Name: evaluating primary blast effects in vitro
Uploaded: 2017-09-18T12:30:00
Duration: 10 min 51 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluating Primary Blast Effects In Vitro at JoVE.com

Vi ønsker å erkjenne økonomisk støtte av kongelige britiske Legion sentrum for Blast skade studier for å HA og finansiering fra i Medical Research Council (M01858X/1) til CAH.

1. Sample forberedelse og cellekultur <ol><li>innhente en aktuelle cellen linje (f.eks dermal papilla celler). 
	Merk: Gjeldende protokollen utviklet for tilhenger celler, med rotte dermal papilla fibroblaster isolert fra vibrissae brukt som forbilde.</li>
	<li>Kultur cellene i en T-75 bolle med minimum viktig middels (MEM) α supplert med 10% fosterets bovin serum og 1% penicillin streptomycin. Holde cellene på standard oppdrettsforholdene 37 ° C og 5% CO 2 i fuktet omgivelser til de når 80% samløpet.</li>
	<li>Sug opp mediet og vaske cellene to ganger i Dulbecco &#39; s fosfat-bufret saltvann (PBS). Distansere cellene fra flasken av rugende dem i 2 mL av trypsin/EDTA på standard kultur betingelser for 5 min. Sjekk kort for å sikre at cellene har er atskilt fra flasken med lys/fase kontrast mikroskop (med en 10 X linsen ).</li>
	<li>Legge til 4 mL kultur medium å nøytralisere trypsinization reaksjonen. Overføre celle suspensjon slik 15 mL sentrifuge.</li>
	<li>Sentrifuge 200 x g for 4 min til pellets cellene. Sakte Sug opp nedbryting, ta vare ikke for å dislodge pellet. Å avbryte pellet 5 mL av medium.</li>
	<li>Overføre en 20 µL aliquot av cellen suspensjon til en ren hemocytometer og telle celler ved hjelp av et mikroskop med en 10 X linsen.</li>
	<li>Forberede cellene eksplosjonen ved å plassere tre 35 mm retter i en 90 mm rett. Merk dem korrekt. Legg 2 mL av medium til hver 35 mm rett og frø totalt 5 x 10 4 celler per parabol, distribuere cellene jevnt rundt parabolen. Inkuber eksperimentelle prøvene overnatter i standard oppdrettsforholdene å tillate tilstrekkelig celle vedlegg før sjokkbølgen eksponering. 
	Merk: For fluorescerende imaging,-cellene må være seeded til sterilt glass coverslips.</li>
</ol> 2. Sjokk rør montering <img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55618/55618fig2.jpg" /> figur 2 : EVOC rigg og sjokk rør montering. (A) bilde av EVOC riggen. (B) skjematisk av sjokk tube apparater. Sjokk tube dimensjonene inkluderer en indre diameter på 59 mm og en total lengde, inkludert EVOC riggen 4.13 m. Drevet røret og EVOC riggen totalene 2,71 m. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55618/55618fig2large.jpg" target="_blank"> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<ol><li>Ha stål tå arbeid støvler og en laboratoriet frakk under monteringsprosedyrer.</li>
	<li>Sett inn de to justeringslinjer gjennom to skruehull funnet i horisontalplanet av uttaket flensen. Plasser et nitril-gummi pakning ark over ende av justeringslinjer slik at det sitter mellom stikkontakt flens og ex vivo orgel kultur (EVOC) riggen. 
