Name: measuring protein binding to f-actin by co-sedimentation
Uploaded: 2017-05-18T12:30:00
Duration: 6 min 17 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Protein Binding to F-actin by Co-sedimentation at JoVE.com

Эта работа была поддержана Национальным институтом здравоохранения Грант HL127711 AVK.

<ol>
	<li>Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+and+Actin-Binding+Proteins.">Actin and Actin-Binding Proteins.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 8 (8), (2016).</li><li>Hansen, M. D., Kwiatkowski, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+actin+dynamics+by+allosteric+regulation+of+actin+binding+proteins.">Control of actin dynamics by allosteric regulation of actin binding proteins.</a> Int Rev Cell Mol Biol. 303, 1-25 (2013).</li><li>Lappalainen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin-binding+proteins:+the+long+road+to+understanding+the+dynamic+landscape+of+cellular+actin+networks.">Actin-binding proteins: the long road to understanding the dynamic landscape of cellular actin networks.</a> Mol Biol Cell. 27 (16), 2519-2522 (2016).</li><li>Mullins, R. D., Hansen, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+studies+of+actin+filament+and+network+dynamics.">In vitro studies of actin filament and network dynamics.</a> Curr Opin Cell Biol. 25 (1), 6-13 (2013).</li><li>Miller, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Danio+rerio+alphaE-catenin+is+a+monomeric+F-actin+binding+protein+with+distinct+properties+from+Mus+musculus+alphaE-catenin.">Danio rerio alphaE-catenin is a monomeric F-actin binding protein with distinct properties from Mus musculus alphaE-catenin.</a> J Biol Chem. 288 (31), 22324-22332 (2013).</li><li>Wickline, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=alphaT-Catenin+Is+a+Constitutive+Actin-binding+alpha-Catenin+That+Directly+Couples+the+Cadherin.Catenin+Complex+to+Actin+Filaments.">alphaT-Catenin Is a Constitutive Actin-binding alpha-Catenin That Directly Couples the Cadherin.Catenin Complex to Actin Filaments.</a> J Biol Chem. 291 (30), 15687-15699 (2016).</li><li>Simpson, R. J., Adams, P. D., Golemis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Basic methods in protein purification and analysis : a laboratory manual. , (2009).</li><li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4.">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li><li>Dyballa, N., Metzger, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+and+sensitive+colloidal+coomassie+G-250+staining+for+proteins+in+polyacrylamide+gels.">Fast and sensitive colloidal coomassie G-250 staining for proteins in polyacrylamide gels.</a> J Vis Exp. (30), (2009).</li><li>Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+simple+and+informative+binding+assays.">A guide to simple and informative binding assays.</a> Mol Biol Cell. 21 (23), 4061-4067 (2010).</li><li>Hansen, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=alphaE-catenin+actin-binding+domain+alters+actin+filament+conformation+and+regulates+binding+of+nucleation+and+disassembly+factors.">alphaE-catenin actin-binding domain alters actin filament conformation and regulates binding of nucleation and disassembly factors.</a> Mol Biol Cell. 24 (23), 3710-3720 (2013).</li><li>Perrin, B. J., Ervasti, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+actin+gene+family:+function+follows+isoform.">The actin gene family: function follows isoform.</a> Cytoskeleton (Hoboken). 67 (10), 630-634 (2010).</li><li>Tondeleir, D., Vandamme, D., Vandekerckhove, J., Ampe, C., Lambrechts, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+isoform+expression+patterns+during+mammalian+development+and+in+pathology:+insights+from+mouse+models.">Actin isoform expression patterns during mammalian development and in pathology: insights from mouse models.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 66 (10), 798-815 (2009).</li><li>Prochniewicz, E., Janson, N., Thomas, D. D., Dela Cruz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cofilin+increases+the+torsional+flexibility+and+dynamics+of+actin+filaments.">Cofilin increases the torsional flexibility and dynamics of actin filaments.</a> J Mol Biol. 353 (5), 990-1000 (2005).</li><li>Kuhn, J. R., Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+measurements+of+actin+filament+polymerization+by+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy.">Real-time measurements of actin filament polymerization by total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Biophys J. 88 (2), 1387-1402 (2005).</li><li>Hansen, S. D., Zuchero, J. B., Mullins, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+actin:+purification+and+single+molecule+assembly+assays.">Cytoplasmic actin: purification and single molecule assembly assays.</a> Methods Mol Biol. 1046, 145-170 (2013).</li></ol>

