Name: an all-on-chip method for rapid neutrophil chemotaxis analysis directly from a drop of blood
Uploaded: 2017-06-23T13:00:00
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この研究は、カナダの自然科学・工学研究評議会（NSERC）とカナダ健康研究所（CIHR）からの助成によって部分的に支えられています。ウイニペグのビクトリア総合病院とウイニペグのセブンオークス総合病院の応用臨床教育研究所は、ヒト被験者から臨床サンプルを管理していただき、ありがとうございました。 Hagit Peretz-Soroka博士に、アッセイ操作の戦略についての有益な議論に感謝します。 <style type="text/css">
</style>ワイルドー大学のCarolyn Ren教授とXiaoming（Cody）Chen博士に、撮影プロセスにおける豊富なサポートに感謝します。

すべてのヒト試料採取プロトコールは、ウィニペグのマニトバ大学の共同学部研究倫理委員会によって承認された。 マイクロフルイディックデバイス製造（ 図1A ） <ol><li> デザインと印刷透明マスク。 <ol><li>前に詳述したようにデバイスを設計してください。 図1Aを参照のこと。 注記：デバイスには2つのレ...

<ol>
	<li>Kolaczkowska, E., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+recruitment+and+function+in+health+and+inflammation.">Neutrophil recruitment and function in health and inflammation.</a> Nat Rev Immunol. 13 (13), 159-175 (2013).</li><li>Luster, A. D., Alon, R., von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+cell+migration+in+inflammation:+present+and+future+therapeutic+targets.">Immune cell migration in inflammation: present and future therapeutic targets.</a> Nat Immunol. 6 (12), 1182-1190 (2005).</li><li>Griffith, J. W., Luster, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+cells+in+motion:+migrating+toward+improved+therapies.">Targeting cells in motion: migrating toward improved therapies.</a> Eur. J. Immunol. 43 (6), 1430-1435 (2013).</li><li>Laird, D. J., von Andrian, U. H., Wagers, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+trafficking+in+tissue+development,+growth,+and+disease.">Stem cell trafficking in tissue development, growth, and disease.</a> Cell. 132 (4), 612-630 (2008).</li><li>Condeelis, J., Segall, J. 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F., Campbell, J. J., Butcher, E. 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K., Fulton, A. L., Beebe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+present+and+future+role+of+microfluidics+in+biomedical+research.">The present and future role of microfluidics in biomedical research.</a> Nature. 507 (7491), 181-189 (2014).</li><li>Kim, S., Kim, H. J., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+applications+of+microfluidic+gradient+devices.">Biological applications of microfluidic gradient devices.</a> Integr Biol. 2 (11-12), 584-603 (2010).</li><li>Irimia, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+system+for+measuring+neutrophil+migratory+responses+to+fast+switches+of+chemical+gradients.">Microfluidic system for measuring neutrophil migratory responses to fast switches of chemical gradients.</a> Lab Chip. 6 (2), 191-198 (2006).</li><li>Lin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+migration+in+opposing+chemoattractant+gradients+using+microfluidic+chemotaxis+devices.">Neutrophil migration in opposing chemoattractant gradients using microfluidic chemotaxis devices.</a> Ann Biomed Eng. 33 (4), 475-482 (2005).</li><li>Ambravaneswaran, V., Wong, I. Y., Aranyosi, A. J., Toner, M., Irimia, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directional+decisions+during+neutrophil+chemotaxis+inside+bifurcating+channels.">Directional decisions during neutrophil chemotaxis inside bifurcating channels.</a> Integr Biol. 2 (11-12), 639-647 (2010).</li><li>Jones, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+neutrophil+migration+patterns+during+sepsis+after+major+burns.">Spontaneous neutrophil migration patterns during sepsis after major burns.</a> PloS One. 9 (12), e114509 (2014).</li><li>Butler, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Burn+injury+reduces+neutrophil+directional+migration+speed+in+microfluidic+devices.">Burn injury reduces neutrophil directional migration speed in microfluidic devices.</a> PloS One. 5 (7), e11921 (2010).</li><li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+platform+for+evaluating+neutrophil+chemotaxis+induced+by+sputum+from+COPD+patients.">A microfluidic platform for evaluating neutrophil chemotaxis induced by sputum from COPD patients.</a> PloS One. 10 (5), e0126523 (2015).</li><li>Sackmann, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+kit-on-a-lid:+a+versatile+platform+for+neutrophil+chemotaxis+assays.">Microfluidic kit-on-a-lid: a versatile platform for neutrophil chemotaxis assays.</a> Blood. 120 (14), e45-e53 (2012).</li><li>Agrawal, N., Toner, M., Irimia, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+migration+assay+from+a+drop+of+blood.">Neutrophil migration assay from a drop of blood.</a> Lab Chip. 8 (12), 2054-2061 (2008).</li><li>Jones, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+platform+for+measuring+neutrophil+chemotaxis+from+unprocessed+human+whole+blood.">Microfluidic platform for measuring neutrophil chemotaxis from unprocessed human whole blood.</a> J Vis Exp. (88), (2014).</li><li>Jones, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+assay+for+precise+measurements+of+mouse,+rat,+and+human+neutrophil+chemotaxis+in+whole-blood+droplets.">Microfluidic assay for precise measurements of mouse, rat, and human neutrophil chemotaxis in whole-blood droplets.</a> J Leukocyte Biol. 100 (1), 241-247 (2016).</li><li>Sackmann, E. K. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+asthma+from+a+drop+of+blood+using+neutrophil+chemotaxis.">Characterizing asthma from a drop of blood using neutrophil chemotaxis.</a> P Natl Acad Sci. 111 (16), 5813-5818 (2014).</li><li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+all-on-chip+method+for+testing+neutrophil+chemotaxis+induced+by+fMLP+and+COPD+patient's+sputum.">An all-on-chip method for testing neutrophil chemotaxis induced by fMLP and COPD patient's sputum.</a> Technology. 04 (02), 104-109 (2016).</li></ol>