	Merk: EVOC riggen er spesialdesignet beregnet for bruk med 35 mm Petri retter ( figur 2A).</li>
	<li>Knytter EVOC riggen til uttaket flensen av sjokk røret ved å skyve kampen over justeringslinjer, sikre at det orientert riktig slik at delen som inneholder Petriskål ligger på sin base.</li>
	<li>Inn fire M24 bolter og skiver gjenværende hullene. Plasser nøtter slik at de berører flensen.</li>
	<li>Tett feste muttere og bolter sekvensielt i en diagonalt symmetrisk mote mens visuelt kontrollere at EVOC rigg og sjokk røret har ble justert.</li>
	<li>Knytter et trykktransduceren til EVOC riggen og koble den til gjeldende kilden ved hjelp av en følerledning. Deretter bruker en BNC-kabel, kobler den gjeldende kilden til oscilloskop.</li>
	<li>Sikrer at alle løslate ventiler og flyte kontroller på sjokk røret er stengt. Åpne innebygd ekstern trykkluft linjen og manuelt slå trykkregulatoren klokken å lade releet til 2,5 Språklinje</li>
	<li>Åpne tryggere ventilen på komprimert gass flasken ved å vri det mot urviseren 180°.</li>
	<li>Langsomt slå trykkregulatoren, ligger over gass flasken, klokken for å øke trykket for ca 15 Språklinje 
	Merk: Innstillingen poenget med denne regulator bør være litt over den høyeste sprengning presset av den tykkeste membranen som skal brukes i eksperimentet.</li>
	<li>Forberede stråling ved å kutte 0.125 mm tykt plast ark i 10 cm x 10 cm firkanter. 
	Merk: Tykkelsen av mellomgulvet vil koordinere med sprengning trykket, endre topp trykket av sjokk bølge (dvs. en tykkere membran vil resultere i et sjokk bølge med en større topp trykket; Tabell 1).</li>
</ol> < tabell fo:keep-together.within-side = "1" > <tbody><tr><td>Mylar membran dimensjoner (cm)</td> <td>brast Press (bar)</td> <td>Sensor 3 området (kPa)</td></tr> <tr><td>10 x 10 x 0.023</td> <td>2 + 0,2</td> <td>47 ± 7.5</td></tr> <tr><td>10 x 10 x 0.050</td> <td>4 ± 0,2</td> <td>72 ± 7.5</td></tr> <tr><td>10 x 10 x 0.125</td> <td>9,5 ± 0,5</td> <td>127 ± 12,5</td></tr></tbody> < /t kan > tabell 1: Burst press tilsvarende membran tykkelse og topp trykket.
<ol start="11"> <li>opprette håndtak av bånd, fikse dem til toppen og bunnen av membranen og bruke dem til plasser membranen ved foran liten flensen ved breech kammeret. Kontroller at membranen er rett og riktig posisjonert før du lukker breech.</li>
	<li>Sikre dette bruker fire M24 bolter og muttere. Tett feste muttere og bolter sekvensielt i en diagonalt symmetrisk mote.</li>
</ol> 3. Utarbeidelse av celler bare tidligere sjokkbølgen eksponering <ol><li>forberede vev laminær strømning hette ved å utføre ultrafiolett sterilisering. Rengjøre den med en desinfiserende løsning og 70% etanol. Samle alle elementene som trengs for håndtering celler tidligere å/post-shock wave eksponering og plasser dem innenfor sterilt panseret. 
	Merk: Dette inkluderer fersk medium, selvklebende gass permeabel membraner, sterile saks, Pipetter og pipette tips.</li>
	<li>Overføre en 90 mm Petriskål inneholder tre eksperimentelle prøver fra inkubator til sterilt panseret.</li>
	<li>Kuttet en selvklebende gass-gjennomtrengelig membran ark (se Tabell for materiale i seks ruter, slik at hver er stor nok til å dekke øverst på en 35 mm Petriskål).</li>
	<li>Sug opp mediet 35 mm Petriskål sett lokket til side og dekk med to selvklebende gass permeabel membraner deler, slik at det er en tett forsegling mellom membranen og kanten av parabolen.</li>
	<li>Overføre prøven til EVOC riggen og sikre den til bunnen av kampen slik at toppen av fatet justeres med indre base av sjokk røret.</li>
</ol> 4. Sjokk Tube drift <ol><li>ha øret forsvarere, vernebriller, sikkerhet støvler og en laboratoriet frakk når pressurizing sjokk undergrunnssystemet.</li>
	<li>Drei kontrollknappen flyt på regulator klokken, gassen flyter i fleksible slangen koble trykkluft sylinderen til sjokk røret.</li>
	<li>Nederst i Kontrollpanel, Velg den &#34; doble Breech &#34; åpning for en kort varighet sjokk wave eller &#34; driveren Tube &#34; åpning for en økt bølge varighet.</li>
	<li>Bryter på DC-strømkilde og oscilloskop å erverve bølgeform data. Angi oscilloskop samplingsfrekvensen til 50.0 MS/s, med en rekord lengde på 1 M poeng. Angi en 50 mV for skyting på 2 bar og 100 mV for over 4 Språklinje</li>
	<li>Slå på sikkerhet lyset bryteren på veggen overfor kontrollpanelet. 
