Name: measuring protein binding to f-actin by co-sedimentation
Uploaded: 2017-05-18T12:30:00
Duration: 6 min 17 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Protein Binding to F-actin by Co-sedimentation at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health Grant HL127711 til AVK.

<ol>
	<li>Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+and+Actin-Binding+Proteins.">Actin and Actin-Binding Proteins.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 8 (8), (2016).</li><li>Hansen, M. D., Kwiatkowski, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+actin+dynamics+by+allosteric+regulation+of+actin+binding+proteins.">Control of actin dynamics by allosteric regulation of actin binding proteins.</a> Int Rev Cell Mol Biol. 303, 1-25 (2013).</li><li>Lappalainen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin-binding+proteins:+the+long+road+to+understanding+the+dynamic+landscape+of+cellular+actin+networks.">Actin-binding proteins: the long road to understanding the dynamic landscape of cellular actin networks.</a> Mol Biol Cell. 27 (16), 2519-2522 (2016).</li><li>Mullins, R. D., Hansen, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+studies+of+actin+filament+and+network+dynamics.">In vitro studies of actin filament and network dynamics.</a> Curr Opin Cell Biol. 25 (1), 6-13 (2013).</li><li>Miller, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Danio+rerio+alphaE-catenin+is+a+monomeric+F-actin+binding+protein+with+distinct+properties+from+Mus+musculus+alphaE-catenin.">Danio rerio alphaE-catenin is a monomeric F-actin binding protein with distinct properties from Mus musculus alphaE-catenin.</a> J Biol Chem. 288 (31), 22324-22332 (2013).</li><li>Wickline, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=alphaT-Catenin+Is+a+Constitutive+Actin-binding+alpha-Catenin+That+Directly+Couples+the+Cadherin.Catenin+Complex+to+Actin+Filaments.">alphaT-Catenin Is a Constitutive Actin-binding alpha-Catenin That Directly Couples the Cadherin.Catenin Complex to Actin Filaments.</a> J Biol Chem. 291 (30), 15687-15699 (2016).</li><li>Simpson, R. J., Adams, P. D., Golemis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Basic methods in protein purification and analysis : a laboratory manual. , (2009).</li><li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4.">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li><li>Dyballa, N., Metzger, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+and+sensitive+colloidal+coomassie+G-250+staining+for+proteins+in+polyacrylamide+gels.">Fast and sensitive colloidal coomassie G-250 staining for proteins in polyacrylamide gels.</a> J Vis Exp. (30), (2009).</li><li>Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+simple+and+informative+binding+assays.">A guide to simple and informative binding assays.</a> Mol Biol Cell. 21 (23), 4061-4067 (2010).</li><li>Hansen, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=alphaE-catenin+actin-binding+domain+alters+actin+filament+conformation+and+regulates+binding+of+nucleation+and+disassembly+factors.">alphaE-catenin actin-binding domain alters actin filament conformation and regulates binding of nucleation and disassembly factors.</a> Mol Biol Cell. 24 (23), 3710-3720 (2013).</li><li>Perrin, B. J., Ervasti, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+actin+gene+family:+function+follows+isoform.">The actin gene family: function follows isoform.</a> Cytoskeleton (Hoboken). 67 (10), 630-634 (2010).</li><li>Tondeleir, D., Vandamme, D., Vandekerckhove, J., Ampe, C., Lambrechts, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+isoform+expression+patterns+during+mammalian+development+and+in+pathology:+insights+from+mouse+models.">Actin isoform expression patterns during mammalian development and in pathology: insights from mouse models.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 66 (10), 798-815 (2009).</li><li>Prochniewicz, E., Janson, N., Thomas, D. D., Dela Cruz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cofilin+increases+the+torsional+flexibility+and+dynamics+of+actin+filaments.">Cofilin increases the torsional flexibility and dynamics of actin filaments.</a> J Mol Biol. 353 (5), 990-1000 (2005).</li><li>Kuhn, J. R., Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+measurements+of+actin+filament+polymerization+by+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy.">Real-time measurements of actin filament polymerization by total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Biophys J. 88 (2), 1387-1402 (2005).</li><li>Hansen, S. D., Zuchero, J. B., Mullins, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+actin:+purification+and+single+molecule+assembly+assays.">Cytoplasmic actin: purification and single molecule assembly assays.</a> Methods Mol Biol. 1046, 145-170 (2013).</li></ol>

