Name: a multi-hole cryovial eliminates freezing artifacts when muscle tissues are directly immersed in liquid nitrogen
Uploaded: 2017-04-06T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Multi-hole Cryovial Eliminates Freezing Artifacts when Muscle Tissues are Directly Immersed in Liquid Nitrogen at JoVE.com

פרויקט זה מומן על ידי הקרן הלאומית למדע הטבע של סין (NSFC): 31,301,950 ו 31,671,288.

השיטה הנוכחית כבר נקבעה ומאומתת לקצור ולאחסן יותר מ -1,000 דגימות שריר מכתים היסטולוגית במעבדה שלנו. כל הנהלים הקשורים לטיפול בבעלי חיים ושימוש בעקבות ההנחיות שנקבעו על ידי משרד החקלאות של סין. ציוד 1. עבור אוסף דוגמאות <ol style=";text-align:right;direction:rtl...

<ol>
	<li>Joo, S. T., Kim, G. D., Hwang, Y. H., Ryu, Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+fresh+meat+quality+through+manipulation+of+muscle+fiber+characteristics.">Control of fresh meat quality through manipulation of muscle fiber characteristics.</a> Meat Sci. 95 (4), 828-836 (2013).</li><li>Lefaucheur, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+second+look+into+fibre+typing--relation+to+meat+quality.">A second look into fibre typing--relation to meat quality.</a> Meat Sci. 84 (2), 257-270 (2010).</li><li>Fiems, L. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+Muscling+in+Cattle:+Genes,+Husbandry,+Carcasses+and+Meat.">Double Muscling in Cattle: Genes, Husbandry, Carcasses and Meat.</a> Animals (Basel). 2 (3), 472-506 (2012).</li><li>Cockett, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+callipyge+mutation+and+other+genes+that+affect+muscle+hypertrophy+in+sheep.">The callipyge mutation and other genes that affect muscle hypertrophy in sheep.</a> Genet Sel Evol. 37, 65-81 (2005).</li><li>Stinckens, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RYR1+g.1843C&gt;T+mutation+is+associated+with+the+effect+of+the+IGF2+intron3-g.3072G&gt;A+mutation+on+muscle+hypertrophy.">The RYR1 g.1843C&gt;T mutation is associated with the effect of the IGF2 intron3-g.3072G&gt;A mutation on muscle hypertrophy.</a> Anim Genet. 38 (1), 67-71 (2007).</li><li>Brameld, J. M., Buttery, P. J., Dawson, J. M., Harper, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutritional+and+hormonal+control+of+skeletal-muscle+cell+growth+and+differentiation.">Nutritional and hormonal control of skeletal-muscle cell growth and differentiation.</a> Proc Nutr Soc. 57 (2), 207-217 (1998).</li><li>Reinoso, R. F., Telfer, B. A., Rowland, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+water+content+in+rats+measured+by+desiccation.">Tissue water content in rats measured by desiccation.</a> J Pharmacol Toxicol Methods. 38 (2), 87-92 (1997).</li><li>Meng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+triage+and+freezing+for+models+of+skeletal+muscle+disease.">Tissue triage and freezing for models of skeletal muscle disease.</a> J Vis Exp. (89), (2014).</li><li>Kumar, A., Accorsi, A., Rhee, Y., Girgenrath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Do's+and+don'ts+in+the+preparation+of+muscle+cryosections+for+histological+analysis.">Do's and don'ts in the preparation of muscle cryosections for histological analysis.</a> J Vis Exp. (99), e52793 (2015).</li><li>Meijer, A. E., Vloedman, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+histochemical+characterization+of+the+coupling+state+of+skeletal+muscle+mitochondria.">The histochemical characterization of the coupling state of skeletal muscle mitochondria.</a> Histochemistry. 69 (3), 217-232 (1980).</li><li>Harnkarnsujarit, N., Kawai, K., Suzuki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Freezing+Temperature+and+Water+Activity+on+Microstructure,+Color,+and+Protein+Conformation+of+Freeze-Dried+Bluefin+Tuna+(Thunnus+orientalis).">Effects of Freezing Temperature and Water Activity on Microstructure, Color, and Protein Conformation of Freeze-Dried Bluefin Tuna (Thunnus orientalis).</a> Food Bioprocess Technol. 8 (4), 916-925 (2015).</li><li>Dubowitz, V., Sewry, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Muscle Biopsy: A Practical Approach. , 407-422 (2007).</li><li>Suvarna, S. K., Layton, C., Bancroft, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bancroft's Theory and Practice of Histological Techniques: Expert Consult: Online and Print, 7e. , (2008).</li><li>Sulaiman, S. A., Kamarudin, N. A. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bubbles+Size+Estimation+in+Liquid+Flow+Through+a+Vertical+Pipe.">Bubbles Size Estimation in Liquid Flow Through a Vertical Pipe.</a> J Appl Sci. 12 (23), 2464-2468 (2012).</li><li>Fukutomi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Study+of+A+Flow+through+Small+Apertures+:+2nd+Report,+Experiments+on+The+Velocity+Field.">A Study of A Flow through Small Apertures : 2nd Report, Experiments on The Velocity Field.</a> Nihon Kikai Gakkai Ronbunshu B Hen/transactions of the Japan Society of Mechanical Engineers Part B. 53 (496), 3516-3521 (1987).</li><li>Shah, M. S., Joshi, J. B., Kalsi, A. S., Prasad, C. S. R., Shukla, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+flow+through+an+orifice+meter:+CFD+simulation.">Analysis of flow through an orifice meter: CFD simulation.</a> Chem Eng Sci. 71 (9), 300-309 (2012).</li></ol>

