Name: measuring protein binding to f-actin by co-sedimentation
Uploaded: 2017-05-18T12:30:00
Duration: 6 min 17 s
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Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health Grant HL127711 a AVK.

<ol>
	<li>Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+and+Actin-Binding+Proteins.">Actin and Actin-Binding Proteins.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 8 (8), (2016).</li><li>Hansen, M. D., Kwiatkowski, A. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+actin+gene+family:+function+follows+isoform.">The actin gene family: function follows isoform.</a> Cytoskeleton (Hoboken). 67 (10), 630-634 (2010).</li><li>Tondeleir, D., Vandamme, D., Vandekerckhove, J., Ampe, C., Lambrechts, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+isoform+expression+patterns+during+mammalian+development+and+in+pathology:+insights+from+mouse+models.">Actin isoform expression patterns during mammalian development and in pathology: insights from mouse models.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 66 (10), 798-815 (2009).</li><li>Prochniewicz, E., Janson, N., Thomas, D. D., Dela Cruz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cofilin+increases+the+torsional+flexibility+and+dynamics+of+actin+filaments.">Cofilin increases the torsional flexibility and dynamics of actin filaments.</a> J Mol Biol. 353 (5), 990-1000 (2005).</li><li>Kuhn, J. R., Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+measurements+of+actin+filament+polymerization+by+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy.">Real-time measurements of actin filament polymerization by total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Biophys J. 88 (2), 1387-1402 (2005).</li><li>Hansen, S. D., Zuchero, J. B., Mullins, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+actin:+purification+and+single+molecule+assembly+assays.">Cytoplasmic actin: purification and single molecule assembly assays.</a> Methods Mol Biol. 1046, 145-170 (2013).</li></ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Il saggio di co-sedimentazione dell&#39;azione è una tecnica diretta che può rapidamente determinare se una proteina lega F-actina. Con alcune modifiche, la tecnica può essere utilizzata anche per misurare l&#39;affinità dell&#39;interazione. Oltre ai punti sollevati nel precedente protocollo, dovrebbero essere considerati i seguenti problemi durante la progettazione, la conduzione e l&#39;interpretazione del dosaggio. Proteina d&#39;interesse Proteine ​​appena preparate o congelate possono essere utilizzate nel dosaggio. Se si utilizzano proteine ​​congelate, si raccomanda vivamente di confrontare i risultati con proteine ​​fresche (non congelate) per garantire che il congelamento non influisca sul legame di F-actina. G-actin Source Molti esperimenti di pelleting usano G-actina isolata dal muscolo a causa della relativa abbondanza. Ci sono tre isotipi principali di actina nei mammiferi - alfa, beta e gamma - che sono notevolmente simili (&gt; 90% identi di sequenzaty). Tuttavia, esistono differenze funzionali tra gli isotipi 12 , 13 . Se possibile, l&#39;isotipo del G-actin usato nel test di associazione dovrebbe corrispondere all&#39;isotipo in vivo . Ad esempio, se la prova di una proteina espressa in muscoli scheletrici, l&#39;alpha-actina è la scelta migliore; Se esaminando una proteina espressa in fibroblasti, si consiglia l&#39;beta-actina. Uso di Phalloidin Dal momento che il falloidino lega F-actina, può interferire o addirittura bloccare il legame di alcune proteine ​​leganti F-actina ( ad es. Blocchi di phalloidin bloccare cofilin da legame ai filamenti di actina). Pertanto, il falloidino deve essere usato con cautela e i risultati rispetto ai campioni trattati non falloidini quando possibile. Alto sfondo Non è raro che le proteine ​​si sedimentino in assenza di F-actina ( Figura 1A , nessun campione di pellet F-actinaS). Tuttavia, elevati livelli di sedimentazione in background possono mascherare la co-sedimentazione reale dell&#39;azione e rendere difficile, se non impossibile, determinare se una proteina lega F-actina o misurare l&#39;affinità dell&#39;interazione. L&#39;aggiunta di polidicanol al tampone di reazione (fase 