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Анализ соосаждения актина является прямым методом, который позволяет быстро определить, связывает ли белок F-актин. С некоторыми модификациями методику можно также использовать для измерения аффинности взаимодействия. Помимо вопросов, затронутых в вышеуказанном протоколе, при проектировании, проведении и интерпретации анализа следует учитывать следующие вопросы. Интересующий белок Свежеприготовленный или замороженный белок может быть использован в анализе. Если используется замороженный белок, рекомендуется сравнить результаты с новым (никогда не замороженным) белком, чтобы гарантировать, что замораживание не влияет на связывание F-актина. Источник G-actin Во многих экспериментах с гранулированием G-актин изолирован от мышцы из-за ее относительного содержания. Существуют три главных изотипа актина у млекопитающих - альфа, бета и гамма - которые удивительно похожи (&gt; 90% идентичности последовательностити). Тем не менее, существуют функциональные различия между изотипами 12 , 13 . Если возможно, изотип G-актина, используемый в анализе связывания, должен соответствовать изотипу in vivo . Например, при тестировании белка, выраженного в скелетных мышцах, альфа-актин является лучшим выбором; Если исследуется белок, экспрессируемый в фибробластах, рекомендуется использовать бета-актин. Использование Phalloidin Поскольку фаллоидин связывает F-актин, он может мешать или даже блокировать связывание некоторых F-актин-связывающих белков ( например, блокирование фактоидином кофилина от связывания с актиновыми филаментами) 14 . Таким образом, фаллоидин следует использовать с осторожностью и результаты по сравнению с образцами, обработанными нефаллоидином, когда это возможно. Высокий фон Нередко белки осаждаются в отсутствие F-актина ( рис. 1А , без образца F-актина в таблеткахс). Однако высокие уровни фонового осаждения могут маскировать истинное соосаждение актина и затруднять, если не невозможно, определение того, связывает ли белок F-актин или измеряет аффинность взаимодействия. Добавление полидиканола в реакционный буфер (шаг 4.1) может значительно уменьшить фон и является простым решением. Если это не уменьшает фона, то может помочь корректировка реакционного буфера, концентрации соли и / или температуры инкубации. Кривая привязки Для создания кривой связывания необходимо варьировать концентрацию либо представляющего интерес белка, либо F-актина в течение ряда реакций. На практике легче и предпочтительнее поддерживать F-актин в фиксированной концентрации и варьировать концентрацию интересующего белка. Поддержание F-актина при фиксированной концентрации ( например, 2 мкМ) в анализе гранулирования ограничивает неспецифическое улавливание при более высоких концентрациях F-актина и предотвращаетДеполимеризации при более низких (&lt;0,5 мкМ) концентрациях F-актина. Деполимеризацию можно предотвратить с помощью фаллоидина, хотя это вводит потенциальный усложняющий фактор в систему (см. Шаг 3.3 и выше). Поддержание F-актина при фиксированной концентрации также позволяет сравнить (и нормализовать) гранулу F-актина по образцам и идентифицировать неудавшиеся эксперименты ( т.е. где осадок F-актина сильно варьирует, предотвращая анализ по концентрациям). Наконец, поддержание F-актина при фиксированной концентрации позволяет определить, является ли связывание с актиновой нитью кооперативной ( рис. 1С ). Насыщенный переплет Как и во всех экспериментах на связывание, очень важно, чтобы связывание с F-актином было насыщенным и что концентрация белков плюс F-актиновые плато ( рис. 1C ). Без плато невозможно вычислить точную константу равновесия диссоциации. Таким образом, онВажно тщательно планировать анализируемую серию разбавлений и всегда включать более высокие концентрации белка ( т. Е. По крайней мере в 5-10 раз выше, чем ожидаемый K d ). Анализ связывания Для того, чтобы измеренные константы диссоциации были окончательными, анализ следует проводить с использованием концентрации F-актина, которая позволяет концентрации сайтов связывания на F-актине для представляющего интерес белка быть значительно ниже, чем сродство. Чтобы проверить, был ли соблюден этот критерий, оцените концентрацию сайтов связывания от B max . Например, если [F-actin] составляет 2 мкМ и B max = 0,5, то [сайты связывания] ≈ 1 мкМ. K d должен быть по крайней мере в 5-10 раз больше, чем [места связывания]. Если измеренный K d имеет тот же порядок величины, что и [участки связывания], то возможно, что наблюдаемая кривая связывания представляет собой титрование связывания с высоким сродством siСкорее, чем истинная изотерма связывания. Если это наблюдается, повторите анализ, используя концентрацию F-актина в 10 раз ниже, чтобы измерить точную аффинность. Для высокоаффинных взаимодействий стабилизация фаллоидина (шаг 3.3) может быть необходима для достижения концентрации F-актина, достаточно низкой для точного измерения сродства. Наконец, существуют фундаментальные ограничения в методе совместного осаждения, которые должны быть известны исследователям при выполнении и оценке анализа. Самое главное, что анализ соосаждения не дает истинной константы равновесия. Продукты связывания ( т.е. белок плюс F-актин) отделяют от реагентов во время центрифугирования, после чего продукты могут диссоциировать для создания нового равновесия. В результате анализ совместного осаждения может ошибочно вычислять или не обнаруживать взаимодействия с низкой аффинностью. Поскольку многие актин-связывающие белки имеют низкое ( т.е. микромолярное) сродство к F-актину, отрицательный результат ( <eM&gt; т.е. не обнаруживается связывание) в анализе необязательно означает, что белок не связывает F-актин. В качестве альтернативы, исследования на основе микроскопии на основе TIRF с одной нитью более чувствительны и более точны для определения константы диссоциации (для обзоров по этой методике см. Ссылки 15,16 ). Несмотря на эти ограничения, метод грануляции находится в пределах возможностей большинства исследователей и является эффективным инструментом для определения, связывает ли белок F-актин и измеряет сродство взаимодействия.