כאן, אנו מתארים cryovial החדש, רב-חור להקפאה ואחסון רקמות השריר לבצע הערכות היסטולוגית של תפקוד השרירים. הצעד שונה קריטי פרוטוקול זה הוא כי המדגם של cryovial רב-חור שקוע ישירות בחנקן נוזלי. למיטב ידיעתנו, זוהי הדרך הפשוטה rapidest להשיג דגימות קפואות מצוינות cryosectioning השריר בין שיט...

שריר שלד הוא המרכיב היקר ביותר של בעלי חיים לייצור בשר מהנקודה התזונתית ועיבוד של השקפה. בתעשיית הבשר, ישנם שני היבטים קריטיים במיוחד: את היעילות של צמיחת שרירים ואיכות הבשר והתוצאה. כרכיב עיקרי של השריר, סיבי שריר שקשורים באופן ישיר על ביצועי צמיחה ואיכות בשר טרי בחי 1. לדוגמא, המספר הכולל של סיבים (TNF) ואת שטח החתך של סיבים (CSAF) בעיקר לקביעת מסת שריר ואיכות בשר; גם, רכב סוג הסיבים (FTC) בחריפות משפיע איכות בשר טרי 2. לכן, המניפולציה של מאפייני סיב שריר בבעלי חיים היא שיטה יעילה מאוד כדי להגדיל את רווחיות ליבה ואת התחרותיות של משקי 1. נכון להיום, מספר גורמים פנימיים וחיצוניים זוהו לתמרן characterist סיב שרירICS 1. מניפולציה זו יכולה להיות מושגת באמצעות הבחירה של חיות הממוקדות עם גנים ספציפיים, כגון גן מיוסטטין בבקר 3, גן Callipyge בכבשים 4, ואת RYR1 וגני IGF2 בחזירים 5. כמו כן, שליטת דיאטה וטיפולים עם הורמונים ספציפיים לשחק תפקיד חשוב מאפייני סיב שריר 6. לפיכך, גישה משלבת גורמים גנטיים ותזונתיים יוכל לשפר תוכן ואיכות בשר בשר רזה. עם זאת, מחקרים על סיבי שריר מוגבלים תעשיית הבשר משום ההבהרה של המבנה סיבי שריר עדיין מהווה אתגר. תכונות סיב השריר מזוהים באמצעות שיטות histochemical, כגון triphosphatase אדנוזין שרירן (ATPase) assay. שיטה זו מסתמכת על העובדה כי אנזימים הממוקם דקים (6-8 מיקרומטר) קפוא קטעיםסיבי שריר ניתן הגיבו כימי עם מוצרים מסוימים. עם זאת, תכולת המים של שרירים עולה 75% בחזירים, ארנבים, עכברים, ובני אדם, ללא קשר לתפקיד (כלומר, גב, בטן, או hindlimb) 7. לעתים קרובות תוכן לחות גבוה בשרירים גורם לבעיה זו בדרך כלל - הקפאת חפצים - במהלך תקופת ההכנה של cryosections, כפי שתואר לעיל 8, 9. ברוב המקרים, זה כמעט בלתי אפשרי להקפיא כראוי ברקמות שרירות בקו ייצור מטבחיים, על פי הניסיון שלנו. הפרוטוקול המובא כאן מתאר שיטה פשוטה ויעילה בשימוש במעבדה שלנו להקפיא רקמות שריר עבור Cryosectioning באופן תפוקה גבוהה. גולת הכותרת של שיטה זו היא cryovial חדש אשר נועד עבור רקמות פלאש-הקפאת שרירים בחנקן נוזלי. זרימת העבודה הנוכחית במקביל יכולה להקל רקמותהקפאה ועיבוד עבור cryosection שרירים מעולה, עם תא ציטופלסמית נראה בבירור ואת הפרד ההדוק של myofibers אל הרקמה שמסביב. בנוסף, פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על מגוון רחב של אפשרויות עבור בדיקת רקמות משום חנקן נוזלי אינו מתערבב עם רקמות.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="508">
	<colgroup>
		<col />
		<col span="2" />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:140px;">Cryostat Microtome</td>
			<td style="width:111px;">&#160;Leica</td>
