Name: a multi-hole cryovial eliminates freezing artifacts when muscle tissues are directly immersed in liquid nitrogen
Uploaded: 2017-04-06T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Multi-hole Cryovial Eliminates Freezing Artifacts when Muscle Tissues are Directly Immersed in Liquid Nitrogen at JoVE.com

Dette prosjektet ble støttet av Natural Science Foundation National of China (NSFC): 31301950 og 31671288.

Den nåværende metode er blitt etablert og valideres for å høste og lagre mer enn 1000 muskelprøver for histologisk farging i vårt laboratorium. Alle prosedyrer som involverer dyr omsorg og bruk fulgt retningslinjene fastsatt av Landbruksdepartementet i Kina. 1. Utstyr for Prøvetaking <ol><li> Merk prøven med identitet på hver kryogen hetteglass. Merk: Den kryogene ampulle er spesielt utformet for å fryse friske vevsprøver for cryosection prosedyre (figur 1A). Ampullene er lag...

<ol>
	<li>Joo, S. T., Kim, G. D., Hwang, Y. H., Ryu, Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+fresh+meat+quality+through+manipulation+of+muscle+fiber+characteristics.">Control of fresh meat quality through manipulation of muscle fiber characteristics.</a> Meat Sci. 95 (4), 828-836 (2013).</li><li>Lefaucheur, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+second+look+into+fibre+typing--relation+to+meat+quality.">A second look into fibre typing--relation to meat quality.</a> Meat Sci. 84 (2), 257-270 (2010).</li><li>Fiems, L. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+Muscling+in+Cattle:+Genes,+Husbandry,+Carcasses+and+Meat.">Double Muscling in Cattle: Genes, Husbandry, Carcasses and Meat.</a> Animals (Basel). 2 (3), 472-506 (2012).</li><li>Cockett, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+callipyge+mutation+and+other+genes+that+affect+muscle+hypertrophy+in+sheep.">The callipyge mutation and other genes that affect muscle hypertrophy in sheep.</a> Genet Sel Evol. 37, 65-81 (2005).</li><li>Stinckens, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RYR1+g.1843C&gt;T+mutation+is+associated+with+the+effect+of+the+IGF2+intron3-g.3072G&gt;A+mutation+on+muscle+hypertrophy.">The RYR1 g.1843C&gt;T mutation is associated with the effect of the IGF2 intron3-g.3072G&gt;A mutation on muscle hypertrophy.</a> Anim Genet. 38 (1), 67-71 (2007).</li><li>Brameld, J. M., Buttery, P. J., Dawson, J. M., Harper, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutritional+and+hormonal+control+of+skeletal-muscle+cell+growth+and+differentiation.">Nutritional and hormonal control of skeletal-muscle cell growth and differentiation.</a> Proc Nutr Soc. 57 (2), 207-217 (1998).</li><li>Reinoso, R. F., Telfer, B. A., Rowland, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+water+content+in+rats+measured+by+desiccation.">Tissue water content in rats measured by desiccation.</a> J Pharmacol Toxicol Methods. 38 (2), 87-92 (1997).</li><li>Meng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+triage+and+freezing+for+models+of+skeletal+muscle+disease.">Tissue triage and freezing for models of skeletal muscle disease.</a> J Vis Exp. (89), (2014).</li><li>Kumar, A., Accorsi, A., Rhee, Y., Girgenrath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Do's+and+don'ts+in+the+preparation+of+muscle+cryosections+for+histological+analysis.">Do's and don'ts in the preparation of muscle cryosections for histological analysis.</a> J Vis Exp. (99), e52793 (2015).</li><li>Meijer, A. E., Vloedman, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+histochemical+characterization+of+the+coupling+state+of+skeletal+muscle+mitochondria.">The histochemical characterization of the coupling state of skeletal muscle mitochondria.</a> Histochemistry. 69 (3), 217-232 (1980).</li><li>Harnkarnsujarit, N., Kawai, K., Suzuki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Freezing+Temperature+and+Water+Activity+on+Microstructure,+Color,+and+Protein+Conformation+of+Freeze-Dried+Bluefin+Tuna+(Thunnus+orientalis).">Effects of Freezing Temperature and Water Activity on Microstructure, Color, and Protein Conformation of Freeze-Dried Bluefin Tuna (Thunnus orientalis).</a> Food Bioprocess Technol. 8 (4), 916-925 (2015).</li><li>Dubowitz, V., Sewry, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Muscle Biopsy: A Practical Approach. , 407-422 (2007).</li><li>Suvarna, S. K., Layton, C., Bancroft, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bancroft's Theory and Practice of Histological Techniques: Expert Consult: Online and Print, 7e. , (2008).</li><li>Sulaiman, S. A., Kamarudin, N. A. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bubbles+Size+Estimation+in+Liquid+Flow+Through+a+Vertical+Pipe.">Bubbles Size Estimation in Liquid Flow Through a Vertical Pipe.</a> J Appl Sci. 12 (23), 2464-2468 (2012).</li><li>Fukutomi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Study+of+A+Flow+through+Small+Apertures+:+2nd+Report,+Experiments+on+The+Velocity+Field.">A Study of A Flow through Small Apertures : 2nd Report, Experiments on The Velocity Field.</a> Nihon Kikai Gakkai Ronbunshu B Hen/transactions of the Japan Society of Mechanical Engineers Part B. 53 (496), 3516-3521 (1987).</li><li>Shah, M. S., Joshi, J. B., Kalsi, A. S., Prasad, C. S. R., Shukla, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+flow+through+an+orifice+meter:+CFD+simulation.">Analysis of flow through an orifice meter: CFD simulation.</a> Chem Eng Sci. 71 (9), 300-309 (2012).</li></ol>

