Name: measuring protein binding to f-actin by co-sedimentation
Uploaded: 2017-05-18T12:30:00
Duration: 6 min 17 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Protein Binding to F-actin by Co-sedimentation at JoVE.com

Bu çalışma Ulusal Sağlık Grant Enstitüleri tarafından AVK&#39;ya HL127711 tarafından desteklenmiştir.

<ol>
	<li>Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+and+Actin-Binding+Proteins.">Actin and Actin-Binding Proteins.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 8 (8), (2016).</li><li>Hansen, M. D., Kwiatkowski, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+actin+dynamics+by+allosteric+regulation+of+actin+binding+proteins.">Control of actin dynamics by allosteric regulation of actin binding proteins.</a> Int Rev Cell Mol Biol. 303, 1-25 (2013).</li><li>Lappalainen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin-binding+proteins:+the+long+road+to+understanding+the+dynamic+landscape+of+cellular+actin+networks.">Actin-binding proteins: the long road to understanding the dynamic landscape of cellular actin networks.</a> Mol Biol Cell. 27 (16), 2519-2522 (2016).</li><li>Mullins, R. D., Hansen, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+studies+of+actin+filament+and+network+dynamics.">In vitro studies of actin filament and network dynamics.</a> Curr Opin Cell Biol. 25 (1), 6-13 (2013).</li><li>Miller, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Danio+rerio+alphaE-catenin+is+a+monomeric+F-actin+binding+protein+with+distinct+properties+from+Mus+musculus+alphaE-catenin.">Danio rerio alphaE-catenin is a monomeric F-actin binding protein with distinct properties from Mus musculus alphaE-catenin.</a> J Biol Chem. 288 (31), 22324-22332 (2013).</li><li>Wickline, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=alphaT-Catenin+Is+a+Constitutive+Actin-binding+alpha-Catenin+That+Directly+Couples+the+Cadherin.Catenin+Complex+to+Actin+Filaments.">alphaT-Catenin Is a Constitutive Actin-binding alpha-Catenin That Directly Couples the Cadherin.Catenin Complex to Actin Filaments.</a> J Biol Chem. 291 (30), 15687-15699 (2016).</li><li>Simpson, R. J., Adams, P. D., Golemis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Basic methods in protein purification and analysis : a laboratory manual. , (2009).</li><li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4.">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li><li>Dyballa, N., Metzger, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+and+sensitive+colloidal+coomassie+G-250+staining+for+proteins+in+polyacrylamide+gels.">Fast and sensitive colloidal coomassie G-250 staining for proteins in polyacrylamide gels.</a> J Vis Exp. (30), (2009).</li><li>Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+simple+and+informative+binding+assays.">A guide to simple and informative binding assays.</a> Mol Biol Cell. 21 (23), 4061-4067 (2010).</li><li>Hansen, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=alphaE-catenin+actin-binding+domain+alters+actin+filament+conformation+and+regulates+binding+of+nucleation+and+disassembly+factors.">alphaE-catenin actin-binding domain alters actin filament conformation and regulates binding of nucleation and disassembly factors.</a> Mol Biol Cell. 24 (23), 3710-3720 (2013).</li><li>Perrin, B. J., Ervasti, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+actin+gene+family:+function+follows+isoform.">The actin gene family: function follows isoform.</a> Cytoskeleton (Hoboken). 67 (10), 630-634 (2010).</li><li>Tondeleir, D., Vandamme, D., Vandekerckhove, J., Ampe, C., Lambrechts, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+isoform+expression+patterns+during+mammalian+development+and+in+pathology:+insights+from+mouse+models.">Actin isoform expression patterns during mammalian development and in pathology: insights from mouse models.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 66 (10), 798-815 (2009).</li><li>Prochniewicz, E., Janson, N., Thomas, D. D., Dela Cruz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cofilin+increases+the+torsional+flexibility+and+dynamics+of+actin+filaments.">Cofilin increases the torsional flexibility and dynamics of actin filaments.</a> J Mol Biol. 353 (5), 990-1000 (2005).</li><li>Kuhn, J. R., Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+measurements+of+actin+filament+polymerization+by+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy.">Real-time measurements of actin filament polymerization by total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Biophys J. 88 (2), 1387-1402 (2005).</li><li>Hansen, S. D., Zuchero, J. B., Mullins, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+actin:+purification+and+single+molecule+assembly+assays.">Cytoplasmic actin: purification and single molecule assembly assays.</a> Methods Mol Biol. 1046, 145-170 (2013).</li></ol>

Yazarlar, rekabet eden mali çıkarlarının olmadığını beyan ettiler.