4.1) può ridurre significativamente lo sfondo e costituire una soluzione facile. Se ciò non riduce lo sfondo, può essere utile regolare il buffer di reazione, la concentrazione di sale e / o la temperatura di incubazione. Curva legante Per generare una curva di legame, è necessario variare la concentrazione della proteina di interesse o dell&#39;attin-F su una serie di reazioni. In pratica, è più facile e preferibile mantenere F-actina ad una concentrazione fissa e variare la concentrazione della proteina di interesse. Il mantenimento di F-actina ad una concentrazione fissa ( es. 2 μM) nel saggio di pelletizzazione limita la cattura non specifica a concentrazioni superiori di F-actina e previeneDepolimerizzazione a concentrazioni inferiori (&lt;0,5 μM) di F-actina. La depolimerizzazione può essere impedita usando il phalloidin, anche se questo introduce un potenziale fattore complicante nel sistema (vedere punto 3.3 e sopra). Il mantenimento di F-actina ad una concentrazione fissa consente anche di confrontare (e normalizzare) il pellet di F-actina attraverso i campioni e di individuare esperimenti falliti ( cioè, dove il pellet F-actin è altamente variabile, impedendo l&#39;analisi in concentrazioni). Infine, mantenere F-actina ad una concentrazione fissa consente di determinare se il legame al filamento dell&#39;attin è cooperativo ( Figura 1C ). Legatura satura Come in tutti gli esperimenti di legame, è fondamentale che il legame con F-actina sia saturo e che la concentrazione di proteine ​​più gli alti F-actin ( Figura 1C ). Senza un plateau, non è possibile calcolare una precisa costante di equilibrio di dissociazione. CosìÈ importante pianificare attentamente la serie di diluizione da sottoporre a test e includere sempre più alte concentrazioni di proteine ​​( cioè almeno 5- 10 volte più elevate del previsto K d ). Analisi del legame Affinché le costanti di dissociazione misurate siano conclusive, il test dovrebbe essere eseguito usando una concentrazione di actina F che consente la concentrazione di siti di legame su F-actina per la proteina di interesse essere molto più bassa dell&#39;affinità. Per verificare se questo criterio è stato raggiunto, stimare la concentrazione dei siti di legame da B max . Ad esempio, se [F-actin] era 2 μM e B max = 0,5, quindi [siti di legame] ≈ 1 μM. Il K d dovrebbe essere almeno 5-10 volte più grande di [siti di legame]. Se la misura K d è dello stesso ordine di grandezza di [siti di legame], allora è possibile che la curva di legame osservata rappresenti una titolazione di legame ad alta affinitàPiuttosto che una vera isoterma vincolante. Se ciò viene osservato, ripetere il test utilizzando una concentrazione di 10 volte più bassa di actina per misurare un&#39;affinità accurata. Per interazioni di elevata affinità, la stabilizzazione di falloidina (fase 3.3) può essere necessaria per ottenere una concentrazione di actina sufficiente a misurare con precisione l&#39;affinità. Infine, ci sono limiti fondamentali con il test di co-sedimentazione che i ricercatori dovrebbero essere consapevoli durante l&#39;esecuzione e la valutazione del dosaggio. Il più importante, il test di co-sedimentazione non produce una vera costante di equilibrio. I prodotti di legame ( cioè proteine ​​e F-actina) vengono separati dai reagenti durante la centrifugazione, dopo di che i prodotti possono dissociarsi per creare un nuovo equilibrio. Di conseguenza, il test di co-sedimentazione può erroneamente calcolare o non riescono a rilevare interazioni a bassa affinità. Poiché molte proteine ​​leganti di actina hanno una bassa affinità ( cioè, micromolare) per l&#39;F-actina, un risultato negativo ( <eM&gt; cioè nessun legame rilevabile) nel test non significa necessariamente che una proteina non lega F-actina. In alternativa, i test di associazione a filo a filamenti basati sulla microscopia TIRF sono più sensibili e più accurati per determinare una costante di dissociazione (per recensioni su questa tecnica, vedere i riferimenti 15,16 ). Nonostante queste limitazioni, il dosaggio di pelleting è all&#39;interno dei mezzi della maggior parte dei ricercatori ed è uno strumento efficace per determinare se una proteina lega F-actina e misurare l&#39;affinità dell&#39;interazione.