Forfatterne erklærer at de ikke har konkurrerende økonomiske interesser.

Actin-co-sedimentasjonsanalysen er en enkel teknikk som raskt kan bestemme om et protein binder F-aktin. Med noen modifikasjoner kan teknikken også brukes til å måle samspillets affinitet. I tillegg til punkter som er reist i protokollen over, bør følgende problemer vurderes ved utforming, gjennomføring og tolkning av analysen. Protein av interesse Ferskt tilberedt eller frosset protein kan brukes i analysen. Hvis frosset protein brukes, anbefales det sterkt at resultatene sammenlignes med friskt (aldri frosset) protein for å sikre at frysing ikke påvirker F-aktinbindingen. G-actin Kilde Mange pelleteringsforsøk bruker G-aktin isolert fra muskel på grunn av dens relative overflod. Det finnes tre hovedaktinisotyper i pattedyr - alfa, beta og gamma - som er bemerkelsesverdig like (&gt; 90% sekvensidentifikasjonty). Likevel er det funksjonelle forskjeller mellom isotypene 12 , 13 . Hvis det er mulig, bør G-actin isotypen som brukes i bindingsanalysen, stemme overens med in vivo isotypen. For eksempel, hvis du tester et protein uttrykt i skjelettmuskulatur, er alpha-actin det beste valget; Hvis man undersøker et protein uttrykt i fibroblaster, anbefales beta-aktin. Phalloidin Bruk Siden phalloidin binder F-aktin, kan det forstyrre eller blokkere bindingen av enkelte F-aktinbindende proteiner ( f.eks. Phalloidin blokker cofilin fra binding til actinfilamenter) 14 . Således bør phalloidin brukes med forsiktighet og resultatene sammenlignet med ikke-falloidinbehandlede prøver når det er mulig. Høy bakgrunn Det er ikke uvanlig for proteiner å sedimentere i fravær av F-aktin ( Figur 1A , ingen F-aktin pelletsprøves). Imidlertid kan høye nivåer av bakgrunns sedimentering maskere sann aktinsam-sedimentering og gjøre det vanskelig, om ikke umulig å avgjøre om et protein binder F-aktin eller for å måle samspillets affinitet. Tilsetning av polidicanol til reaksjonsbufferen (trinn 4.1) kan redusere bakgrunnen betydelig og er en enkel løsning. Hvis det ikke reduserer bakgrunnen, kan justering av reaksjonsbufferen, saltkonsentrasjonen og / eller inkubasjonstemperaturen hjelpe. Bindende kurve For å generere en bindende kurve, er det nødvendig å variere konsentrasjonen av enten protein av interesse eller F-aktin over en rekke reaksjoner. I praksis er det lettere og foretrukket å opprettholde F-aktin ved en fast konsentrasjon og å variere konsentrasjonen av proteinet av interesse. Vedlikehold av F-aktin ved en fast konsentrasjon ( f.eks. 2 μM) i pelleteringsanalysen begrenser ikke-spesifikk fangst ved høyere konsentrasjoner av F-aktin og forhindrerDepolymerisering ved lavere (&lt;0,5 μM) konsentrasjoner av F-aktin. Depolymerisering kan forebygges ved bruk av phalloidin, selv om dette introduserer en potensiell kompliserende faktor i systemet (se trinn 3.3 og høyere). Ved å opprettholde F-actin ved en fast konsentrasjon kan man