	Merk: Dette forteller andre forskere ikke å gå inn i rommet under sjokket røret er lading.</li>
	<li>Slå på bryteren på solenoid kontroll for å lukke releet. 
	Merk: Denne sikkerhetsfunksjon lukker en ventil ligger på dobbel breech kammeret, slik at systemet skal belastes.</li>
	<li>På kontrollpanelet, sakte åpner flytkontrollen ved å vri på bryteren mot klokken for å gradvis øke trykket i kompresjon kammeret. Overvåke trykket bruke kontrollpanelet.</li>
	<li>Når membranen brast press er nådd, membranen vil brudd og &#34; bang &#34; vil bli hørt. Raskt Lukk flytkontrollen ved å vri på bryteren. 
	Merk: Sjokkbølgen reiser ned røret over cellen prøven og ut slutten av røret.</li>
	<li>Åpne releet ved å slå av bryteren på boksen solenoid kontroll og slå av sikkerhet lyset (med bryteren på veggen overfor kontrollpanelet).</li>
	<li>Overføre celle prøven til sterilt panseret, fjerne selvklebende gass permeabel membraner og fylle fatet med 2 mL frisk oppblomstringen medium. Cellene kan brukes umiddelbart for vurdering, som beskrevet i trinn 5, eller tilbake til inkubator for langsiktige studier.</li>
</ol> 5. Celle levedyktighet <ol><li>vurdere celle levedyktighet etter sjokkbølgen eksponering med kombinasjonen av en redoks indikator analysen og fluorescerende avbilding av levende og døde celler. 
	Merk: For fluorescerende imaging, cellene må være seeded til sterilt glass coverslips under avsnitt 1: celle kultur og prøve forberedelse. Dette kan plasseres innenfor 35 mm petri retter.</li>
	<li>Overføre 200 µL av redoks indictor reagensen (se Tabell of Materials) til hver eksperimentelle rett direkte etter fylle dem med 2 mL middels etter sjokk bølge eksponering. Ruge på standard kultur betingelser for 4 h.</li>
	<li>For hver rett, overføre (i mørke sterilt hette) 2 x 100 µL dele til enten en svart eller fjern 96-brønns plate, avhengig av om fluorescens eller absorbansen skal brukes til å vurdere levedyktighet.</li>
	<li>Overføre 96-brønns platen til en passende plate leser utstyrt med riktige filtrene og leste bruker eksitasjon band 530ex/590em for fluorescens eller 570 nm kombinert med 600-nm referanse for absorbance. Eksportere og lagre dataene.</li>
	<li>Analysere dataene for å identifisere noen forskjell mellom sjokk bølge-eksponerte prøver og ikke-utsatt kontroller, som dette kan indikere en dråpe i cellen levedyktighet. 
	Merk: En negativ kontroll bør også inkluderes i eksperimentell design. Videre interpolering av en standardkurve kan brukes til å beregne cellen tallene.</li>
	<li>Sug opp mediet som inneholder redoks indikator reagensen. Erstatte den med 2 mL av fersk medium og Inkuber cellene på standard oppdrettsforholdene for 24 h.</li>
	<li>Gjenta fremgangsmåten ovenfor trenger for å få en andre levedyktighet punkt.</li>
	<li>For fluorescerende avbilding av levende og døde celler, Sug opp mediet og vaske cellene to ganger i 1 mL av PBS. Overføre 100 µL av komplett reagensen i avbilding kit (se Tabell of Materials) til hvert utvalg og Inkuber ved romtemperatur beskyttet fra lys for 15 min.</li>
	<li>Sug opp reagensen og vaske når bruker 1 mL av PBS. Bruker fin spiss tang, nøye fjerne dekkglassvæske fra 35 mm rett og sett den ned på et glass mikroskopi lysbilde.</li>
	<li>Hent bilder for hvert utvalg med fluorescerende mikroskop (10 X linsen, 0,50 numeriske blenderåpning) utstyrt med riktig eksitasjon og utslipp filtrene (ex / em 488 nm/515 nm og 570 nm/602 nm). 