Actin è una proteina citoscheletrica essenziale che svolge un ruolo fondamentale nei processi cellulari multipli, tra cui la motilità, la contrazione, l&#39;adesione e la morfologia 1 . Actin esiste in due forme: actina globulare monomerica (G-actina) e actina filamentosa polimerizzata (F-actina). All&#39;interno delle cellule, l&#39;organizzazione di F-actin è controllata da una grande collezione di proteine ​​che regolano la nucleazione, la crescita, la reticolazione e lo smontaggio dei filamenti attinenti 2 , 3 , 4 . Tuttavia, come funzionano in concorrenza molteplici proteine ​​leganti di actina per regolare l&#39;organizzazione della rete di actine è ancora in gran parte poco chiara. La misurazione delle interazioni proteine-proteine ​​è un approccio importante per capire come le proteine ​​esercitano i loro effetti sul comportamento cellulare a livello biochimico. Molti test possono essere usati per rilevare le interazioni tra proteine ​​purificate.Gli approcci comuni per le proteine ​​solubili includono i pull-down, la polarizzazione di fluorescenza, la calorimetria di titolazione isoterma e la risonanza di plasmone superficiale. Importante, tutti questi dosaggi richiedono che le proteine ​​siano solubili e siano quindi difficili da adattare per l&#39;uso con una proteina polimerica, filamentosa come F-actina. Qui descriviamo una tecnica - la co-sedimentazione di actina o il comportamento di pellet, per determinare se un dominio proteico o proteico lega F-actina e misurare l&#39;affinità dell&#39;interazione. Il test di pelleting di actina è una tecnica relativamente semplice che non richiede attrezzature specializzate, oltre ad un ultracentrifuga. Tutti i reagenti possono essere realizzati assumendo la conoscenza della biochimica di base o acquistati. Una volta stabilito un legame con F-actina, il saggio può essere utilizzato per misurare l&#39;apparente affinità ( cioè la costante di equilibrio della dissociazione) 5 . Inoltre, una volta stabilita un&#39;affinità, il saggio di pelletingÈ uno strumento utile per misurare come le modifiche alla proteina di interesse ( cioè modificazioni post-traslazionali, mutazioni o legame legame) influenzino la sua interazione con F-actin 6 . La tecnica ha limitazioni (vedi Discussione ) che il ricercatore deve essere a conoscenza prima di tentare il test.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="842">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Sorvall MTX 150 Micro-Ultracentrifuge</td>
			<td style="width:224px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">46960</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">S100-AT3 rotor</td>
			<td style="width:224px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">45585</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Ultracentrifuge tubes - 0.2 ml</td>
			<td style="width:224px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">45233</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Actin, rabbit skeletal muscle</td>
			<td style="width:224px;">Cytoskeleton</td>
			<td style="width:119px;">AKL99</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:224px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A8531</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Polidicanol (Thesit)&#160;</td>
			<td style="width:224px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">88315</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Phalloidin</td>
			<td style="width:224px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">P3457</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td style="width:224px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">R0862</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Adenosine triphosphate (ATP)</td>
			<td style="width:224px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A2383</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Imidazole</td>
			<td style="width:224px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">O3196</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td style="width:224px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP358</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Magnesium Chloride (MgCl2)</td>
			<td style="width:224px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">M33</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td style="width:224px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">P217</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Ethylene glycol-bis(&#946;-aminoethyl ether)-N,N,N&#39;,N&#39;-tetraacetic acid (EGTA)</td>
			<td style="width:224px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">3779</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Odyssey CLx Imaging System</td>
			<td style="width:224px;">LI-COR</td>
			<td style="width:119px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Coomassie Brilliant Blue R-250 Dye</td>
			<td style="width:224px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">20278</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Colloidal Blue Staining Kit</td>
			<td style="width:224px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">LC6025</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring protein binding to f-actin by co-sedimentation

