Name: measuring protein binding to f-actin by co-sedimentation
Uploaded: 2017-05-18T12:30:00
Duration: 6 min 17 s
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Este trabalho foi apoiado pelo National Institutes of Health Grant HL127711 para AVK.

<ol>
	<li>Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+and+Actin-Binding+Proteins.">Actin and Actin-Binding Proteins.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 8 (8), (2016).</li><li>Hansen, M. D., Kwiatkowski, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+actin+dynamics+by+allosteric+regulation+of+actin+binding+proteins.">Control of actin dynamics by allosteric regulation of actin binding proteins.</a> Int Rev Cell Mol Biol. 303, 1-25 (2013).</li><li>Lappalainen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin-binding+proteins:+the+long+road+to+understanding+the+dynamic+landscape+of+cellular+actin+networks.">Actin-binding proteins: the long road to understanding the dynamic landscape of cellular actin networks.</a> Mol Biol Cell. 27 (16), 2519-2522 (2016).</li><li>Mullins, R. D., Hansen, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+studies+of+actin+filament+and+network+dynamics.">In vitro studies of actin filament and network dynamics.</a> Curr Opin Cell Biol. 25 (1), 6-13 (2013).</li><li>Miller, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Danio+rerio+alphaE-catenin+is+a+monomeric+F-actin+binding+protein+with+distinct+properties+from+Mus+musculus+alphaE-catenin.">Danio rerio alphaE-catenin is a monomeric F-actin binding protein with distinct properties from Mus musculus alphaE-catenin.</a> J Biol Chem. 288 (31), 22324-22332 (2013).</li><li>Wickline, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=alphaT-Catenin+Is+a+Constitutive+Actin-binding+alpha-Catenin+That+Directly+Couples+the+Cadherin.Catenin+Complex+to+Actin+Filaments.">alphaT-Catenin Is a Constitutive Actin-binding alpha-Catenin That Directly Couples the Cadherin.Catenin Complex to Actin Filaments.</a> J Biol Chem. 291 (30), 15687-15699 (2016).</li><li>Simpson, R. J., Adams, P. D., Golemis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Basic methods in protein purification and analysis : a laboratory manual. , (2009).</li><li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4.">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li><li>Dyballa, N., Metzger, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+and+sensitive+colloidal+coomassie+G-250+staining+for+proteins+in+polyacrylamide+gels.">Fast and sensitive colloidal coomassie G-250 staining for proteins in polyacrylamide gels.</a> J Vis Exp. (30), (2009).</li><li>Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+simple+and+informative+binding+assays.">A guide to simple and informative binding assays.</a> Mol Biol Cell. 21 (23), 4061-4067 (2010).</li><li>Hansen, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=alphaE-catenin+actin-binding+domain+alters+actin+filament+conformation+and+regulates+binding+of+nucleation+and+disassembly+factors.">alphaE-catenin actin-binding domain alters actin filament conformation and regulates binding of nucleation and disassembly factors.</a> Mol Biol Cell. 24 (23), 3710-3720 (2013).</li><li>Perrin, B. J., Ervasti, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+actin+gene+family:+function+follows+isoform.">The actin gene family: function follows isoform.</a> Cytoskeleton (Hoboken). 67 (10), 630-634 (2010).</li><li>Tondeleir, D., Vandamme, D., Vandekerckhove, J., Ampe, C., Lambrechts, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+isoform+expression+patterns+during+mammalian+development+and+in+pathology:+insights+from+mouse+models.">Actin isoform expression patterns during mammalian development and in pathology: insights from mouse models.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 66 (10), 798-815 (2009).</li><li>Prochniewicz, E., Janson, N., Thomas, D. D., Dela Cruz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cofilin+increases+the+torsional+flexibility+and+dynamics+of+actin+filaments.">Cofilin increases the torsional flexibility and dynamics of actin filaments.</a> J Mol Biol. 353 (5), 990-1000 (2005).</li><li>Kuhn, J. R., Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+measurements+of+actin+filament+polymerization+by+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy.">Real-time measurements of actin filament polymerization by total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Biophys J. 88 (2), 1387-1402 (2005).</li><li>Hansen, S. D., Zuchero, J. B., Mullins, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+actin:+purification+and+single+molecule+assembly+assays.">Cytoplasmic actin: purification and single molecule assembly assays.</a> Methods Mol Biol. 1046, 145-170 (2013).</li></ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