Aktin birlikte sedimantasyon tahlili, bir proteinin F-aktine bağlanıp bağlanmadığını çabucak belirleyebilen basit bir tekniktir. Bazı değişikliklerle teknik, etkileşimin afinitesini ölçmek için de kullanılabilir. Yukarıdaki protokolde ortaya konulan hususlara ek olarak, tahlil tasarlanırken, iletilirken ve yorumlanırken aşağıdaki hususlar dikkate alınmalıdır. İlgi Proteinleri Yeni hazırlanmış veya dondurulmuş protein testte kullanılabilir. Dondurulmuş protein kullanılıyorsa, dondurmanın F-aktin bağlanmasını etkilemediğinden emin olmak için sonuçların taze (asla donmamış) protein ile karşılaştırılması önemle tavsiye edilir. G-aktin Kaynağı Birçok peletleme deneyinde göreceli bolluk nedeniyle kasdan izole edilen G-aktin kullanılır. Memelilerde - alfa, beta ve gamma - üç ana aktin izotipi vardır ki bunlar dikkat çekici derecede birbirine benzemektedir (&gt;% 90 sekans tanımlamaty). Bununla birlikte, izotipler 12 , 13 arasında işlevsel farklılıklar vardır. Mümkünse, bağlanma tahlilinde kullanılan G-aktin izotipi in vivo izotipe uymalıdır. Örneğin iskelet kasında ifade edilen bir proteini test ederseniz alfa-aktin en iyi seçimdir; Fibroblastlarda eksprese edilen bir proteini incelemek için beta-aktin önerilir. Phalloidin Kullanımı Falloidin F-aktini bağladığından, bazı F-aktin bağlayıcı proteinlerin bağlanmasını ( örneğin, faloidin , cofilin bağlamadan aktin filamentlerine blokar) müdahale edebilir veya hatta engelleyebilir. Bu nedenle, phalloidin dikkatle kullanılmalı ve mümkün olduğunca phalloidin ile muamele edilmiş numunelerle karşılaştırılmalıdır. Yüksek Arka Plan Proteinlerin F-aktin yokluğunda tortulaşması nadir değildir ( Şekil 1A , hiçbir F-aktin pelet örneğis). Bununla birlikte, arka plan sedimentasyonunun yüksek seviyeleri, gerçek aktin çökelmesini maskeleyebilir ve imkansız olmasa da, bir proteinin F-aktini bağlayıp bağlamadığını veya etkileşimin afinitesini ölçmesini zorlaştırabilir. Polidicanol tepkime tamponuna ekleme (adım 4.1), arka planı önemli ölçüde azaltabilir ve kolay bir çözümdür. Bu, arka planı azaltmazsa, reaksiyon tamponu, tuz konsantrasyonu ve / veya inkübasyon sıcaklığı ayarlanması yardımcı olabilir. Bağlanma Eğrisi Bir bağlanma eğrisi üretmek için, bir dizi reaksiyon üzerinde ilgi protein veya F-aktinin konsantrasyonunu değiştirmek gereklidir. Pratikte F-aktini sabit bir konsantrasyonda tutmak ve ilgi protein konsantrasyonunu değiştirmek daha kolay ve tercih edilir. Peletleme deneyinde F-aktinin sabit konsantrasyonda ( örn., 2 uM) tutulması, daha yüksek konsantrasyonlarda F-aktin ile spesifik olmayan yakalama sayısını sınırlar veDüşük (&lt;0.5 uM) F-aktin konsantrasyonlarında depolimerizasyon. Depolimerizasyon, phalloidin kullanılarak önlenebilir, ancak bu, sisteme potansiyel bir komplike edici faktör getirir (bkz. Adım 3.3 ve üstü). F-aktini sabit bir konsantrasyonda muhafaza etmek, numuneler boyunca F-aktin peletini karşılaştırabilir (ve normalleştirir) ve başarısız deneyleri tanımlamayı sağlar ( yani, F-aktin peletinin çok değişken olduğu, konsantrasyonlarda analizi önlediği durumda). Son olarak, F-aktini sabit bir konsantrasyonda tutmak, birinin aktin filamanına bağlanmanın birlikte çalışıp çalışmadığını belirlemesine izin verir ( Şekil 1C ). Doymuş Bağlama Bütün bağlanma deneylerinde olduğu gibi, F-aktine bağlanmanın doymuş olması ve protein artı F-aktin platolarının konsantrasyonunun kritik olması önemlidir ( Şekil 1C ). Bir plato olmadan doğru bir ayrışma denge sabitinin hesaplanması mümkün değildir. Böylece,Test edilecek seyreltme serisini dikkatlice planlamak ve her zaman daha yüksek konsantrasyonlarda protein ( yani, beklenen Kd&#39;den en az 5-10 kat daha yüksek) içerdiği önemlidir. Bağ Analizi Ölçülen ayrışma sabitlerinin kesin olması için, analiz, ilgi proteinine yönelik olarak F-aktin üzerindeki bağlanma alanlarının konsantrasyonunun afiniteye göre daha düşük olmasına izin veren bir F-aktin konsantrasyonu kullanılarak gerçekleştirilmelidir. Bu kriterin karşılanıp karşılanmadığını kontrol etmek için bağlama alanlarının B max konsantrasyonunu hesaplayın. Örneğin, eğer [F-aktin] 2 mcM ve B max = 0.5 ise, o zaman [bağlanma bölgeleri] ≈ 1 uM&#39;dir. K d , [bağlanma yerlerinden] en az 5-10 kat daha büyük olmalıdır. Ölçülen Kd, [bağlanma alanları] ile aynı derecede ise, gözlemlenen bağlanma eğrisinin yüksek afiniteli bağlama titrini temsil etmesi mümkündürGerçek bir bağlayıcı izoterm yerine tes. Bu gözlemlenirse, doğru bir afinite ölçmek için tahlil 10 kat daha düşük bir F-aktin konsantrasyonu kullanılarak tekrarlayın. Yüksek afiniteli etkileşimler için afiniteyi doğru bir şekilde ölçmek için düşük bir F-aktin konsantrasyonu elde etmek için phalloidin stabilizasyonu (adım 3.3) gerekli olabilir. Son olarak, araştırmacıların testi yaparken ve değerlendirirken farkında olmaları gereken birlikte sedimantasyon tahlilinde temel sınırlamalar vardır. En önemlisi, birlikte sedimentasyon tahlili gerçek bir denge sabiti oluşturmaz. Bağlanma ürünleri ( yani, protein artı F-aktin), santrifüj işlemi sırasında reaktanlardan ayrılır ve daha sonra ürünler, yeni bir denge yaratmak için ayrışabilir. Sonuç olarak birlikte çöktürme deneyi, düşük afiniteli etkileşimleri yanlış hesaplayabilir veya algılayamaz. Birçok aktin bağlayıcı proteinin F-aktin için düşük bir ( yani, mikromolar) afiniteye sahip olması nedeniyle, negatif bir sonuçtur ( <eM&gt; yani herhangi bir tespit edilebilir bağlanma) bir proteinin F-aktini bağlamadığı anlamına gelmez. Alternatif olarak, TIRF mikroskopi tabanlı, tek filamentli bağlanma deneyleri, bir ayrışma sabitinin belirlenmesinde daha hassas ve daha doğrudur (bu tekniğe yönelik incelemeler için bkz. Referanslar 15,16 ). Bu kısıtlamalara rağmen, peletleme tahlili çoğu araştırmacı tarafından yapılmaktadır ve bir proteinin F-aktine bağlanıp bağlanmadığını belirlemek ve etkileşimin afinitesini ölçmek için etkili bir araçtır.