この論文では、全血から好中球を直接単離した後、走化性試験を単一のマイクロ流体チップ上に直接行うための詳細なプロトコールが記載されている。このメソッドは、簡単な操作、高純度好中球のネガティブ選択、迅速なサンプルから結果の走化性試験、試薬とサンプルの使用量の削減、正確な細胞移動データ解析の有用な機能を提供します。大まかな見積もりとして、入力全血試料から?...

化学走性は、可溶性化学物質濃度勾配への細胞の移動の過程であり、免疫応答1,2,3 、組織発生4および癌転移5を含む多くの生物学的過程に決定的に関与する。好中球は最も豊富な白血球のサブセットであり、身体の本来の宿主防御機能を可能にし、適応免疫応答を媒介するのに重要な役割を果たす6,7 。好中球には、高度に制御された走化性機構が装備されており、これらの運動性免疫細胞は、病原体由来の化学誘引物質（ 例えば、 fMLP）および宿主由来の化学誘引物質（ 例えば、インターロイキン-8）好中球遊走および走化性は、様々な生理学的問題を媒介する炎症や癌などの疾患1,9。したがって、好中球走化性の正確な評価は、好中球の生物学および関連疾患を研究するための重要な機能的読出しを提供する。 広く使用されている従来の走化性アッセイ（ 例えば、トランスウェルアッセイ10 ）と比較して、マイクロ流体デバイスは、正確に制御された化学勾配の生成および小型化のために、細胞遊走および走化性の定量的評価に大きな期待を寄せている11,12,13 。過去20年の間に、様々な生物学的細胞型、特に好中球11の走化性を研究するために、様々なマイクロ流体装置が開発されてきた。時空間複合体における好中球遊走の特徴づけに多大な努力を注いだ<html>マイクロ流体デバイス14,15内に構成されたマイクログラディエントを含む。生物学的研究と並んで、マイクロ流体デバイスの応用は、疾患評価のために臨床試料を試験するために拡張されている17,18,19。しかしながら、多くのマイクロ流体デバイスの使用は、専門の研究室に限られており、大量の血液サンプルから長時間の好中球単離を必要とする。したがって、迅速な好中球走化性分析のための統合されたマイクロ流体デバイスを、一滴の全血から直接的に開発する傾向が高まっている（20,21,22,23 ）ef &quot;&gt; 23,24。 この方向に向かって、磁気陰性好中球精製とそれに続く走化性アッセイとを単一のマイクロ流体装置25に統合したオールオンチップ法が開発された。このオールオンチップ法は、1）接着に基づく細胞捕捉または細胞サイズに基づく濾過によって好中球を血液から単離する従来のオンチップ戦略とは対照的に、この新しい方法は、少量の全血からの好中球のオンチップ磁気分離、ならびに化学誘引物質刺激による走化性測定; 2）細胞ドッキング構造は、好中球の初期位置を化学勾配チャネルに近づけるのを助け、単一細胞追跡なしで簡単な走化性分析を可能にする。 3）好中球単離とケモトの統合単一のマイクロ流体デバイス上での軸解析により、実験ステップ間に中断がない場合、25分で迅速なサンプル - 結果の走化性分析が可能になる。 このペーパーでは、このオールオンチップ走化性アッセイの構築、操作およびデータ解析方法の詳細なプロトコールを提供します。この論文は、既知の組換え化学誘引物質および複雑な走化性試料を患者から試験し、続いてトラブルシューティングの戦略、限界および将来の方向性について議論することによって、好中球走化性を行うための開発された方法の有効な使用を実証する。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="581">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:581px;">Device fabrication</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mask aligner</td>
			<td>ABM</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Spinner</td>
			<td>Solitec</td>
			<td>5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hotplate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>11301-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Plasma cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>PDC-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vacuum dessicator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-594-15A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Digital scale</td>
			<td>Ohaus</td>
			<td>CS200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SU-8 2000 thinner</td>
			<td>Microchem</td>
			<td>SU-8 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SU-8 2025 photoresist</td>
			<td>Microchem</td>
			<td>SU-8 2025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SU-8 developer</td>
			<td>Microchem</td>
			<td>SU-8 developer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Si wafer</td>
			<td>Silicon, Inc</td>
			<td>LG2065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">isopropyl alcohol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A416-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:159px;">(tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl) trichlorosilane</td>
			<td>Gelest</td>
			<td>78560-45-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:159px;">Polydimethylsiloxane 
			(PDMS)</td>
			<td>Ellsworth Adhesives</td>
			<td>2065622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Petri Dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glass slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cutting pad</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Custom-made</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Punchers</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Custom-made</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:159px;">Name </td>
			<td>Source</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">On-chip cell isolation and chemotaxis assay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:159px;">RPMI 1640</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SH3025502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DPBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SH3002802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:159px;">Bovine serum albumin 
			(BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SH3057402</td>
			<td style="width:164px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;">Fibronectin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CACB356008</td>
			<td style="width:164px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;">fMLP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F3506-10MG</td>
			<td style="width:164px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:159px;">Magnetic disks</td>
			<td style="width:124px;">Indigo Instruments</td>
			<td>44202-1</td>
			<td style="width:164px;">5 mm in diameter, 
			1 mm thick</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:159px;">FITC-Dextran</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>FD10S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"> Rhodamine</td>
			<td> 
			Sigma-Aldrich</td>
			<td>R4127-5G</td>
			<td style="width:164px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:159px;">Giemsa stain solution</td>
			<td style="width:124px;">Rowley Biochemical Inc.</td>
			<td style="width:135px;">G-472-1-8OZ</td>
			<td style="width:164px;"></td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:159px;">EasySep Direct Human 
			Neutrophil Isolation 
			Kit</td>
			<td style="width:124px;">STEMCELL 
			Technologies Inc</td>
			<td>19666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:159px;">Dithiothreitol</td>
			<td style="width:124px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:159px;"> Nikon Ti-U inverted fluorescent microscope </td>
			<td style="width:124px;">Nikon</td>
			<td>Ti-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:159px;">Microscope environmental chamber.</td>
			<td style="width:124px;">InVivo Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td style="width:164px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:159px;"> CCD camera</td>
			<td style="width:124px;">Nikon</td>
			<td>DS-Fi1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an all-on-chip method for rapid neutrophil chemotaxis analysis directly from a drop of blood