Her beskriver vi en ny, flerhulls kryoampulle for frysing og lagring av muskelvev for å utføre histologiske vurderinger av muskelfunksjonen. Den kritiske modifiserte trinnet i denne protokollen er at prøven i det flerhulls kryoampulle er direkte nedsenket i flytende nitrogen. Så vidt vi vet, er dette den enkleste og rapidest måten å oppnå gode frosne prøver for muskel cryosectioning blant de eksisterende frysemetoder (se representative resultater). Den tekniske Utfordringen til muske...

Skjelettmuskulatur er den mest verdifulle komponenten i en kjøttproduserende dyr fra det ernæringsmessige og behandling synspunkt. I kjøttindustrien er det to særlig viktige aspekter: effektiviteten av muskelvekst og kvaliteten av det resulterende kjøtt. Som en hovedkomponent av muskelen, muskelfibre er direkte relatert til vekst ytelse og ferskt kjøttkvaliteten hos dyr 1. For eksempel kan det totale antall av fibre (TNF) og den Tverrsnittsareal av fibre (CSAF) for det meste bestemme muskelmasse og kjøttkvalitet; også, Fiber Type Sammensetning (FTC) sterkt påvirker ferskt kjøtt kvalitet 2. Derfor er det manipulering av muskelfiberegenskaper hos dyr en svært effektiv metode for å øke kjerne lønnsomhet og konkurranse av gårdsbruk 1. Hittil har flere indre og ytre faktorer blitt identifisert til å manipulere muskelfiber characteristics 1. Denne manipulasjon kan oppnås ved målrettet utvalg av dyr med spesifikke gener, slik som myostatin-genet hos storfe 3, den Callipyge genet i sau 4, og den RYR1 og IGF2 gener hos griser 5. Også, kosthold kontroll og behandling med bestemte hormoner spiller en viktig rolle i muskelfiberegenskaper 6. Dermed kan en tilnærming som kombinerer genetiske og ernæringsmessige faktorer kunne forbedre magert kjøtt innhold og kjøttkvalitet. Imidlertid er studier av muskelfibre begrenset i kjøttindustrien, fordi klarlegging av strukturen av muskelfibre fremdeles er en utfordring. Muskelfiberegenskaper blir identifisert ved hjelp av histokjemiske metoder, slik som myosin adenosin trifosfatase (ATPase) assay. Denne metode er basert på det faktum at enzymer lokalisert i tynn (6-8 um) frosne seksjoner avmuskelfibre kan reagere kjemisk med visse produkter. Imidlertid er vanninnholdet i muskler som er større enn 75% i griser, kaniner, mus og mennesker, uavhengig av den stilling (dvs., rygg, mage, eller bakbenekstensjon) 7. Et slikt høyt fuktighetsinnhold i musklene forårsaker en vanlig forekommende problem - frysing gjenstander - under fremstilling av frysesnitt, som tidligere beskrevet 8, 9. I de fleste tilfeller er det nesten umulig å riktig fryse muskler i et slakteri produksjonslinje, etter våre erfaringer. Protokollen som presenteres her beskrives en enkel og effektiv metode som brukes i laboratoriet for å fryse muskelvev for cryosectioning i en high-throughput måte. Høydepunktet av denne metode er en ny kryoampulle som er utformet for flash-frysing muskler i flytende nitrogen. Den nåværende arbeidsflyt kan samtidig lette vevfrysing og prosessering for en utmerket muskel cryosection, med en klart synlig cytoplasmisk rommet og med tett holding av myofibers til det omgivende vev. I tillegg kan denne protokoll brukes på en lang rekke alternativer for vev analyse fordi flytende nitrogen ikke blander seg med vev.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="508">