O ensaio de co-sedimentação de actina é uma técnica direta que pode determinar rapidamente se uma proteína se liga à F-actina. Com algumas modificações, a técnica também pode ser usada para medir a afinidade da interação. Além dos pontos levantados no protocolo acima, as questões a seguir devem ser consideradas ao projetar, conduzir e interpretar o ensaio. Proteína de Interesse Pode utilizar-se uma proteína recentemente preparada ou congelada no ensaio. Se for utilizada proteína congelada, recomenda-se que os resultados sejam comparados com proteínas frescas (nunca congeladas) para assegurar que o congelamento não afecte a ligação da F-actina. G-actina Fonte Muitas experiï¿½cias de granulaï¿½o utilizam G-actina isolada do mï¿½culo devido ï¿½sua abundï¿½cia relativa. Existem três principais isotipos de actina em mamíferos - alfa, beta e gama - que são notavelmente semelhantes (&gt; 90%Ty). No entanto, existem diferenças funcionais entre os isotipos 12 , 13 . Se possível, o isotipo G-actina utilizado no ensaio de ligação deve corresponder ao isotipo in vivo . Por exemplo, se testar uma proteína expressa no músculo esquelético, alfa-actina é a melhor escolha; Se examinar uma proteína expressa em fibroblastos, beta-actina é recomendada. Uso de Phalloidin Uma vez que a faloidina se liga à F-actina, pode interferir ou mesmo bloquear a ligação de algumas proteínas de ligação a F-actina ( por exemplo, a faloidina bloqueia a cofilina da ligação a filamentos de actina) 14 . Assim, phalloidin deve ser usado com cautela e os resultados em comparação com não-phalloidin-tratados amostras quando possível. Fundo alto Não é raro que as proteínas se sedimentem na ausência de F-actina ( Figura 1A , nenhuma amostra de peletes de F-actinaS). No entanto, níveis elevados de sedimentação de fundo podem mascarar a verdadeira co-sedimentação de actina e tornar difícil, se não impossível, determinar se uma proteína se liga à F-actina ou medir a afinidade da interação. Adicionar polidicanol ao tampão de reacção (passo 4.1) pode reduzir significativamente o fundo e é uma solução fácil. Se isso não reduzir o fundo, o ajuste do tampão de reação, da concentração de sal e / ou da temperatura de incubação pode ajudar. Curva de encadernação Para gerar uma curva de ligação, é necessário variar a concentração quer da proteína de interesse quer da F-actina através de uma série de reacções. Na prática, é mais fácil e preferível manter F-actina numa concentração fixa e variar a concentração da proteína de interesse. A manutenção da F-actina numa concentração fixa ( por exemplo, 2 μM) no ensaio de peletização limita a captura não específica em concentrações mais elevadas de F-actina e impedeDepolimerização a concentrações mais baixas (&lt;0,5 μM) de F-actina. A despolimerização pode ser prevenida usando phalloidin, embora isto introduza um fator de complicação potencial no sistema (veja o passo 3.3 e acima). A manutenção da F-actina numa concentração fixa também permite comparar (e normalizar) a pastilha de actina F entre amostras e identificar experiências falhadas ( isto é, onde a pastilha de actina F é altamente variável, impedindo a análise entre concentrações). Finalmente, manter F-actina numa concentração fixa permite determinar se a ligação ao filamento de actina é cooperativa ( Figura 1C ). Ligação saturada Tal como em todas as experiências de ligação, é crítico que a ligação à F-actina esteja saturada e que a concentração de proteína mais platinas de F-actina ( Figura 1C ). Sem um platô, não é possível calcular uma constante de equilíbrio de dissociação precisa. Assim,É importante planejar cuidadosamente a série de diluição a ser testada e sempre incluir concentrações mais altas de proteína ( ou seja, pelo menos 5- a 10 vezes maior do que o esperado K d ). Análise de ligação Para que as constantes de dissociação medidas sejam conclusivas, o ensaio deve ser realizado utilizando uma concentração de actina F que permita que a concentração dos locais de ligação na actina F para a proteína de interesse seja muito mais baixa do que a afinidade. Para verificar se este critério foi atingido, estimar a concentração de locais de ligação de B max . Por exemplo, se [F-actina] fosse 2 μM e Bmax = 0,5, então [locais de ligação] ≈ 1 μM. O Kd deve ser pelo menos 5- a 10 vezes maior do que [locais de ligação]. Se o Kd medido é da mesma ordem de grandeza que [locais de ligação], então é possível que a curva de ligação observada represente uma titulação de ligação de alta afinidade siEm vez de uma verdadeira isoterma de ligação. Se isto for observado, repetir o ensaio usando uma concentração de F-actina 10 vezes menor para medir uma afinidade precisa. Para interações de alta afinidade, a estabilização da faloidina (etapa 3.3) pode ser necessária para se obter uma concentração de F-actina suficientemente baixa para medir com precisão a afinidade. Finalmente, existem limitações fundamentais com o ensaio de co-sedimentação que os pesquisadores devem estar cientes de quando realizar e avaliar o ensaio. Mais importante ainda, o ensaio de co-sedimentação não produz uma verdadeira constante de equilíbrio. Os produtos de ligação ( isto é, proteína mais F-actina) são separados dos reagentes durante a centrifugação, após o que os produtos podem então dissociar-se para criar um novo equilíbrio. Como resultado, o ensaio de co-sedimentação pode calcular mal ou não detectar interacções de baixa afinidade. Uma vez que muitas proteínas de ligação à actina têm uma afinidade baixa ( isto é, micromolar) para a actina F, um resultado negativo ( <eM&gt; isto é, nenhuma ligação detectável) no ensaio não significa necessariamente que uma proteína não se liga à F-actina. Como alternativa, os ensaios de ligação de filamento único com base em microscopia TIRF são mais sensíveis e mais precisos para determinar uma constante de dissociação (para revisões nesta técnica, ver referências 15 , 16 ). Apesar destas limitações, o ensaio de granulação está dentro dos meios da maioria dos investigadores e é uma ferramenta eficaz para determinar se uma proteína liga F-actina e para medir a afinidade da interacção.