Aktin, motilite, kasılma, yapışma ve morfoloji gibi çok hücresel süreçlerde kritik bir rol oynayan temel bir sitoskeletal proteintir 1 . Aktin, iki biçimdedir: monomerik globüler aktin (G-aktin) ve polimerize filamentli aktin (F-aktin). Hücreler içinde F-aktin organizasyonu, aktin filamanlarının 2 , 3 , 4 nükleasyonunu, büyümesini, çapraz bağlanmasını ve sökülmesini düzenleyen geniş bir protein koleksiyonu tarafından kontrol edilir. Bununla birlikte, aktin ağı düzenlenmesini düzenleyen çoklu aktin-bağlayıcı proteinlerin nasıl işlediği hala net değildir. Protein-protein etkileşimlerinin ölçümü, proteinlerin hücresel davranış üzerine etkilerini biyokimyasal düzeyde nasıl uyguladığını anlamada önemli bir yaklaşımdır. Saflaştırılmış proteinler arasındaki etkileşimleri saptamak için birçok farklı tahlil kullanılabilir.Çözünür proteinler için yaygın yaklaşımlar pull-down&#39;lar, fluoresan polarizasyonu, izotermal titrasyon kalorimetresi ve yüzey plazmon rezonansıdır. Önemlisi, bu tahlillerin hepsi, proteinlerin çözünür olmasını gerektirir ve bu nedenle, F-aktin gibi bir polimerik, ipliksi protein ile kullanım için uyarlanmak zordur. Burada, bir protein veya protein alanının F-aktine bağlanıp bağlanmadığını belirlemek ve etkileşimin afinitesini ölçmek için bir teknik - aktin birlikte sedimentasyon veya topaklanma, tahlil tanımlıyoruz. Aktin peletleme tahlili, bir ultra-santrifüjün yanı sıra özel ekipman gerektirmeyen nispeten basit bir tekniktir. Tüm reaktifler, temel biyokimya bilgilerini varsayarak veya satın alınarak yapılabilir. F-aktin&#39;e bağlandıktan sonra, deney, görünür afiniteyi ( yani, ayrışma dengesi sabiti) ölçmek için kullanılabilir 5 . Ayrıca, bir kez bir afinite kurulduğunda, peletleme deneyi, Ilgi proteinindeki değişikliklerin ( yani , translasyon sonrası modifikasyonlar, mutasyonlar veya ligand bağlanması) F-aktin 6 ile olan etkileşimini nasıl etkilediğini ölçmek için yararlı bir araçtır. Tekniğin araştırmacının deneyi denemeden önce farkında olması gereken kısıtlamaları vardır (bkz. Tartışma ).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="842">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Sorvall MTX 150 Micro-Ultracentrifuge</td>
			<td style="width:224px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">46960</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">S100-AT3 rotor</td>
			<td style="width:224px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">45585</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Ultracentrifuge tubes - 0.2 ml</td>
			<td style="width:224px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">45233</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Actin, rabbit skeletal muscle</td>
			<td style="width:224px;">Cytoskeleton</td>
			<td style="width:119px;">AKL99</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:224px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A8531</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Polidicanol (Thesit)&#160;</td>
			<td style="width:224px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">88315</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Phalloidin</td>
			<td style="width:224px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">P3457</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td style="width:224px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">R0862</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Adenosine triphosphate (ATP)</td>
			<td style="width:224px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A2383</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Imidazole</td>
			<td style="width:224px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">O3196</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td style="width:224px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP358</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Magnesium Chloride (MgCl2)</td>
			<td style="width:224px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">M33</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td style="width:224px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">P217</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Ethylene glycol-bis(&#946;-aminoethyl ether)-N,N,N&#39;,N&#39;-tetraacetic acid (EGTA)</td>
			<td style="width:224px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">3779</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Odyssey CLx Imaging System</td>
			<td style="width:224px;">LI-COR</td>
			<td style="width:119px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Coomassie Brilliant Blue R-250 Dye</td>
			<td style="width:224px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">20278</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Colloidal Blue Staining Kit</td>
			<td style="width:224px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">LC6025</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring protein binding to f-actin by co-sedimentation

