Name: measuring protein binding to f-actin by co-sedimentation
Uploaded: 2017-05-18T12:30:00
Duration: 6 min 17 s
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Este trabajo fue apoyado por el National Institutes of Health Grant HL127711 a AVK.

<ol>
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Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

El ensayo de co-sedimentación de actina es una técnica sencilla que puede determinar rápidamente si una proteína se une a la F-actina. Con algunas modificaciones, la técnica también puede usarse para medir la afinidad de la interacción. Además de los puntos planteados en el protocolo anterior, los siguientes aspectos deben ser considerados al diseñar, conducir e interpretar el ensayo. Proteína de Interés En el ensayo se puede usar proteína recién preparada o congelada. Si se usa proteína congelada, se recomienda que los resultados se comparen con proteínas frescas (nunca congeladas) para asegurar que la congelación no afecta a la unión de F-actina. G-actina Fuente Muchos experimentos de granulación utilizan G-actina aislada del músculo debido a su abundancia relativa. Hay tres principales isotipos de actina en mamíferos - alfa, beta y gamma - que son notablemente similares (&gt; 90% de la secuencia identiTy). No obstante, existen diferencias funcionales entre los isotipos 12 , 13 . Si es posible, el isotipo G-actina usado en el ensayo de unión debe coincidir con el isotipo in vivo . Por ejemplo, si se prueba una proteína expresada en el músculo esquelético, la alfa-actina es la mejor opción; Si se examina una proteína expresada en fibroblastos, se recomienda la beta-actina. Uso de Phalloidin Dado que la faloidina se une a la actina F, puede interferir o incluso bloquear la unión de algunas proteínas de unión a la actina F ( p. Ej., La faloidina bloquea la cofilina de la unión a los filamentos de actina) 14 . Por lo tanto, la faloidina debe utilizarse con precaución y los resultados en comparación con las muestras no tratados con faloidina cuando sea posible. Fondo alto No es infrecuente que las proteínas sedimenten en ausencia de actina F ( Figura 1A , ninguna muestra de pellet de F-actinaS). Sin embargo, altos niveles de sedimentación de fondo pueden enmascarar la verdadera co-sedimentación de actina y dificultar, si no imposible, determinar si una proteína se une a F-actina o para medir la afinidad de la interacción. La adición de polidicanol al tampón de reacción (paso 4.1) puede reducir significativamente el fondo y es una solución fácil. Si esto no reduce el fondo, el ajuste del tampón de reacción, la concentración de sal y / o la temperatura de incubación pueden ayudar. Curva de encuadernación Para generar una curva de unión, es necesario variar la concentración de la proteína de interés o de la F-actina sobre una serie de reacciones. En la práctica, es más fácil y preferible mantener F-actina a una concentración fija y variar la concentración de la proteína de interés. El mantenimiento de la actina F a una concentración fija ( por ejemplo, 2 μM) en el ensayo de granulación limita la captura no específica a concentraciones más altas de actina F y previeneDespolimerización a concentraciones menores (&lt;0,5 μM) de F-actina. La despolimerización puede evitarse utilizando la faloidina, aunque esto introduce un factor de complicación potencial en el