Name: measuring protein binding to f-actin by co-sedimentation
Uploaded: 2017-05-18T12:30:00
Duration: 6 min 17 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Protein Binding to F-actin by Co-sedimentation at JoVE.com

Detta arbete stöddes av National Institutes of Health Grant HL127711 till AVK.

<ol>
	<li>Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+and+Actin-Binding+Proteins.">Actin and Actin-Binding Proteins.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 8 (8), (2016).</li><li>Hansen, M. D., Kwiatkowski, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+actin+dynamics+by+allosteric+regulation+of+actin+binding+proteins.">Control of actin dynamics by allosteric regulation of actin binding proteins.</a> Int Rev Cell Mol Biol. 303, 1-25 (2013).</li><li>Lappalainen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin-binding+proteins:+the+long+road+to+understanding+the+dynamic+landscape+of+cellular+actin+networks.">Actin-binding proteins: the long road to understanding the dynamic landscape of cellular actin networks.</a> Mol Biol Cell. 27 (16), 2519-2522 (2016).</li><li>Mullins, R. D., Hansen, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+studies+of+actin+filament+and+network+dynamics.">In vitro studies of actin filament and network dynamics.</a> Curr Opin Cell Biol. 25 (1), 6-13 (2013).</li><li>Miller, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Danio+rerio+alphaE-catenin+is+a+monomeric+F-actin+binding+protein+with+distinct+properties+from+Mus+musculus+alphaE-catenin.">Danio rerio alphaE-catenin is a monomeric F-actin binding protein with distinct properties from Mus musculus alphaE-catenin.</a> J Biol Chem. 288 (31), 22324-22332 (2013).</li><li>Wickline, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=alphaT-Catenin+Is+a+Constitutive+Actin-binding+alpha-Catenin+That+Directly+Couples+the+Cadherin.Catenin+Complex+to+Actin+Filaments.">alphaT-Catenin Is a Constitutive Actin-binding alpha-Catenin That Directly Couples the Cadherin.Catenin Complex to Actin Filaments.</a> J Biol Chem. 291 (30), 15687-15699 (2016).</li><li>Simpson, R. J., Adams, P. D., Golemis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Basic methods in protein purification and analysis : a laboratory manual. , (2009).</li><li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4.">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li><li>Dyballa, N., Metzger, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+and+sensitive+colloidal+coomassie+G-250+staining+for+proteins+in+polyacrylamide+gels.">Fast and sensitive colloidal coomassie G-250 staining for proteins in polyacrylamide gels.</a> J Vis Exp. (30), (2009).</li><li>Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+simple+and+informative+binding+assays.">A guide to simple and informative binding assays.</a> Mol Biol Cell. 21 (23), 4061-4067 (2010).</li><li>Hansen, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=alphaE-catenin+actin-binding+domain+alters+actin+filament+conformation+and+regulates+binding+of+nucleation+and+disassembly+factors.">alphaE-catenin actin-binding domain alters actin filament conformation and regulates binding of nucleation and disassembly factors.</a> Mol Biol Cell. 24 (23), 3710-3720 (2013).</li><li>Perrin, B. J., Ervasti, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+actin+gene+family:+function+follows+isoform.">The actin gene family: function follows isoform.</a> Cytoskeleton (Hoboken). 67 (10), 630-634 (2010).</li><li>Tondeleir, D., Vandamme, D., Vandekerckhove, J., Ampe, C., Lambrechts, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+isoform+expression+patterns+during+mammalian+development+and+in+pathology:+insights+from+mouse+models.">Actin isoform expression patterns during mammalian development and in pathology: insights from mouse models.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 66 (10), 798-815 (2009).</li><li>Prochniewicz, E., Janson, N., Thomas, D. D., Dela Cruz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cofilin+increases+the+torsional+flexibility+and+dynamics+of+actin+filaments.">Cofilin increases the torsional flexibility and dynamics of actin filaments.</a> J Mol Biol. 353 (5), 990-1000 (2005).</li><li>Kuhn, J. R., Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+measurements+of+actin+filament+polymerization+by+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy.">Real-time measurements of actin filament polymerization by total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Biophys J. 88 (2), 1387-1402 (2005).</li><li>Hansen, S. D., Zuchero, J. B., Mullins, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+actin:+purification+and+single+molecule+assembly+assays.">Cytoplasmic actin: purification and single molecule assembly assays.</a> Methods Mol Biol. 1046, 145-170 (2013).</li></ol>

Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.