Hücrelerin içinde filamentli aktin (F-aktin) organizasyonu, aktin nükleasyonu, büyümesi, çapraz bağlanma ve / veya demontajı kontrol eden çok sayıdaki aktin bağlayıcı proteinler tarafından düzenlenir. Bu protokol, bir protein veya protein alanının F-aktin&#39;e bağlanıp bağlanmadığını belirlemek ve etkileşimin afinitesini ( yani, ayrışma dengesi sabiti) ölçmek için bir tekniği - aktin çöktürme veya topaklama testi - tanımlamaktadır. Bu teknikte, ilgilenilen bir protein önce çözeltide F-aktin ile inkübe edilir. Ardından, aktin filamanlarını tortulaştırmak için diferansiyel santrifüj kullanılmış ve topaklaştınlmış malzeme SDS-PAGE ile analiz edilmiştir. Eğer ilgilenilen protein F-aktini bağlarsa, aktin filamentleri ile birlikte çökecektir. Bağlanma tepkimesinin ( yani F-aktin ve ilgili protein) ürünleri etkileşimin afinitesini belirlemek için nicelleştirilebilir. Aktin peletleme tahlili, belirlenmesi için basit bir tekniktirEğer ilgilenilen bir protein F-aktini bağlar ve ligand bağlanması gibi o proteindeki değişiklikler F-aktin ile olan etkileşimini nasıl etkilediğini değerlendirir.