L&#39;organizzazione filamentosa di actina (F-actin) all&#39;interno delle cellule è regolata da un gran numero di proteine ​​legate all&#39;attinità che controllano la nucleazione, la crescita, la reticolazione e / o lo smontaggio dell&#39;attin. Questo protocollo descrive una tecnica - la co-sedimentazione di actina o il processo di pelletizzazione - per determinare se un dominio proteico o proteico lega F-actina e misurare l&#39;affinità dell&#39;interazione ( cioè la costante di equilibrio della dissociazione). In questa tecnica, una proteina di interesse viene prima incubata con F-actina in soluzione. Successivamente, la centrifugazione differenziale viene usata per sedimentare i filamenti di actina e il materiale pelletato viene analizzato mediante SDS-PAGE. Se la proteina di interesse lega F-actina, co-sedimenti con i filamenti di actina. I prodotti della reazione di legame ( cioè F-actina e la proteina di interesse) possono essere quantificati per determinare l&#39;affinità dell&#39;interazione. Il test di pelleting di actina è una tecnica diretta per determinareSe una proteina di interesse lega F-actina e per valutare come le modifiche a quella proteina, come il binding del ligando, influenzano la sua interazione con F-actina.

Abbiamo esaminato l&#39;associazione dell&#39;omodimero di αE-catenina all&#39;actin F nel test di co-sedimentazione. Dato che gli esperimenti passati hanno dimostrato che l&#39;affinità dell&#39;omodimero αE-catenina per F-actina è di circa 1 μM e il B max vicino a 11 , abbiamo eseguito il saggio con una bassa concentrazione di F-actina (0,2 μM piuttosto che 2 μM; la discussione). Poiché 0,2 μM è al di sotto della concentrazione critica, è stato aggiunto il falloidina per stabilizzare l&#39;actina F-polimerizzata dal muscolo scheletrico G-actina (fase 3.3). Aumento delle concentrazioni di homodimer αE-catenina (0,125-12,0 μM) sono state incubate in presenza o in assenza di 0,2 μM di F-actina. I campioni sono stati centrifugati e le pellicole risultanti sono state analizzate ( figura 1A ). Come previsto, l&#39;omodimero αE-catenina co-sedimentato con F-actina sopra lo sfondo ( Figura 1A , confrontare i campioni di pellet F-actin con il no-F-acCampioni di pellets di stagno). BSA è stato eseguito come un controllo negativo ( Figura 1B ). La proteina legata è stata quantificata e tracciata su proteine ​​libere per calcolare l&#39;affinità dell&#39;interazione ( Figura 1C ). I dati grafici mostrano meglio l&#39;equazione di Hill. La K d calcolata era 2.9 μM, il B max era 0.2 e il coefficiente Hill (h) era 4.8. Così, l&#39;omodimero αE catenina lega F-actina in cooperativa con una bassa affinità micromolare, coerente con il precedente lavoro (Kd di 2,9 μM rispetto a ~ 1,0 μM) 11 . <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55613/55613fig1.jpg" /> Figura 1: Saggio di co-sedimentazione ad alta velocità di F-actina. ( A ) Concentrazioni aumentanti (0,125-12,0 μM) di homodimero αE-catenina sono state incubate con (pannelli sinistri) o senza (pannelli destro) 0,2 μM F-actina stabilizzata con phalloidin. Sono stati incubati per 30 minuti a RT e centrifugati. Il totale (7,5% del materiale di partenza) e il materiale pelletato (50% del materiale pelletato) sono stati separati da SDS-PAGE e macchiati con colorante Coomassie. ( B ) 4 μM BSA è stato eseguito come un controllo negativo. I campioni totali e di pellet, con (+) o senza (-) F-actina, sono stati separati da SDS-PAGE e colorati con colorante Coomassie. ( C ) La lega αE-catenina (μM / μM actina) da A è stata plottata contro la catenina αE libera (μM) ei dati sono adatti ad un&#39;equazione della collina (linea rossa). Sono elencati i coefficienti K d , B max e Hill (h). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55613/55613fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/55613/55613fig2.jpg" /> Figura 2: Quantificazione di pellet di Actin </sTrong&gt; - diagramma di flusso. Questo schema descrive i punti chiave nella sezione 5, con esempi di campioni di Total e Pellet ( A , CE ) e la curva standard ( B ) utilizzata per la quantificazione. 5.13 passi: 1 ) Misura la quantità di proteine ​​di interesse nei campioni totali (A). 2 ) Generare una curva standard plottando l&#39;intensità della banda rispetto alla massa proteica (B). 3 ) Misurare la quantità di proteine ​​di interesse che co-sedimentate con F-actin ( C ). 4 ) Misurare la quantità di proteine ​​di interesse che vengono pelletate in assenza di F-actina ( D ). 5 ) Sottrai D da C per determinare la quantità di proteina legata all&#39;Actin F. 6 ) Misurare la quantità di F-actina in ogni pellet (E), calcolare la quantità media di F-actina per campione e dividere ogni campione per la media (i numeri riportati di seguito mostrano il rapporto). 7 )Per ogni campione, dividere la quantità di proteina legata (calcolata nella fase 5) dal rapporto di pellet F-actin (calcolato al punto 6) per regolare le differenze nel pellet. 8 ) Utilizzare la curva standard ( B ) per calcolare la quantità (massa) della proteina legata normalizzata in ciascun campione (passo 7). 9 ) Determinare la concentrazione di proteine ​​libere e proteine ​​legate per creare una curva di legame. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55613/55613fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Measuring Protein Binding to F-actin by Co-sedimentation