Афин является важным белком цитоскелета, который играет критическую роль в множественных клеточных процессах, включая подвижность, сокращение, адгезию и морфологию 1 . Актин существует в двух формах: мономерный глобулярный актин (G-actin) и полимеризованный нитчатый актин (F-актин). Внутри клеток F-актиновая организация контролируется большим набором белков, которые регулируют зарождение, рост, сшивание и разборку актиновых филаментов 2 , 3 , 4 . Однако, как несколько актин-связывающих белков функционируют согласованно, чтобы регулировать организацию сети актина, все еще в значительной степени неясно. Измерение белково-белковых взаимодействий является важным подходом для понимания того, как белки оказывают влияние на клеточное поведение на биохимическом уровне. Для определения взаимодействия между очищенными белками можно использовать множество различных анализов.Общие подходы к растворимым белкам включают в себя срывы, поляризацию флуоресценции, изотермическую титровальную калориметрию и поверхностный плазмонный резонанс. Важно отметить, что для всех этих анализов требуется, чтобы белки были растворимыми и, таким образом, их трудно адаптировать для использования с полимерным волокнистым белком, таким как F-актин. Здесь мы описываем методику - коэдиентацию актина или гранулирование - анализ, чтобы определить, связывает ли белковый или белковый домен F-актин и измеряет сродство взаимодействия. Актин гранулирующий анализ является относительно простой техникой, которая не требует специального оборудования, кроме ультрацентрифуги. Все реагенты могут быть изготовлены, исходя из знания базовой биохимии или приобретены. После установления связывания с F-актином анализ можно использовать для измерения кажущейся аффинности ( т.е. константы равновесия диссоциации) 5 . Кроме того, после установления сродства, гранулирующий анализЯвляется полезным инструментом для измерения того, как изменения интересующего белка ( т.е. пост-трансляционные модификации, мутации или связывание лигандов) влияют на его взаимодействие с F-актином 6 . Метод имеет ограничения (см. Обсуждение ), о которых исследователь должен знать перед попыткой анализа.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="842">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Sorvall MTX 150 Micro-Ultracentrifuge</td>
			<td style="width:224px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">46960</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">S100-AT3 rotor</td>
			<td style="width:224px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">45585</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Ultracentrifuge tubes - 0.2 ml</td>
			<td style="width:224px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">45233</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Actin, rabbit skeletal muscle</td>
			<td style="width:224px;">Cytoskeleton</td>
			<td style="width:119px;">AKL99</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:224px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A8531</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Polidicanol (Thesit)&#160;</td>
			<td style="width:224px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">88315</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Phalloidin</td>
			<td style="width:224px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">P3457</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td style="width:224px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">R0862</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Adenosine triphosphate (ATP)</td>
			<td style="width:224px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A2383</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Imidazole</td>
			<td style="width:224px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">O3196</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td style="width:224px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP358</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Magnesium Chloride (MgCl2)</td>
			<td style="width:224px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">M33</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td style="width:224px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">P217</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Ethylene glycol-bis(&#946;-aminoethyl ether)-N,N,N&#39;,N&#39;-tetraacetic acid (EGTA)</td>
			<td style="width:224px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">3779</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Odyssey CLx Imaging System</td>
			<td style="width:224px;">LI-COR</td>
			<td style="width:119px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Coomassie Brilliant Blue R-250 Dye</td>
			<td style="width:224px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">20278</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Colloidal Blue Staining Kit</td>
			<td style="width:224px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">LC6025</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring protein binding to f-actin by co-sedimentation