Aktinsam-sedimentationsanalysen är en enkel teknik som snabbt kan avgöra om ett protein binder F-aktin. Med vissa modifieringar kan tekniken även användas för att mäta samverkans affinitet. Förutom punkter som uppkommer i protokollet ovan bör följande frågor beaktas vid utformning, genomförande och tolkning av analysen. Protein av intresse Färskberedt eller fruset protein kan användas i analysen. Om fruset protein används, rekommenderas det starkt att resultaten jämförs med friskt (aldrig fruset) protein för att säkerställa att frysning inte påverkar F-aktinbindning. G-actin Källa Många pelleteringsexperiment använder G-aktin isolerat från muskel på grund av dess relativa överflöd. Det finns tre huvudaktinisotyper i däggdjur - alfa, beta och gamma - som är anmärkningsvärt lika (&gt; 90% sekvensidentifieringty). Ändå finns funktionella skillnader mellan isotyperna 12 , 13 . Om möjligt bör den G-aktinisotyp som används i bindningsanalysen matcha in vivo- isotypen. Om t ex ett protein uttryckt i skelettmuskler är alfa-aktin det bästa valet. Om man undersöker ett protein uttryckt i fibroblaster rekommenderas beta-aktin. Phalloidin användning Eftersom phalloidin binder F-aktin, kan det störa eller till och med blockera bindningen av vissa F-aktinbindande proteiner ( t ex phalloidinblock cofilin från bindning till aktinfilament) 14 . Således bör phalloidin användas med försiktighet och resultaten jämförs med icke-falloidinbehandlade prover när det är möjligt. Hög bakgrund Det är inte ovanligt för proteiner att sediment i frånvaro av F-aktin ( Figur 1A , inget F-aktinpelletsprovs). Höga nivåer av bakgrunds sedimentering kan emellertid maskera sannaktinsam-sedimentering och göra det svårt, om inte omöjligt, att bestämma om ett protein binder F-aktin eller för att mäta interaktionens affinitet. Att tillsätta polidicanol till reaktionsbufferten (steg 4.1) kan avsevärt minska bakgrunden och är en enkel lösning. Om det inte minskar bakgrunden kan justering av reaktionsbufferten, saltkoncentrationen och / eller inkubationstemperaturen hjälpa. Bindningskurva För att generera en bindningskurva är det nödvändigt att variera koncentrationen av antingen protein av intresse eller F-aktin över en serie reaktioner. I praktiken är det lättare och föredraget att bibehålla F-aktin vid en fast koncentration och att variera koncentrationen av proteinet av intresse. Underhåll av F-aktin vid en fast koncentration ( t.ex. 2 μM) i pelleteringsanalysen begränsar ospecifik fångst vid högre koncentrationer av F-aktin och förhindrarDepolymerisation vid lägre (&lt;0,5 ^ M) koncentrationer av F-aktin. Depolymerisation kan förebyggas med användning av phalloidin, även om detta introducerar en potentiell komplicerande faktor i systemet (se steg 3.3 och senare). Underhåll av F-aktin vid en bestämd koncentration gör det också möjligt att jämföra (och normalisera) F-aktinpelleten över prover och identifiera misslyckade experiment ( dvs. där F-aktinpelleten är mycket variabel, vilket förhindrar analys över koncentrationer). Slutligen tillåter upprätthållande av F-aktin vid en fast koncentration att man bestämmer om bindningen till aktinfilamentet är kooperativ ( Figur 1C ). Mättad bindning Liksom i alla bindande experiment är det kritiskt att bindningen till F-aktin är mättad och att koncentrationen av protein plus F-aktinplattor ( Figur 1C ). Utan en platå är det inte möjligt att beräkna en exakt dissociationsjämviktskonstant. SåledesDet är viktigt att noggrant planera utspädningsserien som ska testas och att alltid inkludera högre proteinkoncentrationer ( dvs minst 5-10 gånger högre än den förväntade K d ). Bindningsanalys För att de uppmätta dissociationskonstanterna ska vara avgörande bör analysen utföras med användning av en F-aktinkoncentration som tillåter koncentrationen av bindningsställen på F-aktin för proteinet av intresse att vara mycket lägre än affiniteten. För att kontrollera om detta kriterium var uppfyllt, uppskatta koncentrationen av bindningsställen från B max . Om exempelvis [F-aktin] var 2 | im och Bmax = 0,5, så [bindningsställen] ≈ 1 | im. Kd bör vara minst 5-10 gånger större än [bindningsställen]. Om den uppmätta Kd är av samma storleksordning som [bindningsställen], är det möjligt att den observerade bindningskurvan representerar en titrering av högaffinitetsbindande siTes snarare än en sann bindande isoterm. Om detta observeras, upprepa analysen med en 10-faldig lägre F-aktinkoncentration för att mäta en exakt affinitet. För interaktioner med hög affinitet kan phalloidin-stabilisering (steg 3.3) vara nödvändigt för att uppnå en F-aktinkoncentration som är tillräckligt låg för att noggrant mäta affinitet. Slutligen finns det grundläggande begränsningar med den sedimenteringsanalys som forskarna bör vara medvetna om när de utför och utvärderar analysen. Viktigast av allt producerar samsedimenteringsanalysen inte en sann jämviktskonstant. Produkterna av bindning ( dvs protein plus F-aktin) separeras från reaktanterna under centrifugering, varpå produkterna sedan kan dissociera för att skapa en ny jämvikt. Som ett resultat kan samsedimenteringsanalysen felaktigt beräkna eller misslyckas att detektera interaktioner med låg affinitet. Eftersom många aktinbindande proteiner har en låg ( dvs mikromolär) affinitet för F-aktin, är ett negativt resultat ( <eM&gt; dvs ingen detekterbar bindning) i analysen betyder inte nödvändigtvis att ett protein inte binder F-aktin. Som ett alternativ är TIRF-mikroskopibaserade, enkelfilamentbindande analyser känsligare och mer exakta för bestämning av en dissociationskonstant (för recensioner på denna teknik, se referenser 15, 16 ). Trots dessa begränsningar ligger pelleteringsanalysen inom de flesta forskares hjälp och är ett effektivt verktyg för att bestämma om ett protein binder F-aktin och att mäta interaktionens affinitet.