også sammenligne (og normalisere) F-aktin-pelleten over prøver og identifisere mislykkede eksperimenter ( dvs. hvor F-aktin-pellet er svært variabel, forhindrer analyse på tvers av konsentrasjoner). Til slutt, ved å opprettholde F-aktin ved en fast konsentrasjon, kan man bestemme om bindingen til actinfilamentet er kooperativ ( figur 1C ). Mettet bindende Som i alle bindende eksperimenter er det kritisk at bindingen til F-aktin er mettet og at konsentrasjonen av protein pluss F-aktinplater ( Figur 1C ). Uten et platå er det ikke mulig å beregne en nøyaktig dissosiasjon likevektskonstant. Dermed er detDet er viktig å nøye planlegge fortynningsserien som skal testes, og å alltid inkludere høyere konsentrasjoner av protein ( dvs. minst 5-10 ganger høyere enn forventet K d ). Bindingsanalyse For at de målte dissosiasjonskonstanter skal være avgjørende, bør analysen utføres ved bruk av en F-aktinkonsentrasjon som tillater konsentrasjonen av bindingssteder på F-aktin for proteinet av interesse å være mye lavere enn affiniteten. For å kontrollere om dette kriteriet var oppfylt, anslår konsentrasjonen av bindingssteder fra B max . For eksempel, hvis [F-actin] var 2 μM og Bmax = 0,5, så [bindingssteder] ≈ 1 μM. K d bør være minst 5-10 ganger større enn [bindingssteder]. Hvis den målte Kd er av samme størrelsesorden som [bindingssteder], er det mulig at den observerte bindingskurven representerer en titrering av høy affinitetsbindende siTes heller enn en ekte bindende isoterm. Hvis dette observeres, gjenta analysen ved å bruke en 10-ganger lavere F-aktinkonsentrasjon for å måle en nøyaktig affinitet. For interaksjoner med høy affinitet kan phalloidin-stabilisering (trinn 3.3) være nødvendig for å oppnå en F-aktinkonsentrasjon som er lav nok til nøyaktig måling av affinitet. Endelig er det grunnleggende begrensninger med samesettingsanalysen som forskere bør være oppmerksomme på når de utfører og evaluerer analysen. Viktigst av alt produserer co-sedimentasjonsanalysen ikke en ekte likevektskonstant. Produktene av binding ( dvs. protein pluss F-aktin) separeres fra reaktantene under sentrifugering, hvoretter produktene deretter kan dissosiere for å skape en ny likevekt. Som et resultat kan co-sedimenteringsassayet feilberegne eller mislykkes i å oppdage lavaffinitetsinteraksjoner. Siden mange aktinbindende proteiner har lav ( dvs. mikromolær) affinitet for F-aktin, et negativt resultat ( <eM&gt; dvs. ingen detekterbar binding) i analysen betyr ikke nødvendigvis at et protein ikke binder F-aktin. Som et alternativ er TIRF-mikroskopi-baserte, enkeltfilamentbindende analyser mer følsomme og mer nøyaktige for å bestemme en dissosiasjonskonstant (for referanser på denne teknikken, se referanser 15,16 ). Til tross for disse begrensningene er pelleteringsanalysen innenfor de fleste forskere og er et effektivt verktøy for å bestemme om et protein binder F-aktin og for å måle samspillets affinitet.