Организация нитчатого актина (F-actin) внутри клеток регулируется большим количеством актин-связывающих белков, которые контролируют зарождение актина, рост, сшивание и / или разборку. В этом протоколе описывается методика - совместное осаждение актина или гранулирование - определение того, связывает ли белковый или белковый домен F-актин и измеряет аффинность взаимодействия ( т.е. константу равновесия диссоциации). В этом методе интересующий белок сначала инкубируют с F-актином в растворе. Затем для осаждения актиновых филаментов используют дифференциальное центрифугирование, и осажденный материал анализируют с помощью SDS-PAGE. Если интересующий белок связывается с F-актином, он будет осаждаться вместе с актиновыми филаментами. Продукты реакции связывания ( т.е. F-актин и представляющий интерес белок) могут быть количественно определены для определения аффинности взаимодействия. Актин гранулирующий анализ является прямым методом определенияЕсли интересующий белок связывает F-актин и для оценки того, как изменения этого белка, такие как связывание лиганда, влияют на его взаимодействие с F-актином.

Мы исследовали связывание гомодимера αE-катенина с F-актином в анализе ко-седиментации. Поскольку в прошлых экспериментах было показано, что сродство гомодимера αE-катенина для F-актина составляет около 1 мкМ, а B max около 11 , мы провели анализ с низкой концентрацией F-актина (0,2 мкМ, а не 2 мкМ, см. Дискуссия). Поскольку 0,2 мкМ ниже критической концентрации, для стабилизации F-актина, полимеризованного из G-актина скелетной мышцы кролика (шаг 3.3), добавляют фаллоидин. Увеличение концентрации гомодимера αE-катенина (0,125-12,0 мкМ) инкубировали в присутствии или в отсутствие 0,2 мкМ F-актина. Образцы центрифугировали и полученные гранулы анализировали ( фиг.1А ). Как и ожидалось, гомодимер αE-catenin, осажденный с F-актином выше фона ( рисунок 1A , сравните образцы гранул F-актина с no-F-acОбразцы олова). BSA был запущен как отрицательный контроль ( Рисунок 1B ). Связанный белок определяли количественно и наносили на график над свободным белком для расчета аффинности взаимодействия ( фиг.1С ). Построенные данные лучше всего соответствуют уравнению Хилла. Рассчитанный K d составлял 2,9 мкМ, B max - 0,2, а коэффициент Хилла (h) - 4,8. Таким образом, гомодимер αE-катенина связывает F-актин совместно с низкой микромолярной аффинностью, что согласуется с предыдущей работой (K d 2,9 μM против ~ 1,0 μM) 11 . <img alt="Рисунок 1" src="/files/ftp_upload/55613/55613fig1.jpg" /> Рисунок 1: Высокоскоростное F-actin co-седиментационное исследование. ( A ) Увеличение концентрации (0,125-12,0 мкМ) гомодимера αE-катенина инкубировали с (левые панели) или без (правые панели) 0,2 мкМ F-актин, стабилизированный фаллоидип. Их инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре и центрифугировали. Общее количество (7,5% исходного материала) и гранулированный материал (50% гранулированного материала) разделяли электрофорезом в ДСН-ПААГ и окрашивали красителем Кумасси. ( B ) В качестве отрицательного контроля использовали 4 мкМ BSA. Всего и образцы гранул с (+) или без (-) F-актина разделяли электрофорезом в ДСН-ПААГ и окрашивали красителем Кумасси. ( C ) Связанный αE-catenin (мкМ / мкМ актин) от A был нанесен на график против свободного αE-catenin (μM), и данные соответствовали уравнению Хилла (красная линия). Указаны коэффициенты K d , B max и Hill (h). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55613/55613fig1large.jpg" target="_blank">Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a> <img alt="фигура 2" src="/files/ftp_upload/55613/55613fig2.jpg" /> Рисунок 2: количественная оценка гранулирования актина </sTrong&gt; - блок-схема. Эта схема описывает основные этапы в разделе 5 с примерами образцов Total и Pellet ( A , CE ) и стандартной кривой ( B ), используемой для количественной оценки. 5.13 этапов: 1 ) Измерьте количество белка, представляющего интерес, в Всего образцов (A). 2 ) Создать стандартную кривую путем построения зависимости интенсивности полосы от массы белка (В). 3 ) Измерьте количество представляющего интерес белка, который был осажден с F-актином ( C ). 4 ) Измерьте количество представляющего интерес белка, который осаждали в отсутствие F-актина ( D ). 5 ) Вычтите D из C, чтобы определить количество белка, связанного с F-актином. 6 ) Измерьте количество F-актина в каждой таблетке (E), вычислите среднее количество F-актина на образец и разделите каждую пробу на среднее значение (числа ниже показывают отношение). 7 )Для каждого образца разделить количество связанного белка (рассчитанного на этапе 5) с отношением гранул F-актина (рассчитанное на этапе 6), чтобы скорректировать различия в осадке. 8 ) Используйте стандартную кривую ( B ) для расчета количества (массы) нормированного связанного белка в каждом образце (шаг 7). 9 ) Определите концентрацию свободного белка и связанного белка для создания кривой связывания. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55613/55613fig2large.jpg" target="_blank">Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Protein Binding to F-actin by Co-sedimentation at JoVE.com