			<td style="width:111px;">Leica CM1950</td>
			<td style="width:148px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Digital Microscope&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Nikon DS-U3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:140px;">&#160;Cryogenic Vial&#160;&#160; Plastic film</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Designed by ourself</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Liquid Nitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Commomly-used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Scalpel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Commomly-used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10cm-forcep</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Commomly-used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">25cm-tweezer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Commomly-used</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Safety glass</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Commomly-used</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Freezer gloves</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Commomly-used</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a multi-hole cryovial eliminates freezing artifacts when muscle tissues are directly immersed in liquid nitrogen

מחקרים על פיזיולוגית שרירי שלד להתמודד עם האתגר הטכני של עיבוד הדגימות כראוי להשיג חלקים עם תאי ציטופלסמית נראו בבירור. משוכה נוספת היא למגע ההדוק של myofibers אל הרקמות הסובבות. בגלל התהליך של קיבוע רקמה והטבעת פרפין מוביל ההצטמקות של סיבי שריר, הקפאה היא אמצעי אופטימלי של התקשות רקמת שריר עבור חתך. עם זאת, סוגיה בדרך נתקל, היווצרות של גבישי קרח, מתרחשת במהלך תקופת ההכנה של חלקים קפואים בגלל תכולת מים גבוהה של השריר. הפרוטוקול המובא כאן לראשונה מתאר שיטה פשוטה ויעילה עבור מקפיא כראוי ברקמות שרירות על ידי השיקוע שלהם חנקן נוזלי. הבעיה בשימוש בחנקן נוזלי לבד היא שזה גורם להיווצרות מחסום גז חנקן ליד רקמות, אשר משמש כמבודד ומעכבת את הקירור של רקמות. כדי למנוע זאת השפעה &quot;אדי שמיכה&quot;, התחלה חדשהcryovial w נועד להגדיל את מהירות זרימת הנוזל סביב משטח רקמה. זו הושגה על ידי ניקוב סך של 14 חורים מפרצון בקיר של הבקבוקון. על פי דינמיקת בועה, שיעור גבוה של תוצאות זרימת נוזל בבועות קטנות סיכויים פחות כדי ליצור מחסום גז. כאשר חנקן נוזלי זורם לתוך cryovial דרך חורי המפרצון, מהירות הזרימה סביב הרקמה היא מהירה מספיק כדי לבטל מחסומי גז. לעומת השיטה של ​​הקפאת רקמות שרירות באמצעות איזופנטאן טרום צונן, פרוטוקול זה הוא פשוט ויעיל יותר וניתן להשתמש בו כדי להקפיא שריר באופן תפוקה. יתר על כן, שיטה זו היא אופטימלית עבור מוסדות שאין להם גישה איזופנטאן, המהווה דליק מאוד בטמפרטורת החדר.