sistema (ver paso 3.3 y anteriores). El mantenimiento de la actina F a una concentración fija también permite comparar (y normalizar) el sedimento de actina F entre muestras e identificar experimentos fallidos ( es decir, donde el sedimento de actina F es altamente variable, evitando el análisis a través de las concentraciones). Por último, el mantenimiento de la actina F a una concentración fija permite determinar si la unión al filamento de actina es cooperativa ( Figura 1C ). Unión saturada Como en todos los experimentos de unión, es crítico que la unión a F-actina esté saturada y que la concentración de proteína más platinas de F-actina ( Figura 1C ). Sin una meseta, no es posible calcular una constante de equilibrio de disociación precisa. Por lo tanto,Es importante planificar cuidadosamente la serie de dilución a ensayar e incluir siempre concentraciones más altas de proteína ( es decir, por lo menos 5- a 10 veces mayor que la Kd esperada). Análisis de encuadernación Para que las constantes de disociación medidas sean concluyentes, el ensayo debe realizarse usando una concentración de actina F que permita que la concentración de sitios de unión en la actina F para la proteína de interés sea mucho menor que la afinidad. Para comprobar si este criterio se cumplió, estimar la concentración de sitios de unión de B max . Por ejemplo, si [F-actina] era 2 μM y Bmax = 0,5, entonces [sitios de unión] ≈ 1 μM. El Kd debe ser al menos 5- a 10 veces mayor que [sitios de unión]. Si el Kd medido es del mismo orden de magnitud que [sitios de unión], entonces es posible que la curva de unión observada represente una titulación de unión de alta afinidad siMás que una verdadera isoterma vinculante. Si esto se observa, repetir el ensayo utilizando una concentración de actina F 10 veces menor para medir una afinidad precisa. Para las interacciones de alta afinidad, la estabilización de la faloidina (etapa 3.3) puede ser necesaria para lograr una concentración de actina F lo suficientemente baja como para medir con precisión la afinidad. Finalmente, existen limitaciones fundamentales con el ensayo de co-sedimentación que los investigadores deben tener en cuenta al realizar y evaluar el ensayo. Más importante aún, el ensayo de co-sedimentación no produce una constante de equilibrio real. Los productos de unión ( es decir, proteína más F-actina) se separan de los reactivos durante la centrifugación, después de lo cual los productos pueden disociarse para crear un nuevo equilibrio. Como resultado, el ensayo de co-sedimentación puede calcular erróneamente o no detectar interacciones de baja afinidad. Puesto que muchas proteínas de unión a actina tienen una afinidad baja ( es decir, micromolar) para la actina F, un resultado negativo <eM&gt; es decir, ninguna unión detectable) en el ensayo no significa necesariamente que una proteína no se une a F-actina. Como alternativa, los ensayos de unión a un solo filamento basados ​​en microscopía TIRF son más sensibles y más precisos para determinar una constante de disociación (para revisiones sobre esta técnica, véanse las referencias 15 , 16 ). A pesar de estas limitaciones, el ensayo de granulación está dentro de los medios de la mayoría de los investigadores y es una herramienta eficaz para determinar si una proteína se une a la actina F y para medir la afinidad de la interacción.