	<colgroup>
		<col />
		<col span="2" />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:140px;">Cryostat Microtome</td>
			<td style="width:111px;">&#160;Leica</td>
			<td style="width:111px;">Leica CM1950</td>
			<td style="width:148px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Digital Microscope&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Nikon DS-U3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:140px;">&#160;Cryogenic Vial&#160;&#160; Plastic film</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Designed by ourself</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Liquid Nitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Commomly-used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Scalpel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Commomly-used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10cm-forcep</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Commomly-used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">25cm-tweezer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Commomly-used</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Safety glass</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Commomly-used</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Freezer gloves</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Commomly-used</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a multi-hole cryovial eliminates freezing artifacts when muscle tissues are directly immersed in liquid nitrogen

Studier på skjelettmuskulatur fysiologi møte teknisk utfordring med passende å behandle prøvene for å oppnå seksjoner med klart synlige cytoplasmatiske rom. Et annet hinder er det med tett holding av myofibers til det omgivende vev. Fordi prosessen av vev og fiksering i parafin fører til krymping av muskelfibre, er fryse et optimalt middel for herding muskelvev for seksjonering. Imidlertid er en vanlig forekommende problem, dannelse av iskrystaller, oppstår under fremstillingen av frosne seksjoner på grunn av det høye vanninnhold i muskel. Protokollen presenteres her beskrives først en enkel og effektiv metode for på riktig måte å fryse muskelvev ved å senke dem i flytende nitrogen. Problemet med å bruke flytende nitrogen alene er at det fører til dannelse av en nitrogengass-barriere ved siden av vev, som virker som en isolator og hindrer avkjøling av vev. For å unngå dette &quot;damp teppe&quot; effekt, en new kryoampulle er designet for å øke hastigheten på væskestrømmen rundt vevsoverflaten. Dette ble oppnådd ved å slå sammen 14 innløpshull i veggen av ampullen. Ifølge bobledynamikken, til en høyere hastighet av væskestrøm resulterer i mindre bobler og færre muligheter danne en gassbarriere. Når flytende nitrogen strømmer inn i kryoampulle gjennom innløpshull, strømningshastigheten rundt vevet som er rask nok til å eliminere gassbarriere. Sammenlignet med fremgangsmåten for frysing av muskelvev ved hjelp av pre-avkjølt isopentan, er denne protokollen enklere og mer effektiv, og kan brukes til å fryse muskel i et gjennomløp måte. Videre er denne metode optimal for institusjoner som ikke har adgang til isopentan, som er svært brannfarlig ved romtemperatur.