好中球の移動と走化性は私たちの体の免疫系にとって重要です。マイクロ流体デバイスは、リアルタイムビジュアライゼーション、化学濃度勾配生成の正確な制御、および試薬およびサンプル消費の低減におけるそれらの利点のために、好中球移動および走化性を調べるためにますます使用されている。近年、全血から直接的に、統合された、容易に操作される微小流体走化性分析システムを開発するために、マイクロ流体研究者によってますます努力がなされている。この方向では、最初のオールオンチップ法が、好中球の磁気陰性浄化と小血液量試料からの走化性アッセイとを統合するために開発された。この新しい方法は、25分で迅速なサンプル - 結果好中球走化性試験を可能にする。本稿では、このオールオンチップ走化性アッセイの詳細な構築、操作、およびデータ分析方法について、トラブルシューティング戦略、limi将来の方向性を示しています。この全オンチップ法を用いて、定義された化学誘引物質、 N-ホルミル-Met-Leu-Phe（fMLP）および慢性閉塞性肺疾患（COPD）患者からの痰を試験する好中球走化性アッセイの代表的結果を示す。この方法は、多くの細胞移動関連の調査および臨床応用に適用可能である。

好中球は、マイクロ流体デバイス内の直接の一滴の全血から陰性に選択される。単離された好中球の純度は、Giemsa染色で確認され、その結果は、好中球の典型的なリング形状およびローブ形状の核を示した（ 図2A ）。これは、少量の全血から高純度で効果的なオンチップ好中球単離を示す。さらに、ドッキング構造は、化学勾配（ <strong class="xf...

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An All-on-chip Method for Rapid Neutrophil Chemotaxis Analysis Directly from a Drop of Blood

この記事では、全血からのチップ上の好中球単離と、単一のマイクロ流体チップ上の走化性試験とを統合することにより、迅速な好中球走化性アッセイを行う詳細な方法を提供する。

血液滴からの迅速な好中球走化性解析のためのオールオンチップ法

Neutrophil migration and chemotaxis are critical for our body's immune system. Microfluidic devices are increasingly used for investigating neutrophil ...

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Bloodstream infections and sepsis are a major cause of morbidity and mortality. The successful outcome of patients suffering from bacteremia depends on a ...

A RAPID Method for Blood Processing to Increase the Yield of Plasma Peptide Levels in Human Blood

血液処理のための迅速な方法は、ヒト血液中の血漿ペプチドレベルの収量を増やすには

Research in the field of food intake regulation is gaining importance. This often includes the measurement of peptides regulating food intake. For the ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

調節するc-ジ-GMPシグナリングで、小さな分子をスクリーニングするためのハイスループットセットアップの確立<em&gt;緑膿菌</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...