Ko-sedimantasyon deneyinde F-aktine karşı αE-katenin homodimer bağlanmasını inceledi. Geçmiş deneyler, F-aktin için αE-katenin homodimerinin afinitesi 1 uM civarında ve Bmax 1 11&#39;e yakın olduğu gösterdiğinden, düşük bir F-aktin konsantrasyonuyla (2 uM&#39;den ziyade 0.2 uM; tartışma). 0.2 uM kritik konsantrasyonun altında olduğu için, tavşan iskelet kasından G-aktin&#39;den polimerize edilmiş F-aktini stabilize etmek için phalloidin ilave edildi (basamak 3.3). Artan konsantrasyonlarda αE-catenin homodimeri (0.125-12.0 uM) 0.2 uM F-aktin varlığında veya yokluğunda inkübe edildi. Numuneler santrifüje tabi tutuldu ve elde edilen pelletler analiz edildi ( Şekil 1A ). Beklendiği gibi, αE-katenin homodimeri, arka planın üstünde F-aktin ile birlikte çökeltildi ( Şekil 1A , F-aktin pelet numunelerinin no-F-ac&#39;ye kıyaslaKalay pellet örnekleri). BSA, negatif bir kontrol olarak çalıştırıldı ( Şekil 1B ). Bağlanan protein nicelendirildi ve etkileşimin afinitesini hesaplamak için serbest protein üzerine çizildi ( Şekil 1C ). Planlanan veriler en iyi Hill denklemine uymaktadır. Hesaplanan K d 2.9 uM, Bmax 0.2 ve Hill katsayısı (h) 4.8 idi. Dolayısıyla, αE-catenin homodimeri F-aktini, önceki çalışmada (~ 1.0 uM&#39;ye karşı 2,9 μM&#39;nin bir Kd&#39;si) tutarlı, düşük bir mikromolar afinite ile birlikte bağlar 11 . <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/55613/55613fig1.jpg" /> Şekil 1: Yüksek hızlı F-aktin birlikte sedimentasyon testi. ( A ) Artan konsantrasyonlar (0.125-12.0 uM) αE-katenin homodimeri, sol panellerle veya sağ paneller olmadan (sağ paneller), phalloidi ile stabilize edilmiş 0.2 uM F-aktin ile kuluçkaya yatırıldın. Oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edildi ve santrifüj edildi. Toplam (başlangıç ​​maddesinin% 7.5&#39;i) ve pelet haline getirilmiş malzeme (pellet haline getirilmiş malzemenin% 50&#39;si) SDS-PAGE ile ayrılmış ve Coomassie boyasıyla lekelenmiştir. ( B ) 4 uM BSA negatif bir kontrol olarak çalıştırıldı. (+) Veya (-) F-aktin içeren toplam ve pellet örnekleri, SDS-PAGE ile ayrılmış ve Coomassie boyası ile boyanmıştır. ( C ) A&#39;dan bağlanan αE-katenin (μM / μM aktin) serbest αE-katenin (μM) karşısında çizildi ve veriler bir Hill denklemine (kırmızı çizgi) sığdı. K d , B max ve Hill katsayısı (h) listelenmiştir. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55613/55613fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/55613/55613fig2.jpg" /> Şekil 2: Aktin peletleme kantifikasyonu </sTrong&gt; - akış şeması. Bu şema, Toplam ve Pelet örnekleri ( A , CE ) ve kantifikasyon için kullanılan standart eğri ( B ) örnekleriyle, bölüm 5&#39;deki önemli adımları özetlemektedir. 5.13 adımlar: 1 ) Toplam örneklerde (A) ilgi protein miktarını ölçün. 2 ) Bant yoğunluğuna karşı protein kütlesi (B) çizerek standart bir eğri oluşturun. 3 ) F-aktin ( C ) ile çöktürülen ilgi protein miktarını ölçün. 4 ) F-aktin ( D ) yokluğunda peletlenen ilgi protein miktarını ölçün. 5 ) F proteinine bağlı protein miktarını belirlemek için C&#39;den D çıkarın. 6 ) Her bir topakta (E) F-aktinin miktarını ölçün, numune başına F-aktinin ortalama miktarını hesaplayın ve her bir örneği ortalama olarak bölün (aşağıdaki sayılar oranı gösterelim). 7 )Her numune için, pelet içindeki farklılıkları ayarlamak için bağlanmış proteinin miktarını (5. adımda hesaplanan) F-aktin pelet oranı ile bölün (6. adımda hesaplanmıştır). 8 ) Her bir numunede normalize edilmiş bağlanmış proteinin miktarını (kütle) hesaplamak için standart eğriyi ( B ) kullanın (basamak 7). 9 ) Bağlayıcı bir eğri yaratmak için serbest protein ve bağlanmış protein konsantrasyonunu belirleyin. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55613/55613fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Protein Binding to F-actin by Co-sedimentation at JoVE.com