	Merk: Lever celler vil avgi intens, uniform, grønn fluorescens. Død eller døende celler med en kompromittert mobilnettet membran vil opptak komponenten døde kit, som resulterer i utslipp av røde fluorescens, funnet hovedsakelig i regionen kjernefysiske cellen.</li>
	<li>Bruke bildeanalyser programvare enten manuelt eller automatisk telle antall levende og døde celler fra hvert bilde.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Proud, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physical+basis+of+explosion+and+blast+injury+processes.">The physical basis of explosion and blast injury processes.</a> J R Army Med Corps. 159, 4-9 (2013).</li><li>Born, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blast+Trauma:+The+Fourth+Weapon+of+Mass+Destruction.">Blast Trauma: The Fourth Weapon of Mass Destruction.</a> Scand J of Surg. 94 (4), 279-285 (2005).</li><li>Kocsis, J. D., Tessler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathology+of+blast-related+brain+injury.">Pathology of blast-related brain injury.</a> J Rehabil Res Dev. 46 (6), 667-671 (2009).</li><li>Bass, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+Injuries+from+Blast.">Brain Injuries from Blast.</a> Ann Biomed Eng. 40 (1), 185-202 (2012).</li><li>Cernak, I., Kobeissy, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+Neurotrauma:+Molecular,+Neuropsychological,+and+Rehabilitation+Aspects.">Brain Neurotrauma: Molecular, Neuropsychological, and Rehabilitation Aspects.</a> Frontiers in Neuroengineering. , (2015).</li><li>Alfieri, K. A., Forsberg, J. A., Potter, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blast+injuries+and+heterotopic+ossification.">Blast injuries and heterotopic ossification.</a> Bone Joint Res. 1 (8), 174-179 (2012).</li><li>Potter, B. K., Burns, T. C., Lacap, A. P., Granville, R. R., Gajewski, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterotopic+Ossification+Following+Traumatic+and+Combat-Related+Amputations.+Prevalence,+Risk+Factors,+and+Preliminary+Results+of+Excision.">Heterotopic Ossification Following Traumatic and Combat-Related Amputations. Prevalence, Risk Factors, and Preliminary Results of Excision.</a> J Bone Joint Surg Am. 89 (3), 476-486 (2007).</li><li>Sasser, S. M., Sattin, R. W., Hunt, R. C., Krohmer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blast+Lung+Injury.">Blast Lung Injury.</a> Prehosp Emerg Care. 10 (2), 165-172 (2006).</li><li>Cho, S. -. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+Hearing+Loss+after+Blast+Injury+to+the+Ear.">Mechanisms of Hearing Loss after Blast Injury to the Ear.</a> PLoS ONE. 8 (7), 67618 (2013).</li><li>Bull, M. A., Clasper, J., Mahoney, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Blast Injury Science and Engineering: A Guide for Clinicians and Researchers. , (2016).</li><li>Arun, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+blast+traumatic+brain+injury+using+in-vitro+model+with+shock+tube.">Studies on blast traumatic brain injury using in-vitro model with shock tube.</a> Neuroreport. 22 (8), 379-384 (2011).</li><li>Ahlers, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+the+effects+of+acute+and+repeated+exposure+to+blast+overpressure+in+rodents:+toward+a+greater+understanding+of+blast+and+the+potential+ramifications+for+injury+in+humans+exposed+to+blast.">Assessment of the effects of acute and repeated exposure to blast overpressure in rodents: toward a greater understanding of blast and the potential ramifications for injury in humans exposed to blast.</a> Front Neurol. 3, 32 (2012).</li><li>Polfer, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+a+rat+model+to+investigate+the+formation+of+blast-related+post-traumatic+heterotopic+ossification.">The development of a rat model to investigate the formation of blast-related post-traumatic heterotopic ossification.</a> Bone Joint J. 97 (4), 572-576 (2015).