Actin er et essensielt cytoskeletalt protein som spiller en kritisk rolle i flere cellulære prosesser, inkludert motilitet, sammentrekning, adhesjon og morfologi 1 . Actin finnes i to former: monomer globulær actin (G-aktin) og polymerisert filamentøs actin (F-aktin). Innenfor celler styres F-aktin organisasjonen av en stor samling proteiner som regulerer kjernefølge, vekst, tverrbinding og demontering av aktinfilamenter 2 , 3 , 4 . Men hvordan flere aktinbindende proteiner fungerer sammen for å regulere actin-nettverksorganisasjonen er fortsatt stort sett uklart. Måling av protein-protein-interaksjoner er en viktig tilnærming for å forstå hvordan proteiner påvirker cellens adferd på det biokjemiske nivået. Mange forskjellige analyser kan brukes til å oppdage interaksjoner mellom rensede proteiner.Vanlige tilnærminger for løselige proteiner inkluderer nedtrekk, fluorescenspolarisasjon, isotermisk titreringskalorimetri og overflateplasmonresonans. Viktig er at alle disse analysene krever at proteiner er oppløselige, og er således vanskelige å tilpasse for bruk med et polymert, filamentøst protein, slik som F-aktin. Her beskriver vi en teknikk - aktinsam-sedimentering, eller pelletering, analyse - for å avgjøre om et protein- eller protein-domene binder F-aktin og for å måle samspillets affinitet. Actin pelleteringsanalysen er en relativt enkel teknikk som ikke krever spesialisert utstyr, bortsett fra en ultracentrifuge. Alle reagenser kan gjøres, forutsatt kunnskap om grunnleggende biokjemi, eller kjøpt. Når bindingen til F-actin er etablert, kan analysen brukes til å måle den tilsynelatende affinitet ( dvs. dissosiasjon likevektskonstanten) 5 . Også, når en affinitet er etablert, blir pelleteringsanalysenEr et nyttig verktøy for å måle hvordan endringer i protein av interesse ( dvs. posttranslasjonelle modifikasjoner, mutasjoner eller ligandbinding) påvirker dets interaksjon med F-aktin 6 . Teknikken har begrensninger (se diskusjonen ) som forskeren bør være oppmerksom på før forsøk på analysen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="842">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Sorvall MTX 150 Micro-Ultracentrifuge</td>
			<td style="width:224px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">46960</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">S100-AT3 rotor</td>
			<td style="width:224px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">45585</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Ultracentrifuge tubes - 0.2 ml</td>
			<td style="width:224px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">45233</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Actin, rabbit skeletal muscle</td>
			<td style="width:224px;">Cytoskeleton</td>
			<td style="width:119px;">AKL99</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:224px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A8531</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Polidicanol (Thesit)&#160;</td>
			<td style="width:224px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">88315</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Phalloidin</td>
			<td style="width:224px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">P3457</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td style="width:224px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">R0862</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Adenosine triphosphate (ATP)</td>
			<td style="width:224px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A2383</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Imidazole</td>
			<td style="width:224px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">O3196</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td style="width:224px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP358</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Magnesium Chloride (MgCl2)</td>
			<td style="width:224px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">M33</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td style="width:224px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">P217</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Ethylene glycol-bis(&#946;-aminoethyl ether)-N,N,N&#39;,N&#39;-tetraacetic acid (EGTA)</td>
			<td style="width:224px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">3779</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Odyssey CLx Imaging System</td>
			<td style="width:224px;">LI-COR</td>
			<td style="width:119px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Coomassie Brilliant Blue R-250 Dye</td>
			<td style="width:224px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">20278</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Colloidal Blue Staining Kit</td>
			<td style="width:224px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">LC6025</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring protein binding to f-actin by co-sedimentation

Filamentøs actin (F-aktin) organisering i celler reguleres av et stort antall aktinbindende proteiner som styrer actin-nukleering, vekst, kryssbinding og / eller demontering. Denne protokollen beskriver en teknikk - aktinsam-sedimentering, eller pelletering, analyse - for å bestemme om et protein- eller protein-domene binder F-aktin og for å måle affiniteten til interaksjonen ( dvs. dissosiasjon likevektskonstanten). I denne teknikken blir et protein av interesse først inkubert med F-aktin i oppløsning. Derefter brukes differensiell sentrifugering til sedimentering av actinfilamenter, og det pelleterte materiale analyseres ved SDS-PAGE. Hvis protein av interesse binder F-aktin, vil det sam-sedimentere med actinfilamenter. Produktene av bindingsreaksjonen ( dvs. F-aktin og protein av interesse) kan kvantifiseres for å bestemme samspillets affinitet. Aktinpelleteringsanalysen er en enkel teknikk for å bestemmeHvis et protein av interesse binder F-aktin og for å vurdere hvordan endringer i det proteinet, slik som ligandbinding, påvirker dets interaksjon med F-aktin.