Questo protocollo descrive un metodo per testare la capacità di una proteina a co-sedimentare con l&#39;actina filamentosa (F-actina) e, se si osserva il legame, per misurare l&#39;affinità dell&#39;interazione.

La misurazione della legame proteico con F-actina mediante co-sedimentazione

Filamentous actin (F-actin) organization within cells is regulated by a large number of actin-binding proteins that control actin nucleation, growth, ...

Research

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Biochemistry

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Measuring Biomolecular DSC Profiles with Thermolabile Ligands to Rapidly Characterize Folding and Binding Interactions

Misurazione di profili biomolecolari DSC con ligandi termolabile per caratterizzare velocemente pieghevole e associazione interazioni

Differential scanning calorimetry (DSC) is a powerful technique for quantifying thermodynamic parameters governing biomolecular folding and binding ...

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

Caratterizzazione biochimica e strutturale del carboidrato trasporto substrato-proteina-SP0092

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Rab10 Phosphorylation Detection by LRRK2 Activity Using SDS-PAGE with a Phosphate-binding Tag

Rilevamento di fosforilazione di Rab10 di LRRK2 attività mediante SDS-PAGE con un Tag di fosfato-binding

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of ...

Measuring Trans-Plasma Membrane Electron Transport by C2C12 Myotubes

Trasporto dell'elettrone di miotubi C2C12 Trans-Plasma membrana di misura

Trans-plasma membrane electron transport (tPMET) plays a role in protection of cells from intracellular reductive stress as well as protection from damage ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Microgravimetry dissipativo per studiare la dinamica di associazione del fosfolipide proteina Annessina A2 a lipidici solido-supportato utilizzando un risonatore al quarzo

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Measuring and Interpreting Oxygen Consumption Rates in Whole Fly Head Segments

Misurare e interpretare i tassi di consumo di ossigeno in tutto Vola testa segmenti

Regulated metabolic activity is essential for the normal functioning of living cells. Indeed, altered metabolic activity is causally linked with the ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Alta sensibilità misura dell'affinità di legame di DNA di fattore di trascrizione per titolazione competitivo mediante microscopia a fluorescenza

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...