La actina es una proteína esencial del citoesqueleto que desempeña un papel crítico en múltiples procesos celulares, incluyendo la motilidad, la contracción, la adhesión y la morfología 1 . La actina existe en dos formas: la actina globular monomérica (G-actina) y la actina filamentosa polimerizada (F-actina). Dentro de las células, F-actina organización está controlada por una gran colección de proteínas que regulan la nucleación, el crecimiento, reticulación y desmontaje de actina filamentos 2 , 3 , 4 . Sin embargo, la forma en múltiples actina vinculante proteínas funcionan en concierto para regular la actina red de organización sigue siendo en gran parte poco clara. La medición de las interacciones proteína-proteína es un enfoque importante para entender cómo las proteínas ejercen sus efectos sobre el comportamiento celular a nivel bioquímico. Se pueden usar muchos ensayos diferentes para detectar interacciones entre proteínas purificadas.Los enfoques comunes para las proteínas solubles incluyen pull-downs, polarización de fluorescencia, calorimetría de titulación isotérmica y resonancia de plasmón superficial. Es importante destacar que todos estos ensayos requieren que las proteínas sean solubles y, por lo tanto, son difíciles de adaptar para su uso con una proteína polimérica filamentosa tal como actina F. Aquí, describimos una técnica - la co-sedimentación de actina, o granulación, ensayo - para determinar si una proteína o dominio de proteínas se une a la actina F y para medir la afinidad de la interacción. El ensayo de granulación de actina es una técnica relativamente sencilla que no requiere equipo especializado, aparte de una ultracentrífuga. Todos los reactivos se pueden hacer, asumiendo el conocimiento de la bioquímica básica, o comprado. Una vez establecida la unión a F-actina, el ensayo puede usarse para medir la afinidad aparente ( es decir, la constante de equilibrio de disociación) 5 . Además, una vez que se establece una afinidad, el ensayo de granulaciónEs una herramienta útil para medir cómo los cambios en la proteína de interés ( es decir , las modificaciones post-traduccionales, mutaciones, ligando o ligando) afectan a su interacción con F-actina [ 6] . La técnica tiene limitaciones (vea la Discusión ) que el investigador debe tener en cuenta antes de intentar el ensayo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="842">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Sorvall MTX 150 Micro-Ultracentrifuge</td>
			<td style="width:224px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">46960</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">S100-AT3 rotor</td>
			<td style="width:224px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">45585</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Ultracentrifuge tubes - 0.2 ml</td>
			<td style="width:224px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">45233</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Actin, rabbit skeletal muscle</td>
			<td style="width:224px;">Cytoskeleton</td>
			<td style="width:119px;">AKL99</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:224px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A8531</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Polidicanol (Thesit)&#160;</td>
			<td style="width:224px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">88315</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Phalloidin</td>
			<td style="width:224px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">P3457</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td style="width:224px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">R0862</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Adenosine triphosphate (ATP)</td>
			<td style="width:224px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A2383</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Imidazole</td>
			<td style="width:224px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">O3196</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td style="width:224px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP358</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Magnesium Chloride (MgCl2)</td>
			<td style="width:224px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">M33</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td style="width:224px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">P217</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Ethylene glycol-bis(&#946;-aminoethyl ether)-N,N,N&#39;,N&#39;-tetraacetic acid (EGTA)</td>
			<td style="width:224px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">3779</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Odyssey CLx Imaging System</td>
			<td style="width:224px;">LI-COR</td>
			<td style="width:119px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Coomassie Brilliant Blue R-250 Dye</td>
			<td style="width:224px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">20278</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Colloidal Blue Staining Kit</td>
			<td style="width:224px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">LC6025</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring protein binding to f-actin by co-sedimentation