Vi undersøkte aE-katenin-homodimerbinding til F-aktin i sam-sedimenteringsassayet. Siden tidligere eksperimenter har vist at affiniteten til aE-katenin homodimer for F-aktin er rundt 1 μM og B max nær 1 11 , utførte vi analysen med en lav konsentrasjon av F-aktin (0,2 μM i stedet for 2 μM, se Diskusjonen). Siden 0,2 μM er under den kritiske konsentrasjonen ble phalloidin tilsatt for å stabilisere F-aktin polymerisert fra kaninskjelettmuskel G-aktin (trinn 3.3). Økende konsentrasjoner av aE-katenin homodimer (0,125-12,0 μM) ble inkubert i nærvær eller fravær av 0,2 μM F-aktin. Prøvene ble sentrifugert, og de resulterende pellets ble analysert ( figur 1A ). Som forventet, sammenligner aE-katenin-homodimeren med sedimentert F-aktin over bakgrunnen ( Figur 1A , F-aktin-pelletprøver til nei-F-acTinnpelletsprøver). BSA ble kjørt som en negativ kontroll ( figur 1B ). Bundet protein ble kvantifisert og plottet over fritt protein for å beregne samspillets affinitet ( figur 1C ). De plottede dataene passer best til en Hill-ligning. Den beregnede Kd var 2,9 μM, B max var 0,2, og Hill-koeffisienten (h) var 4,8. Således binder aE-katenin homodimer F-aktin sammen med en lav mikromolar affinitet, i samsvar med tidligere arbeid (en Kd på 2,9 μM versus ~ 1,0 μM) 11 . <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/55613/55613fig1.jpg" /> Figur 1: F-aktin med høy hastighet med sedimenteringsassay. ( A ) Økende konsentrasjoner (0,125-12,0 μM) aE-katenin homodimer ble inkubert med (venstre panel) eller uten (høyre paneler) 0,2 μM F-aktin stabilisert med phalloidin. De ble inkubert i 30 minutter ved RT og sentrifugert. Totalt (7,5% av utgangsmaterialet) og pelletert materiale (50% av det pelleterte materiale) ble separert med SDS-PAGE og farget med Coomassie-fargestoff. ( B ) 4 μM BSA ble kjørt som en negativ kontroll. Totalt og pelletprøver med (+) eller uten (-) F-aktin ble separert med SDS-PAGE og farget med Coomassie-fargestoff. ( C ) Bundet αE-katenin (μM / μM actin) fra A ble plottet mot fri αE-katenin (μM), og dataene passer til en Hill-ligning (rød linje). Kd, Bmax og Hill-koeffisienten (h) er oppført. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55613/55613fig1large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/55613/55613fig2.jpg" /> Figur 2: Actin-pelleteringskvantifisering </sTrong&gt; - flytskjema . Dette skjematisk beskriver hovedtrinnene i kapittel 5, med eksempler på totalt og pelletprøver ( A , CE ) og standardkurven ( B ) som brukes til kvantifisering. 5.13 trinn: 1 ) Mål mengden protein av interesse i Totalprøver (A). 2 ) Generer en standardkurve ved å tegne båndintensiteten mot proteinmasse (B). 3 ) Mål mengden protein av interesse som co-sedimentert med F-actin ( C ). 4 ) Mål mengden protein av interesse som pelleterte i fravær av F-actin ( D ). 5 ) Subtrahere D fra C for å bestemme mengden protein bundet til F-aktin. 6 ) Mål mengden av F-aktin i hver pellet (E), beregne gjennomsnittlig mengde F-aktin per prøve, og del hver prøve av gjennomsnittet (tallene under viser forholdet). 7 )For hver prøve deles mengden av bundet protein (beregnet i trinn 5) med F-aktinpelletforholdet (beregnet i trinn 6) for å justere for forskjeller i pelleten. 8 ) Bruk standardkurven ( B ) til å beregne mengden av normalisert bundet protein i hver prøve (trinn 7). 9 ) Bestem konsentrasjonen av fritt protein og bundet protein for å lage en bindende kurve. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55613/55613fig2large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Protein Binding to F-actin by Co-sedimentation at JoVE.com