Measuring Protein Binding to F-actin by Co-sedimentation

Bu protokol, bir proteinin filamentli aktinle (F-aktin) birlikte sedimentasyon yeteneğini test etmek için bir yöntem ve bağlanma gözlemlendiğinde etkileşimin afinitesini ölçmek için bir yöntem açıklamaktadır.

Ko-çöktürme yoluyla F-aktine Bağlı Proteinin Ölçülmesi

Filamentous actin (F-actin) organization within cells is regulated by a large number of actin-binding proteins that control actin nucleation, growth, ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Measuring G-protein-coupled Receptor Signaling via Radio-labeled GTP Binding

Radyo-etiketli GTP Bağlanması vasıtasıyla G-protein ile birleşmiş Reseptör Sinyalizasyonunun Ölçümü

G-Protein-Coupled Receptors (GPCRs) are a large family of transmembrane receptors that play critical roles in normal cellular physiology and constitute a ...

In Vitro Polymerization of F-actin on Early Endosomes

In Vitro Polymerization of F-actin on Early Endosomes

Vitro F-aktin üzerinde erken Endosomes polimerizasyon

Many early endosome functions, particularly cargo protein sorting and membrane deformation, depend on patches of short F-actin filaments nucleated onto ...

Assay for Phosphorylation and Microtubule Binding Along with Localization of Tau Protein in Colorectal Cancer Cells

Tahlil fosforilasyon ve yerelleştirme kolorektal kanser hücrelerinin Tau proteinin birlikte Mikrotubul bağlama için

The microtubule-associated protein tau is a neuronal protein that localizes mostly in axons. Generally tau is essential for normal neuronal functioning ...

Measuring Biomolecular DSC Profiles with Thermolabile Ligands to Rapidly Characterize Folding and Binding Interactions

Biyomoleküler DSC profilleri ile hızlı bir şekilde katlanır ve etkileşimleri bağlama karakterize etmek için Thermolabile ligandlar ölçme

Differential scanning calorimetry (DSC) is a powerful technique for quantifying thermodynamic parameters governing biomolecular folding and binding ...

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

Karbonhidrat taşıma substrat-bağlayıcı-protein SP0092 biyokimyasal ve yapısal karakterizasyonu

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Rab10 Phosphorylation Detection by LRRK2 Activity Using SDS-PAGE with a Phosphate-binding Tag

Rab10 fosforilasyon algılama SDS-sayfa bir fosfat bağlayıcı etiketi ile kullanarak LRRK2 etkinliğini tarafından

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of ...

Measuring Trans-Plasma Membrane Electron Transport by C2C12 Myotubes

Trans-plazma membran elektron taşıma C2C12 Myotubes ile ölçme

Trans-plasma membrane electron transport (tPMET) plays a role in protection of cells from intracellular reductive stress as well as protection from damage ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

A2 bir kuvars rezonatör kullanarak katı destekli Lipid Bilayers için Annexin Protein bağlayıcı fosfolipid bağlama dinamikleri çalışmaya dissipative Microgravimetry

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Measuring and Interpreting Oxygen Consumption Rates in Whole Fly Head Segments

Ölçme ve oksijen Tüketim oranları tamamen yorumlama kafa kesimleri sinek

Regulated metabolic activity is essential for the normal functioning of living cells. Indeed, altered metabolic activity is causally linked with the ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Transkripsiyon faktörü-DNA bağlayıcı Affinities floresans mikroskobu kullanarak rekabet titrasyon tarafından yüksek hassasiyet ölçümü

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...