Measuring Protein Binding to F-actin by Co-sedimentation

Этот протокол описывает метод для проверки способности белка к совместному осаждению с нитчатым актином (F-actin) и, если связывание наблюдается, для измерения аффинности взаимодействия.

Измерение связывания белка с F-актином путем совместного осаждения

Filamentous actin (F-actin) organization within cells is regulated by a large number of actin-binding proteins that control actin nucleation, growth, ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Measuring G-protein-coupled Receptor Signaling via Radio-labeled GTP Binding

Измерение сигнальной связи рецептора с G-белком с помощью радиомаркированного связывания GTP

G-Protein-Coupled Receptors (GPCRs) are a large family of transmembrane receptors that play critical roles in normal cellular physiology and constitute a ...

In Vitro Polymerization of F-actin on Early Endosomes

In Vitro Polymerization of F-actin on Early Endosomes

В пробирке Полимеризация F-актина на ранних Endosomes

Many early endosome functions, particularly cargo protein sorting and membrane deformation, depend on patches of short F-actin filaments nucleated onto ...

Assay for Phosphorylation and Microtubule Binding Along with Localization of Tau Protein in Colorectal Cancer Cells

Assay для фосфорилирования и привязки микротрубочек наряду с локализацией тау белка в клетках рака прямой кишки

The microtubule-associated protein tau is a neuronal protein that localizes mostly in axons. Generally tau is essential for normal neuronal functioning ...

Measuring Biomolecular DSC Profiles with Thermolabile Ligands to Rapidly Characterize Folding and Binding Interactions

Измерения биомолекулярных DSC профили с термолабильных лигандами быстро характеризовать складывания и привязки взаимодействия

Differential scanning calorimetry (DSC) is a powerful technique for quantifying thermodynamic parameters governing biomolecular folding and binding ...

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

Биохимических и структурных характеристик углеводный транспорта субстрата белок-SP0092

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Rab10 Phosphorylation Detection by LRRK2 Activity Using SDS-PAGE with a Phosphate-binding Tag

Обнаружение Rab10 фосфорилирования LRRK2 деятельностью с помощью SDS-страницы с тегом фосфат привязки

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of ...

Measuring Trans-Plasma Membrane Electron Transport by C2C12 Myotubes

Измерения транс плазмы мембраны переноса электронов, C2C12 Myotubes

Trans-plasma membrane electron transport (tPMET) plays a role in protection of cells from intracellular reductive stress as well as protection from damage ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Диссипативных Microgravimetry для изучения динамики привязки фосфолипидного связывая протеин Annexin A2 в твердой поддержке липидов бислоев с помощью кварцевого резонатора

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Measuring and Interpreting Oxygen Consumption Rates in Whole Fly Head Segments

Измерение и интерпретации показателей потребления кислорода в целом летать головы сегментов

Regulated metabolic activity is essential for the normal functioning of living cells. Indeed, altered metabolic activity is causally linked with the ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Высокая чувствительность измерение транскрипции фактор ДНК привязки родство по конкурентоспособным титрования, с помощью микроскопии флуоресцирования

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...