हो जाता है, पेलेटिंग परखयह मापने के लिए एक उपयोगी उपकरण है कि कैसे ब्याज की प्रोटीन में परिवर्तन ( यानी , बाद के अनुवादक संशोधनों, म्यूटेशन, या लिगंड बाध्यकारी) एफ-एक्टिन 6 के साथ अपने संपर्क को प्रभावित करता है। तकनीक में सीमाएं हैं (चर्चा देखें) कि शोधकर्ता को परख के प्रयास से पहले अवगत होना चाहिए।

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="842">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Sorvall MTX 150 Micro-Ultracentrifuge</td>
			<td style="width:224px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">46960</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">S100-AT3 rotor</td>
			<td style="width:224px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">45585</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Ultracentrifuge tubes - 0.2 ml</td>
			<td style="width:224px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">45233</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Actin, rabbit skeletal muscle</td>
			<td style="width:224px;">Cytoskeleton</td>
			<td style="width:119px;">AKL99</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:224px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A8531</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Polidicanol (Thesit)&#160;</td>
			<td style="width:224px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">88315</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Phalloidin</td>
			<td style="width:224px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">P3457</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td style="width:224px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">R0862</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Adenosine triphosphate (ATP)</td>
			<td style="width:224px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A2383</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Imidazole</td>
			<td style="width:224px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">O3196</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td style="width:224px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP358</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Magnesium Chloride (MgCl2)</td>
			<td style="width:224px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">M33</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td style="width:224px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">P217</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Ethylene glycol-bis(&#946;-aminoethyl ether)-N,N,N&#39;,N&#39;-tetraacetic acid (EGTA)</td>
			<td style="width:224px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">3779</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Odyssey CLx Imaging System</td>
			<td style="width:224px;">LI-COR</td>
			<td style="width:119px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Coomassie Brilliant Blue R-250 Dye</td>
			<td style="width:224px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">20278</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Colloidal Blue Staining Kit</td>
			<td style="width:224px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">LC6025</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring protein binding to f-actin by co-sedimentation

कोशिकाओं के भीतर फिलामेंटस एक्टिन (एफ एक्टिन) संगठन एंटिन बाध्यकारी प्रोटीन की एक बड़ी संख्या से नियंत्रित होता है जो एक्टिन न्यूक्लियेशन, विकास, क्रॉस-लिंकिंग और / या डिस्ैम्पैपर को नियंत्रित करते हैं। यह प्रोटोकॉल एक तकनीक का वर्णन करता है - एक्टिन सह-अवसादन, या पेलेटिंग, परख - यह निर्धारित करने के लिए कि प्रोटीन या प्रोटीन डोमेन एफ-एक्टिन को बांधता है और इंटरैक्शन की आत्मीयता ( यानी, पृथक्करण संतुलन स्थिर) को मापने के लिए। इस तकनीक में, समाधान में प्रो-एक्टिन के साथ पहले ब्याज की एक प्रोटीन लगाया गया है। इसके बाद, अंतर सेंट्रीफ्यूजेशन का उपयोग एक्टिन फिलामेंट्स के तलछट के लिए किया जाता है और पीडीटेड सामग्री का विश्लेषण एसडीएस पेज द्वारा किया जाता है। यदि ब्याज की प्रोटीन एफ-एक्टिन बांधती है, तो एक्टिन फिलामेंट्स के साथ सह-तलछट होगी। बाध्यकारी प्रतिक्रिया ( यानी, एफ-एक्टिन और ब्याज की प्रोटीन) के उत्पादों को बातचीत के संबंध को पहचानने के लिए मात्रा निर्धारित किया जा सकता है। एक्टिन पेलेटिंग परख निर्धारित करने के लिए एक सरल तकनीक हैअगर ब्याज की एक प्रोटीन एफ-एक्टिन को बांधता है और यह मूल्यांकन करने के लिए कि प्रोटीन जैसे कि लेगंड बाइंडिंग में परिवर्तन एफ-एक्टिन के साथ अपनी बातचीत को प्रभावित करता है।