Measuring Protein Binding to F-actin by Co-sedimentation

Denne protokollen beskriver en metode for å teste evnen til et protein til å sedimentere med filamentøs aktin (F-aktin) og, hvis bindingen observeres, for å måle affiniteten til interaksjonen.

Måling av proteinbinding til F-aktin ved co-sedimentering

Filamentous actin (F-actin) organization within cells is regulated by a large number of actin-binding proteins that control actin nucleation, growth, ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Measuring G-protein-coupled Receptor Signaling via Radio-labeled GTP Binding

Måling av G-proteinkoblet reseptor-signalering via radiomerket GTP-binding

G-Protein-Coupled Receptors (GPCRs) are a large family of transmembrane receptors that play critical roles in normal cellular physiology and constitute a ...

In Vitro Polymerization of F-actin on Early Endosomes

In Vitro Polymerization of F-actin on Early Endosomes

In Vitro Av F-utgangen på tidlig Endosomes

Many early endosome functions, particularly cargo protein sorting and membrane deformation, depend on patches of short F-actin filaments nucleated onto ...

Assay for Phosphorylation and Microtubule Binding Along with Localization of Tau Protein in Colorectal Cancer Cells

Analysen for fosforylering og Microtubule Binding med lokalisering av Tau Protein i tykktarmskreft celler

The microtubule-associated protein tau is a neuronal protein that localizes mostly in axons. Generally tau is essential for normal neuronal functioning ...

Measuring Biomolecular DSC Profiles with Thermolabile Ligands to Rapidly Characterize Folding and Binding Interactions

Måle Biomolecular DSC profiler med Thermolabile ligander å raskt karakterisere Folding og bindende interaksjoner

Differential scanning calorimetry (DSC) is a powerful technique for quantifying thermodynamic parameters governing biomolecular folding and binding ...

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

Biokjemiske og strukturelle karakteristikk av karbohydrater Transport substrat-binding-protein SP0092

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Rab10 Phosphorylation Detection by LRRK2 Activity Using SDS-PAGE with a Phosphate-binding Tag

Rab10 fosforylering gjenkjenning av LRRK2 aktivitet SDS-side med en fosfat-bindende kode

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of ...

Measuring Trans-Plasma Membrane Electron Transport by C2C12 Myotubes

Måle Trans-Plasma membran elektronet Transport av C2C12 Myotubes

Trans-plasma membrane electron transport (tPMET) plays a role in protection of cells from intracellular reductive stress as well as protection from damage ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Dissipative Microgravimetry å studere Binding dynamikken i Phospholipid bindende Protein Annexin A2 til Solid-støttet Lipid Bilayers bruker et Quartz-Resonator

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Measuring and Interpreting Oxygen Consumption Rates in Whole Fly Head Segments

Måling og tolke oksygen forbruk priser helt Fly hodet segmenter

Regulated metabolic activity is essential for the normal functioning of living cells. Indeed, altered metabolic activity is causally linked with the ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Høy følsomhet måling av transkripsjon faktor-DNA Binding slektskap av konkurransedyktige titrering bruker fluorescens mikroskopi

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...