A actina é uma proteína essencial do citoesqueleto que desempenha um papel crítico em múltiplos processos celulares, incluindo motilidade, contração, adesão e morfologia 1 . A actina existe em duas formas: actina globular monomérica (G-actina) e actina filamentosa polimerizada (F-actina). Dentro das células, a organização da F-actina é controlada por uma grande coleção de proteínas que regulam a nucleação, crescimento, reticulação e desmontagem dos filamentos de actina 2 , 3 , 4 . No entanto, como múltiplas proteínas de ligação de actina funcionam em conjunto para regular a organização da rede de actina ainda não está bem esclarecida. A medição das interações proteína-proteína é uma abordagem importante para entender como as proteínas exercem seus efeitos sobre o comportamento celular ao nível bioquímico. Muitos ensaios diferentes podem ser utilizados para detectar interacções entre proteínas purificadas.Abordagens comuns para proteínas solúveis incluem pull-downs, polarização de fluorescência, calorimetria de titulação isotérmica e ressonância de plasmão de superfície. É importante notar que todos estes ensaios requerem que as proteínas sejam solúveis e são, portanto, difíceis de adaptar para utilização com uma proteína polimérica, filamentosa tal como F-actina. Aqui, descrevemos uma técnica - a co-sedimentação de actina, ou granulação, ensaio - para determinar se uma proteína ou proteína domínio se liga F-actina e para medir a afinidade da interação. O ensaio de peletização de actina é uma técnica relativamente simples que não requer equipamento especializado, além de uma ultracentrífuga. Todos os reagentes podem ser feitos, assumindo conhecimentos de bioquímica básica, ou adquiridos. Uma vez estabelecida a ligação à F-actina, o ensaio pode ser utilizado para medir a afinidade aparente ( isto é, a constante de equilíbrio de dissociação) 5 . Além disso, uma vez estabelecida a afinidade, o ensaio de peletizaçãoÉ uma ferramenta útil para medir como alterações na proteína de interesse ( isto é , modificações pós-translacionais, mutações, ou ligação de ligando) afetam sua interação com F-actina 6 . A técnica tem limitações (ver a Discussão ) que o pesquisador deve estar ciente antes de tentar o ensaio.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="842">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Sorvall MTX 150 Micro-Ultracentrifuge</td>
			<td style="width:224px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">46960</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">S100-AT3 rotor</td>
			<td style="width:224px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">45585</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Ultracentrifuge tubes - 0.2 ml</td>
			<td style="width:224px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">45233</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Actin, rabbit skeletal muscle</td>
			<td style="width:224px;">Cytoskeleton</td>
			<td style="width:119px;">AKL99</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:224px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A8531</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Polidicanol (Thesit)&#160;</td>
			<td style="width:224px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">88315</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Phalloidin</td>
			<td style="width:224px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">P3457</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td style="width:224px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">R0862</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Adenosine triphosphate (ATP)</td>
			<td style="width:224px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A2383</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Imidazole</td>
			<td style="width:224px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">O3196</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td style="width:224px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP358</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Magnesium Chloride (MgCl2)</td>
			<td style="width:224px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">M33</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td style="width:224px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">P217</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Ethylene glycol-bis(&#946;-aminoethyl ether)-N,N,N&#39;,N&#39;-tetraacetic acid (EGTA)</td>
			<td style="width:224px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">3779</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Odyssey CLx Imaging System</td>
			<td style="width:224px;">LI-COR</td>
			<td style="width:119px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Coomassie Brilliant Blue R-250 Dye</td>
			<td style="width:224px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">20278</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Colloidal Blue Staining Kit</td>
			<td style="width:224px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">LC6025</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring protein binding to f-actin by co-sedimentation