Den kryoampulle illustrasjon og vanlig laboratorieutstyr for frysing muskler under fremstillingen av frosne seksjoner er vist i figur 1. De fryseflasker er laget av polypropylen i en støpeform fabrikk. Hver ampulle har en total av 14 innløpshull: den ene er på kapselen; en annen er på bunnen; og de resterende 12 danner fire parallelle linjer, hver med fire hull på 90 ° i forhold til hverandre. Disse innløpshullene kan øke hastigheten av strømningshastigheten av ...

Watch this Scientific Journal Video about A Multi-hole Cryovial Eliminates Freezing Artifacts when Muscle Tissues are Directly Immersed in Liquid Nitrogen at JoVE.com

A Multi-hole Cryovial Eliminates Freezing Artifacts when Muscle Tissues are Directly Immersed in Liquid Nitrogen

Denne protokollen beskriver en fremgangsmåte for å fryse muskelvev ved å dyppe dem direkte inn i flytende nitrogen. Denne protokollen fremhever også en ny kryoampulle som kan unngå &quot;teppe effekten&quot; av nitrogengass når flytende nitrogen kommer i kontakt med vev overflaten av et prøvestykke.

En flerhulls kryoampulle Eliminerer Frysing Arti når muskelvev er direkte nedsenket i flytende nitrogen

Studies on skeletal muscle physiology face the technical challenge of appropriately processing the specimens to obtain sections with clearly visible ...

Research

JoVE Journal

Biology

Freezing Human ES Cells

Here we demonstrate how our lab freezes HuES human embryonic stem cell lines.  A healthy, exponentially expanding culture is washed with PBS to remove ...

Freezing, Thawing, and Packaging Cells for Transport

Cultured mammalian cells are used extensively in cell biology studies. It requires a number of special skills in order to be able to preserve the ...

Culturing of Human Nasal Epithelial Cells at the Air Liquid Interface

Dyrking av menneskelig Nasal Epitelceller på Air Flytende Interface

In vitro models using human primary  epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory  epithelium in the context of ...

Aip1p Dynamics Are Altered by the R256H Mutation in Actin

Aip1p Dynamics er endret av R256H Mutasjon i Actin

Mutations in actin cause a range of human diseases due to specific molecular changes that often alter cytoskeletal function. In this study, imaging of ...

Tissue Triage and Freezing for Models of Skeletal Muscle Disease

Tissue Triage og Frysing av modeller av Skeletal Muscle Disease

Skeletal muscle is a unique tissue because of its structure and function, which requires specific protocols for tissue collection to obtain optimal ...

Tandem High-pressure Freezing and Quick Freeze Substitution of Plant Tissues for Transmission Electron Microscopy

Tandem Høytrykks Frysing og Quick Freeze Bytte av plantemateriale for transmisjonselektronmikroskopi

Since the 1940s transmission electron microscopy (TEM) has been providing biologists with ultra-high resolution images of biological materials. Yet, ...

Plunge Freezing: A Tool for the Ultrastructural and Immunolocalization Studies of Suspension Cells in Transmission Electron Microscopy

Plunge Frysing: Et verktøy for Ultra og Immunolocalization Studier av suspensjonsceller i transmisjonselektronmikroskopi

Transmission Electron Microscopy (TEM) is an extraordinary tool for studying cell ultrastructure, in order to localize proteins and visualize ...

The Ingestion of Fluorescent, Magnetic Nanoparticles for Determining Fluid-uptake Abilities in Insects

Inntak av lysrør, magnetiske nanopartikler for å bestemme væske-opptak evner i insekter

Fluid-feeding insects ingest a variety of liquids, which are present in the environment as pools, films, or confined to small pores. Studies of liquid ...