</li><li>Miller, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Blast+Overpressure+on+Neurons+and+Glial+Cells+in+Rat+Organotypic+Hippocampal+Slice+Cultures.">Effects of Blast Overpressure on Neurons and Glial Cells in Rat Organotypic Hippocampal Slice Cultures.</a> Front Neurol. 6, 20 (2015).</li><li>Chandra, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+blast+wave+profiles+in+simulated+air+blasts:+experiment+and+computational+modeling.">Evolution of blast wave profiles in simulated air blasts: experiment and computational modeling.</a> Shock Waves. 22 (5), 403-415 (2012).</li><li>Kuriakose, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tailoring+the+Blast+Exposure+Conditions+in+the+Shock+Tube+for+Generating+Pure,+Primary+Shock+Waves:+The+End+Plate+Facilitates+Elimination+of+Secondary+Loading+of+the+Specimen.">Tailoring the Blast Exposure Conditions in the Shock Tube for Generating Pure, Primary Shock Waves: The End Plate Facilitates Elimination of Secondary Loading of the Specimen.</a> PLoS ONE. 11 (9), 0161597 (2016).</li><li>Reneer, D. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Multi-Mode+Shock+Tube+for+Investigation+of+Blast-Induced+Traumatic+Brain+Injury.">A Multi-Mode Shock Tube for Investigation of Blast-Induced Traumatic Brain Injury.</a> J Neurotrauma. 28 (1), 95-104 (2011).</li><li>VandeVord, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Up-regulation+of+reactivity+and+survival+genes+in+astrocytes+after+exposure+to+short+duration+overpressure.">Up-regulation of reactivity and survival genes in astrocytes after exposure to short duration overpressure.</a> Neurosci Lett. 434 (3), 247-252 (2008).</li><li>Kane, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+gene+expression+in+cultured+microglia+in+response+to+simulated+blast+overpressure:+Possible+role+of+pulse+duration.">Altered gene expression in cultured microglia in response to simulated blast overpressure: Possible role of pulse duration.</a> Neurosci Lett. 522 (1), 47-51 (2012).</li><li>Nienaber, M., Lee, J. S., Feng, R., Lim, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impulsive+pressurization+of+neuronal+cells+for+traumatic+brain+injury+study.">Impulsive pressurization of neuronal cells for traumatic brain injury study.</a> J Vis Exp. (56), (2011).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+Profiling+in+Rat+Hair+Follicles+following+Simulated+Blast+Insult:+A+New+Diagnostic+Tool+for+Traumatic+Brain+Injury.">Transcriptional Profiling in Rat Hair Follicles following Simulated Blast Insult: A New Diagnostic Tool for Traumatic Brain Injury.</a> PLoS ONE. 9 (8), 104518 (2014).</li><li>Bo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+characterization+of+compression-induceddamage+in+live+biological+samples.">Cellular characterization of compression-induceddamage in live biological samples.</a> AIP Conf Proc. 1426 (1), 153-156 (2012).</li><li>Tannous, O., Griffith, C., O'Toole, R. V., Pellegrini, V. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterotopic+ossification+after+extremity+blast+amputation+in+a+Sprague-Dawley+rat+animal+model.">Heterotopic ossification after extremity blast amputation in a Sprague-Dawley rat animal model.</a> J Orthop Trauma. 25 (8), 506-510 (2011).</li><li>Chen, Y. C., Smith, D. H., Meaney, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-Vitro+Approaches+for+Studying+Blast-Induced+Traumatic+Brain+Injury.">In-Vitro Approaches for Studying Blast-Induced Traumatic Brain Injury.</a> J Neurotrauma. 26 (6), 861-876 (2009).</li><li>Nguyen, T. T. N., Wilgeroth, J. M., Proud, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+blast+wave+generation+in+a+shock+tube+for+biological+applications.">Controlling blast wave generation in a shock tube for biological applications.</a> JPCS. 500 (14), 142025 (2014).</li></ol>

Forfatterne har ingen konkurrerende økonomiske interesser.