Actin är ett essentiellt cytoskeletalt protein som spelar en viktig roll i flera cellulära processer, inklusive motilitet, sammandragning, vidhäftning och morfologi 1 . Actin finns i två former: monomer globulärt aktin (G-aktin) och polymeriserat filamentöst aktin (F-aktin). Inom celler styrs F-aktinorganisationen av en stor samling proteiner som reglerar kärnbildning, tillväxt, tvärbindning och demontering av aktinfilament 2 , 3 , 4 . Men hur flera aktinbindande proteiner fungerar i samverkan för att reglera aktinätverksorganisationen är fortfarande i stor utsträckning oklart. Mätningen av protein-protein-interaktioner är ett viktigt tillvägagångssätt för att förstå hur proteiner påverkar cellulärt beteende på den biokemiska nivån. Många olika analyser kan användas för att detektera interaktioner mellan renade proteiner.Vanliga metoder för lösliga proteiner innefattar neddragningar, fluorescenspolarisation, isotermisk titreringskalorimetri och ytplasmonresonans. Viktigt är att alla dessa analyser kräver att proteiner är lösliga och är sålunda svåra att anpassa för användning med ett polymert, trådformigt protein såsom F-aktin. Här beskriver vi en teknik - aktinsammansättning, eller pelletering, analys - för att bestämma om ett protein eller proteinområde binder F-aktin och för att mäta interaktionens affinitet. Actinpelleteringsanalysen är en relativt enkel teknik som inte kräver specialutrustning, förutom en ultracentrifug. Alla reagenser kan göras, förutsatt kunskap om grundläggande biokemi eller inköp. När bindning till F-aktin är etablerad kan analysen användas för att mäta den uppenbara affiniteten ( dvs dissociationsjämviktskonstanten) 5 . Även när en affinitet är etablerad, är pelleteringsanalysenÄr ett användbart verktyg för att mäta hur förändringar i proteinet av intresse ( dvs. posttranslationella modifieringar, mutationer eller ligandbindning) påverkar dess interaktion med F-aktin 6 . Tekniken har begränsningar (se diskussionen ) som forskaren bör vara medveten om innan försöket görs.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="842">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Sorvall MTX 150 Micro-Ultracentrifuge</td>
			<td style="width:224px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">46960</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">S100-AT3 rotor</td>
			<td style="width:224px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">45585</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Ultracentrifuge tubes - 0.2 ml</td>
			<td style="width:224px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">45233</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Actin, rabbit skeletal muscle</td>
			<td style="width:224px;">Cytoskeleton</td>
			<td style="width:119px;">AKL99</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:224px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A8531</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Polidicanol (Thesit)&#160;</td>
			<td style="width:224px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">88315</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Phalloidin</td>
			<td style="width:224px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">P3457</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td style="width:224px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">R0862</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Adenosine triphosphate (ATP)</td>
			<td style="width:224px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A2383</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Imidazole</td>
			<td style="width:224px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">O3196</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td style="width:224px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP358</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Magnesium Chloride (MgCl2)</td>
			<td style="width:224px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">M33</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td style="width:224px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">P217</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Ethylene glycol-bis(&#946;-aminoethyl ether)-N,N,N&#39;,N&#39;-tetraacetic acid (EGTA)</td>
			<td style="width:224px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">3779</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Odyssey CLx Imaging System</td>
			<td style="width:224px;">LI-COR</td>
			<td style="width:119px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Coomassie Brilliant Blue R-250 Dye</td>
			<td style="width:224px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">20278</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Colloidal Blue Staining Kit</td>
			<td style="width:224px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">LC6025</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring protein binding to f-actin by co-sedimentation