איור cryovial וציוד המעבדה המשותף מקפיא שרירים במהלך תקופת ההכנה של חלקים קפואים מוצגים באיור 1. Cryovials עשויים פוליפרופילן במפעל עובש. לכל בקבוקון סך של 14 חורי מפרצון: אחד הוא על הכובע; עוד נמצא בתחתית; ואת הארבע השורות המקבילות 12 הטופס הנותר, כל א...

Watch this Scientific Journal Video about A Multi-hole Cryovial Eliminates Freezing Artifacts when Muscle Tissues are Directly Immersed in Liquid Nitrogen at JoVE.com

A Multi-hole Cryovial Eliminates Freezing Artifacts when Muscle Tissues are Directly Immersed in Liquid Nitrogen

פרוטוקול זה מתאר הליך להקפיא רקמות שרירות על ידי ותקע אותם ישירות לתוך חנקן נוזלי. פרוטוקול זה גם מדגיש cryovial חדש שיכול למנוע את &quot;אפקט השמיכה&quot; של גז חנקן כאשר מגעי חנקן נוזליים על פני שטח הרקמות של דגימה.

מבטל Multi-חור cryovial הקפאת חפצים כאשר השרירים שקועים ישירות בחנקן נוזלי

Studies on skeletal muscle physiology face the technical challenge of appropriately processing the specimens to obtain sections with clearly visible ...

Research

JoVE Journal

Biology

Freezing Human ES Cells

הקפאת ES תאים אנושיים

Here we demonstrate how our lab freezes HuES human embryonic stem cell lines.  A healthy, exponentially expanding culture is washed with PBS to remove ...

Freezing, Thawing, and Packaging Cells for Transport

הקפאה, הפשרה, ותאי אריזות התחבורה

Cultured mammalian cells are used extensively in cell biology studies. It requires a number of special skills in order to be able to preserve the ...

Culturing of Human Nasal Epithelial Cells at the Air Liquid Interface

Culturing של אדם תאי אפיתל באף בממשק האוויר הנוזלי

In vitro models using human primary  epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory  epithelium in the context of ...

Aip1p Dynamics Are Altered by the R256H Mutation in Actin

Aip1p Dynamics שונה על ידי מוטצית R256H ביקטין

Mutations in actin cause a range of human diseases due to specific molecular changes that often alter cytoskeletal function. In this study, imaging of ...

Tissue Triage and Freezing for Models of Skeletal Muscle Disease

Triage רקמות ומקפיאים למודלים של מחלות שרירי שלד

Skeletal muscle is a unique tissue because of its structure and function, which requires specific protocols for tissue collection to obtain optimal ...

Tandem High-pressure Freezing and Quick Freeze Substitution of Plant Tissues for Transmission Electron Microscopy

הקפאה בלחץ גבוהה טנדם ומהיר הקפאת חילוף של צמח רקמות למיקרוסקופים אלקטרונים חודרים

Since the 1940s transmission electron microscopy (TEM) has been providing biologists with ultra-high resolution images of biological materials. Yet, ...

Plunge Freezing: A Tool for the Ultrastructural and Immunolocalization Studies of Suspension Cells in Transmission Electron Microscopy

מקפיא פלאנג: כלי עבור מחקרי ultrastructural ו Immunolocalization של תאי השעית הילוכים מיקרוסקופים אלקטרונים

Transmission Electron Microscopy (TEM) is an extraordinary tool for studying cell ultrastructure, in order to localize proteins and visualize ...

The Ingestion of Fluorescent, Magnetic Nanoparticles for Determining Fluid-uptake Abilities in Insects

הבליעה של פלורסנט, חלקיקים מגנטיים לקביעת יכולת ספיגת הנוזלים חרקים

Fluid-feeding insects ingest a variety of liquids, which are present in the environment as pools, films, or confined to small pores. Studies of liquid ...