हमने सह-अवसादन परख में एफ-एक्टिन के लिए बंधन αE-catenin homodimer की जांच की। चूंकि पिछले प्रयोगों ने दिखाया है कि एफ-एक्टिन के लिए एएएई-कैटेिनिन होमोडीमर का आकर्षण लगभग 1 माइक्रोन है और बी मैक्स 1 के करीब है, हमने एफ-एक्टिन (2 माइक्रोन की बजाय 0.2 माइक्रोन की कम एकाग्रता के साथ परख किया; देखें चर्चा)। चूंकि 0.2 माइक्रोन महत्वपूर्ण एकाग्रता से नीचे है, खरगोश कंकाल की मांसपेशियों जी-एक्टिन (चरण 3.3) से बहुलक एफ-एक्टिन को स्थिर करने के लिए फिलाइडिन को जोड़ा गया था। ΑE-catenin homodimer (0.125-12.0 सुक्ष्ममापी) की बढ़ती सांद्रता 0.2 माइक्रोन एफ-एक्टिन की मौजूदगी या अनुपस्थिति में होती थी। नमूनों को केन्द्रित किया गया था, और परिणामस्वरूप छर्रों का विश्लेषण किया गया ( चित्रा 1 ए )। जैसा अपेक्षित था, αE-catenin homodimer पृष्ठभूमि के ऊपर एफ-एक्टिन के साथ सह-अवशोषित ( चित्रा 1 ए , ए -एक्टिन गोली नमूनों की तुलना में नो-एफ-एसीटिन गोली नमूने) बीएसए को नकारात्मक नियंत्रण ( चित्रा 1 बी ) के रूप में चलाया गया था। बन्धे प्रोटीन की मात्रा को मापने और बातचीत के आत्मीयता की गणना करने के लिए मुक्त प्रोटीन पर प्लॉट किया गया था ( चित्रा -1 सी )। प्लॉट किए गए आंकड़े सबसे अच्छा एक हिल समीकरण में फिट हैं गणना की डी 2.9 माइक्रोन था, बी मैक्स 0.2 था, और हिल गुणांक (एच) 4.8 था। इस प्रकार, αE-catenin homodimer एफ-एक्टिन को एक कम माइक्रोलोल्लो आत्मीयता के साथ बांधे रखता है, जो पिछले काम (2.9 माइक्रोन बनाम ~ 1.0 माइक्रोन के के डी) के अनुरूप है। <img alt="आकृति 1" src="/files/ftp_upload/55613/55613fig1.jpg" /> चित्रा 1: उच्च गति एफ-एक्टिन सह-अवसादन परख। ( ए ) αE-catenin homodimer की बढ़ती सांद्रता (0.125-12.0 माइक्रोग्राम) के साथ (बाएं पैनल) या बिना (सही पैनल) incubated थे 0.2 माइक्रोन एफ-एक्टिन phalloidi के साथ स्थिरएन। वे आरटी पर 30 मिनट और सेंटीफ्यूज किए गए थे। कुल (प्रारंभिक सामग्री का 7.5%) और पेलेटेड सामग्री (पेलेटेड सामग्री का 50%) एसडीएस पृष्ठ से अलग हो गए थे और कॉमेसी डाई के साथ दाग रहे थे। ( बी ) 4 माइक्रोन बीएसए नकारात्मक नियंत्रण के रूप में चलाया गया था। कुल और गोली के नमूनों, (+) या बिना (-) एफ-एक्टिन, एसडीएस पृष्ठ से अलग हो गए थे और कॉमेसी डाई के साथ दाग रहे थे। ( सी ) बाँध αE-catenin (सुक्ष्ममापी / सुक्ष्ममापी actin) एक मुक्त αE-catenin (माइक्रोन) के खिलाफ प्लॉट किया गया था, और पहाड़ी समीकरण (लाल रेखा) के लिए फिट डेटा। के डी , बी मैक्स , और हिल गुणांक (एच) सूचीबद्ध हैं <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55613/55613fig1large.jpg" target="_blank">इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें</a> <img alt="चित्र 2" src="/files/ftp_upload/55613/55613fig2.jpg" /> चित्रा 2 चित्रा 2: Actin pelleting मात्रा का ठहराव </sTrong&gt; - प्रवाह चार्ट यह योजनाबद्ध अनुभाग 5 में प्रमुख कदमों की रूपरेखा, कुल और गोली नमूनों ( ए , सीई ) और मात्रात्मकता के लिए उपयोग किए जाने वाले मानक वक्र ( बी ) के उदाहरणों के साथ। 5.13 कदम: 1 ) कुल नमूनों (ए) में ब्याज की प्रोटीन की मात्रा का आकलन करें। 2 ) बैंड की तीव्रता बनाम प्रोटीन मास (बी) की साजिश रचने से एक मानक वक्र उत्पन्न करें। 3 ) एफ-एक्टिन ( सी ) के साथ सह-सब्जी के ब्याज की प्रोटीन की मात्रा का आकलन करें। 4 ) एफ-एक्टिन ( डी ) के अभाव में पीलेट किए गए ब्याज की प्रोटीन की मात्रा का आकलन करें। 5 ) प्रोटीन की मात्रा एफ-एक्टिन से जुड़ी निर्धारित करने के लिए डी से घटाएं। 6 ) प्रत्येक गोली (ई) में एफ-एक्टिन की मात्रा का आकलन करें, प्रति नमूना एफ-एक्टिन की औसत मात्रा की गणना करें, और प्रत्येक नमूने को औसतन औसत (नीचे दी गई संख्या अनुपात दिखाएं) से विभाजित करें। 7 )प्रत्येक नमूने के लिए, गोली में अंतर के लिए समायोजित करने के लिए एफ-एक्टिन गोली अनुपात (चरण 6 में गणना) द्वारा बाध्य प्रोटीन की मात्रा (चरण 5 में गणना) विभाजित करें। 8 ) प्रत्येक नमूने में सामान्यीकृत बाध्य प्रोटीन की मात्रा (द्रव्यमान) की गणना करने के लिए मानक वक्र ( बी ) का उपयोग करें (चरण 7)। 9 ) एक बंधनकारी वक्र बनाने के लिए मुक्त प्रोटीन और बाध्य प्रोटीन की एकाग्रता का निर्धारण करें। <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55613/55613fig2large.jpg" target="_blank">इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें</a>

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Measuring Protein Binding to F-actin by Co-sedimentation

इस प्रोटोकॉल में एक प्रोटीन की क्षमता को फिलामेंटस एक्टिन (एफ-एक्टिन) के साथ सह-तलछट की जांच करने के लिए एक विधि का वर्णन किया गया है, और यदि बाध्यकारी देखे गए हैं, तो बातचीत के संबंध को मापने के लिए।

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