A organização de actina filamentosa (F-actina) dentro das células é regulada por um grande número de proteínas de ligação à actina que controlam a nucleação, crescimento, reticulação e / ou desmontagem da actina. Este protocolo descreve uma técnica - a co-sedimentação de actina, ou sedimentação, ensaio - para determinar se uma proteína ou proteína domínio liga F-actina e medir a afinidade da interação ( isto é, a constante de equilíbrio de dissociação). Nesta técnica, uma proteína de interesse é primeiro incubada com F-actina em solução. Em seguida, utiliza-se a centrifugação diferencial para sedimentar os filamentos de actina, e o material peletizado é analisado por SDS-PAGE. Se a proteína de interesse se liga à F-actina, co-sedimentará com os filamentos de actina. Os produtos da reacção de ligação ( isto é, F-actina e a proteína de interesse) podem ser quantificados para determinar a afinidade da interacção. O ensaio de peletização de actina é uma técnica simples para determinarSe uma proteína de interesse se liga a F-actina e para avaliar como as alterações a essa proteína, tais como a ligação do ligando, afectam a sua interacção com F-actina.

Examinámos a ligação do homodímero de αE-catenina à actina F no ensaio de co-sedimentação. Uma vez que experiências anteriores demonstraram que a afinidade do homodímero de αE-catenina para a actina F é de cerca de 1 μM e do B max próximo de 11 , realizámos o ensaio com uma concentração baixa de actina F (0,2 μM em vez de 2 μM; a discussão). Uma vez que 0,2 μM está abaixo da concentração crítica, a faloidina foi adicionada para estabilizar a F-actina polimerizada a partir da G-actina de músculo esquelético de coelho (passo 3.3). Incubaram-se concentrações crescentes de homodímero de cE-catenina (0,125-12,0 uM) na presença ou na ausência de actina F 0,2 uM. As amostras foram centrifugadas, e as pastilhas resultantes foram analisadas ( Figura 1A ). Conforme esperado, o homodímero de αE-catenina co-sedimentado com F-actina acima do fundo ( Figura 1A , compara as amostras de pastilhas de F-actina com o não-F-acAmostras de pellet de estanho). A BSA foi executada como um controlo negativo ( Figura 1B ). A proteína ligada foi quantificada e plotada sobre proteína livre para calcular a afinidade da interacção ( Figura 1C ). Os dados traçados correspondem melhor a uma equação de Hill. O Kd calculado foi 2,9 μM, o Bmax foi 0,2, eo coeficiente de Hill (h) foi 4,8. Assim, o homodímero de αE-catenina liga F-actina cooperativamente com uma baixa afinidade micromolar, consistente com o trabalho anterior (um Kd de 2,9 μM contra ~ 1,0 μM) 11 . <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/55613/55613fig1.jpg" /> Figura 1: Ensaio de co-sedimentação de F-actina de alta velocidade. ( A ) Concentrações crescentes (0,125-12,0 μM) de homodímero de αE-catenina foram incubadas com (painéis esquerdos) ou sem (painéis direitos) F-actina 0,2 μM estabilizada com phalloidiN. Incubaram-se durante 30 min à RT e centrifugaram-se. O total (7,5% do material de partida) e o material peletizado (50% do material peletizado) foram separados por SDS-PAGE e corados com corante de Coomassie. ( B ) 4 μM BSA foi executado como um controlo negativo. As amostras totais e em pellets, com (+) ou sem (-) F-actina, foram separadas por SDS-PAGE e coradas com corante de Coomassie. ( C ) Ligou-se αE-catenina (μM / μM de actina) a partir de A contra cE-catenina livre (μM), e os dados encaixam-se numa equação de Hill (linha vermelha). Os coeficientes Kd, Bmax e Hill (h) estão listados. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55613/55613fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/55613/55613fig2.jpg" /> Figura 2: Quantificação de peletização de actina </sTrong&gt; - fluxograma. Este esquema descreve as etapas chave na seção 5, com exemplos de amostras de Total e Pellet ( A , CE ) e a curva padrão ( B ) usada para quantificação. 5.13 etapas: 1 ) Medir a quantidade de proteína de interesse nas amostras totais (A). 2 ) Gerar uma curva padrão, traçando a intensidade da banda versus a massa da proteína (B). 3 ) Meça a quantidade de proteína de interesse co-sedimentada com F-actina ( C ). 4 ) Meça a quantidade de proteína de interesse que sedimentou na ausência de F-actina ( D ). 5 ) Subtrair D de C para determinar a quantidade de proteína ligada a F-actina. 6 ) Medir a quantidade de F-actina em cada pellet (E), calcular a quantidade média de F-actina por amostra e dividir cada amostra pela média (os números abaixo mostram a razão). 7 )Para cada amostra, divida-se a quantidade de proteína ligada (calculada no passo 5) pela razão de peletes de F-actina (calculada no passo 6) para ajustar as diferenças no grânulo. 8 ) Utilizar a curva padrão ( B ) para calcular a quantidade (massa) de proteína ligada normalizada em cada amostra (passo 7). 9 ) Determine a concentração de proteína livre e proteína ligada para criar uma curva de ligação. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55613/55613fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Measuring Protein Binding to F-actin by Co-sedimentation

Este protocolo descreve um método para testar a capacidade de uma proteína co-sedimentar com actina filamentosa (F-actina) e, se for observada ligação, para medir a afinidade da interacção.

Medir a ligação da proteína à actina F por co-sedimentação

Filamentous actin (F-actin) organization within cells is regulated by a large number of actin-binding proteins that control actin nucleation, growth, ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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Bioquímica

In Vitro Polymerization of F-actin on Early Endosomes

In Vitro Polymerization of F-actin on Early Endosomes

In Vitro Polimerização de F-Actina no início endossomos

Many early endosome functions, particularly cargo protein sorting and membrane deformation, depend on patches of short F-actin filaments nucleated onto ...

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Deteção de fosforilação Rab10 pela atividade LRRK2 utilizando SDS-PAGE com um Tag de ligação de fosfato

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Microgravimetry dissipativo para estudar a dinâmica da vinculação do fosfolipídeo proteína anexina A2 para Bilayers do Lipid com suporte sólido usando um ressonador de quartzo

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