Filamentous actin (F-aktin) organisationen inom celler regleras av ett stort antal aktinbindande proteiner som kontrollerar aktin-kärnbildning, tillväxt, tvärbindning och / eller demontering. Detta protokoll beskriver en teknik - aktinsammansättning, eller pelletering, analys - för att bestämma huruvida ett protein eller en proteindomän binder F-aktin och för att mäta interaktionens affinitet ( dvs dissociationsjämviktskonstanten). I denna teknik inkuberas ett protein av intresse först med F-aktin i lösning. Därefter användes differentialcentrifugering för att sedimentera aktinfilamenten, och det pelleterade materialet analyseras med SDS-PAGE. Om proteinet av intresse binder F-aktin kommer det att sedimentera med aktinfilamenten. Produkterna av bindningsreaktionen ( dvs F-aktin och proteinet av intresse) kan kvantifieras för bestämning av interaktionens affinitet. Actinpelleteringsanalysen är en enkel teknik för bestämningOm ett protein av intresse binder F-aktin och för att bedöma hur förändringar i det proteinet, såsom ligandbindning, påverkar dess interaktion med F-aktin.

Vi undersökte aE-katenin-homodimerbindning till F-aktin i sam-sedimenteringsassayen. Eftersom tidigare experiment har visat att affiniteten för aE-katenin-homodimer för F-aktin är omkring 1 ^ M och Bmax nära 1 11 , utförde vi analysen med en låg koncentration av F-aktin (0,2 ^ M i stället för 2 ^ M, se diskussionen). Eftersom 0,2 | im ligger under den kritiska koncentrationen tillsattes phalloidin för att stabilisera F-aktin polymeriserad från kaninskelettmuskel G-aktin (steg 3.3). Ökande koncentrationer av aE-katenin-homodimer (0,125-12,0 ^ M) inkuberades i närvaro eller frånvaro av 0,2 ^ M F-aktin. Proven centrifugerades och de resulterande pelletsna analyserades ( Figur 1A ). Som förväntat jämförde aE-katenin-homodimeren sam-sedimenterad med F-aktin ovanför bakgrunden ( Figur 1A , jämför F-aktinpelletsproverna till nej-F-acTennpelletsprover). BSA kördes som en negativ kontroll ( Figur 1B ). Bundet protein kvantifierades och plottades över fritt protein för att beräkna affiniteten för interaktionen ( Figur 1C ). De plottade data passar bäst i en Hill-ekvation. Den beräknade Kd var 2,9 uM, B max var 0,2 och Hill-koefficienten (h) var 4,8. Således binder aE-katenin-homodimer F-aktin kooperativt med en låg mikromolär affinitet, som överensstämmer med tidigare arbete (en Kd på 2,9 μM kontra ~ 1,0 μM) 11 . <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/55613/55613fig1.jpg" /> Figur 1: Höghastighets-F-aktinsam-sedimenteringsanalys. ( A ) Ökande koncentrationer (0,125-12,0 uM) av aE-katenin-homodimer inkuberades med (vänstra paneler) eller utan (högra paneler) 0,2 | im F-aktin stabiliserat med falloidin. De inkuberades i 30 minuter vid RT och centrifugerades. Totalvärdet (7,5% av utgångsmaterialet) och pelleterat material (50% av det pelleterade materialet) separerades genom SDS-PAGE och färgades med Coomassie-färgämne. ( B ) 4 ^ M BSA kördes som en negativ kontroll. Totalt och pelletprover med (+) eller utan (-) F-aktin separerades med SDS-PAGE och färgades med Coomassie-färgämne. ( C ) Bundet αE-katenin (μM / μM aktin) från A plottades mot fri αE-katenin (μM) och data passar till en Hill-ekvation (röd linje). Kd-, Bmax- och Hill-koefficienten (h) anges. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55613/55613fig1large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/55613/55613fig2.jpg" /> Figur 2: Actinpelleterings kvantifiering </sTrong&gt; - flödesdiagram. Denna schema visar viktiga steg i avsnitt 5, med exempel på totalt och pelletprover ( A , CE ) och standardkurvan ( B ) som används för kvantifiering. 5.13 steg: 1 ) Mäta mängden protein av intresse i de totala proverna (A). 2 ) Generera en standardkurva genom att plotta bandintensiteten mot proteinmassan (B). 3 ) Mäta mängden protein av intresse som co-sedimenteras med F-aktin ( C ). 4 ) Mäta mängden protein av intresse som pelleteras i frånvaro av F-aktin ( D ). 5 ) Subtrahera D från C för att bestämma mängden protein bunden till F-aktin. 6 ) Mäta mängden F-aktin i varje pellet (E), beräkna medelvärdet av F-aktin per prov och dela varje prov med medelvärdet (siffrorna nedan visar förhållandet). 7 )För varje prov dela mängden bunden protein (beräknad i steg 5) med F-aktinpelletsförhållandet (beräknat i steg 6) för att justera för skillnader i pelleten. 8 ) Använd standardkurvan ( B ) för att beräkna mängden (massa) normaliserat bunden protein i varje prov (steg 7). 9 ) Bestäm koncentrationen av fritt protein och bunden protein för att skapa en bindningskurva. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55613/55613fig2large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Protein Binding to F-actin by Co-sedimentation at JoVE.com