La organización de actina filamentosa (F-actina) dentro de las células está regulada por un gran número de proteínas de unión a actina que controlan la nucleación, crecimiento, reticulación y / o desmontaje de actina. Este protocolo describe una técnica - la co-sedimentación de actina, o granulación, ensayo - para determinar si un dominio de proteína o proteína se une a F-actina y para medir la afinidad de la interacción ( es decir, la constante de equilibrio de disociación). En esta técnica, una proteína de interés se incuba primero con F-actina en solución. A continuación, se utiliza la centrifugación diferencial para sedimentar los filamentos de actina, y el material en forma de gránulo se analiza por SDS-PAGE. Si la proteína de interés se une a la actina F, se co-sedimentará con los filamentos de actina. Los productos de la reacción de unión ( es decir, F-actina y la proteína de interés) se pueden cuantificar para determinar la afinidad de la interacción. El ensayo de granulación de actina es una técnica sencilla para determinarSi una proteína de interés se une a la actina F y para evaluar cómo los cambios en esa proteína, como la unión al ligando, afectan su interacción con la F-actina.

Se examinó αE-catenina homodímero vinculante a F-actina en el co-sedimentación ensayo. Dado que los experimentos anteriores han demostrado que la afinidad del homodímero αE-catenina para la actina F es alrededor de 1 μM y el Bmax cerca de 11 , se realizó el ensayo con una concentración baja de actina F (0,2 μM en lugar de 2 μM; La discusión). Puesto que 0,2 μM está por debajo de la concentración crítica, se añadió faloidina para estabilizar la F-actina polimerizada a partir de G-actina de músculo esquelético de conejo (etapa 3.3). Se incubaron concentraciones crecientes de homodímero αE-catenina (0,125-12,0 μM) en presencia o ausencia de actina F 0,2 μM. Las muestras fueron centrifugadas, y los pellets resultantes se analizaron ( Figura 1A ]. Como era de esperar, el homodímero αE-catenina co-sedimentado con F-actina por encima del fondo ( Figura 1A , compara las muestras de pellet de F-actina con el no-F-acMuestras de pellets de hojalata). BSA se ejecutó como un control negativo ( Figura 1B ]. La proteína unida se cuantificó y se trazó sobre proteína libre para calcular la afinidad de la interacción ( Figura 1C ). Los datos trazados se ajustan mejor a una ecuación Hill. El Kd calculado fue de 2,9 mu M, el Bmax fue de 0,2 y el coeficiente de Hill (h) fue de 4,8. Por tanto, el homodímero αE-catenina se une a la actina F cooperativamente con una afinidad micromolar baja, consistente con el trabajo previo (un Kd de 2,9 μM frente a 1,0 μM) 11 . <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55613/55613fig1.jpg" /> Figura 1: Ensayo de co-sedimentación de F-actina de alta velocidad. ( A ) Se incubaron concentraciones crecientes (0,125-12,0 mu M) de homodímero de alpha - catenina con (paneles de la izquierda) o sin (paneles de la derecha) 0,2 mu M de actina F estabilizada con phalloidinorte. Se incubaron durante 30 min a TA y se centrifugaron. El total (7,5% del material de partida) y el material granulado (50% del material en forma de gránulo) se separaron por SDS-PAGE y se tiñeron con colorante Coomassie. ( B ) 4 μ M BSA se ejecutó como un control negativo. Las muestras totales y de pellets, con (+) o sin (-) F-actina, se separaron por SDS-PAGE y se tiñeron con colorante de Coomassie. ( C ) La α-catenina unida (μM / μM de actina) de A se representó contra la α-catenina libre (μM) y los datos se ajustaron a una ecuación de Hill (línea roja). Se enumeran los coeficientes Kd, Bmax y Hill (h). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55613/55613fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/55613/55613fig2.jpg" /> Figura 2: Cuantificación de la peletización con actina </sTrong&gt; - diagrama de flujo. Este esquema describe los pasos clave en la sección 5, con ejemplos de muestras de Total y Pellet ( A , CE ) y la curva estándar ( B ) utilizada para la cuantificación. 5.13 pasos: 1 ) Medir la cantidad de proteína de interés en las muestras totales (A). 2 ) Genere una curva estándar trazando la intensidad de banda frente a la masa de proteína (B). 3 ) Medir la cantidad de proteína de interés que co-sedimentado con F-actina ( C ). 4 ) Mida la cantidad de proteína de interés que sedimentó en ausencia de F-actina ( D ). 5 ) Sustraiga D de C para determinar la cantidad de proteína unida a F-actina. 6 ) Mida la cantidad de F-actina en cada pellet (E), calcule la cantidad promedio de F-actina por muestra y divida cada muestra por el promedio (los números abajo muestran la relación). 7 )Para cada muestra, divida la cantidad de proteína unida (calculada en el paso 5) por la proporción de gránulos de actina F (calculada en el paso 6) para ajustar las diferencias en el gránulo. 8 ) Utilice la curva estándar ( B ) para calcular la cantidad (masa) de proteína unida normalizada en cada muestra (paso 7). 9 ) Determine la concentración de proteína libre y proteína unida para crear una curva de unión. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55613/55613fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Measuring Protein Binding to F-actin by Co-sedimentation

Este protocolo describe un método para probar la capacidad de una proteína para co-sedimentar con actina filamentosa (F-actina) y, si se observa unión, para medir la afinidad de la interacción.

Medición de la unión de proteínas a actina F por co-sedimentación

Filamentous actin (F-actin) organization within cells is regulated by a large number of actin-binding proteins that control actin nucleation, growth, ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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Investigación

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