Measuring Protein Binding to F-actin by Co-sedimentation

Detta protokoll beskriver en metod för att testa förmågan hos ett protein att sedimentera med filamentöst aktin (F-aktin) och, om bindning observeras, för att mäta interaktionens affinitet.

Mätning av proteinbindning till F-aktin genom sam-sedimentering

Filamentous actin (F-actin) organization within cells is regulated by a large number of actin-binding proteins that control actin nucleation, growth, ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Measuring G-protein-coupled Receptor Signaling via Radio-labeled GTP Binding

Mätning av G-proteinkopplad receptorreceptor via radiomärkt GTP-bindning

G-Protein-Coupled Receptors (GPCRs) are a large family of transmembrane receptors that play critical roles in normal cellular physiology and constitute a ...

In Vitro Polymerization of F-actin on Early Endosomes

In Vitro Polymerization of F-actin on Early Endosomes

In Vitro Polymerisation av F-aktin på tidig Endosomes

Many early endosome functions, particularly cargo protein sorting and membrane deformation, depend on patches of short F-actin filaments nucleated onto ...

Assay for Phosphorylation and Microtubule Binding Along with Localization of Tau Protein in Colorectal Cancer Cells

Analys för fosforylering och mikrotubuli bindande tillsammans med lokalisering av Tau-Protein i kolorektal cancerceller

The microtubule-associated protein tau is a neuronal protein that localizes mostly in axons. Generally tau is essential for normal neuronal functioning ...

Measuring Biomolecular DSC Profiles with Thermolabile Ligands to Rapidly Characterize Folding and Binding Interactions

Mäta Biomolekylär DSC profiler med termolabila ligander till snabbt karakterisera vikning och bindande interaktioner

Differential scanning calorimetry (DSC) is a powerful technique for quantifying thermodynamic parameters governing biomolecular folding and binding ...

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

Biokemiska och strukturell karaktärisering av den kolhydrat Transport substrat-bindande-protein SP0092

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Rab10 Phosphorylation Detection by LRRK2 Activity Using SDS-PAGE with a Phosphate-binding Tag

Rab10 fosforylering detektion av LRRK2 aktivitet med SDS-PAGE med en fosfat-bindande tagg

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of ...

Measuring Trans-Plasma Membrane Electron Transport by C2C12 Myotubes

Mäta Trans-Plasma membran elektrontransport av C2C12 Myotubes

Trans-plasma membrane electron transport (tPMET) plays a role in protection of cells from intracellular reductive stress as well as protection from damage ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Dissipativa Microgravimetry att studera bindande dynamiken i den fosfolipid bindande proteinet Annexin A2 till Solid-stödda Lipid lipidmonolager med en kvarts Resonator

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Measuring and Interpreting Oxygen Consumption Rates in Whole Fly Head Segments

Mäta och tolka syre förbrukning helt flyga Head segment

Regulated metabolic activity is essential for the normal functioning of living cells. Indeed, altered metabolic activity is causally linked with the ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Hög känslighet mätning av transkription faktorn-DNA bindande samhörighet genom konkurrenskraftiga titrering med fluorescensmikroskopi

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...