Primære skader fra eksponering for blast hendelser er ennå ikke fullt ut forstått. Identifisere og forstå mekanismene som utløser blast-indusert skader, som traumatisk brain skader3,er4 og heterotopic forbening6,7, viktig første skritt for å utvikle effektive metoder for profylakse. For å oppnå dette målet, er en rekke eksperimentelle systemer utviklet for å replikere blast hendelsen eksponering11,12,13,14,18,19 . Teknikken er beskrevet bruker her sjokk tube utstyr (figur 2) kan skyte sjokkbølger på en rekke press på hele kroppen (dvs. gnagere), vev eller cellen prøver. Muligheten til å laste individuelle celletyper i stedet for hele vev gir muligheten til å sortere ut forskjellige mobilnettet svar, som skader kan oppstå samtidig via en rekke mekanismer1,2. For eksempel for å modellere traumatisk kan hjerneskade, vurdering av individuelle celletyper, for eksempel neurons og astrocyttene, gi identifikasjon av celle-spesifikk skade. Også kan hele-orgel svaret vurderes ved hjelp av hjernevev. Både de enkelte celletyper og vevsprøver har verdi og kan gi ulik informasjon. Det er også mulig å endre mengden luft som er under trykk å generere sjokk ved å velge double-breech eller driver-tube innløpet. Kontrollerer varigheten av sjokk bølge. En annen mulighet er å endre membran materialet og tykkelse du vil endre topp trykket25.
En annen faktor å vurdere er forstyrrelser slutten effekter som kan være til stede når prøven huset ligger nær avkjørselen til sjokk røret, som man finner på EVOC riggen beskrevet i systemet. Chandra et al. så på blast bølge Profiler funnet på forskjellige steder på en komprimering-drevet sjokk rør og fant at Friedlander bølgeform beste var representert på et sted dypt inne sjokk tube15. Kuriakose et al. også studert andre lasting av utvalget og fant at plasseringen av en enden plate på slutten av sjokk røret kunne eliminere uønskede reflekterte bølger16. Vurderer dataene finnes i disse publikasjoner15,16, modifikasjoner å forbedre sjokk rør systemet beskrevet i denne artikkelen kan omfatte plassering av EVOC riggen en dypere sted innenfor drevet røret eller, Alternativt inkludering av en enden plate på sjokk røret. Begrensninger av metoden beskrevet kan være relativt lav gjennomstrømningen av prøver. En enkeltbruker kan operere sjokk røret trygt på en produksjon av rundt 6-8 prøver per time. Foreløpig er systemet designet rundt bruk av enkelt 35 mm petri retter. Derfor kan større eksperimenter som inneholder flere grupper og biologiske gjentak være vanskelig å oppnå.
Denne metoder artikkelen viser hvordan levedyktigheten til tilhenger dermal papilla celler var påvirket av eksponering for et enkelt sjokk bølge. En kort varighet sjokkbølge (&#60; 10 ms) av ≤72 kPa ikke påvirke levedyktighet sammenlignet med kontrollen (Figur 3 og Figur 4). Derimot stimulert en sjokkbølge på 127 kPa en betydelig nedgang i levedyktighet på 24 timer etter blast, som vist av både redoks indikator analysen (Figur 3) og fluorescerende bildeanalyser (Figur 4). Miller et al. rapportert en tilsvarende reduksjon i cellen levedyktighet i rotte organotypic hippocampus skive kulturer når celler ble utsatt for enten en 147 kPa eller 278 kPa sjokkbølge med en åpent, helium-drevet sjokk tube14. I kontrast, VandeVord et al. rapportert at det var ingen effekt på levedyktighet i rotte astrocyttene og utsatt for en kort varighet overtrykk av &#62; 200 kPa, selv en barochamber ble brukt i stedet for en støt tube18. Det bør bemerkes at det ytre presset er avhengig av blast bølgen, selv om dette oppretter komplekse stress bølger i kroppen, derfor gjør innholdet i lasting svært avhengig av mekaniske egenskaper for vev eller cellen. Det kreves ekstra karakterisering studier av cellulær respons til blast hendelser. Videre ved å vurdere sjokkbølgen eksponering på cellenivå, som vist i denne teknikken, kan biologiske respons utløst fra skaden, som forstyrrelsene signalnettverk trasé eller epigenetic endringer identifiseres og utforsket ytterligere.
Avslutningsvis beskriver dette verket bruken av et rustfritt stål sjokk rør og en modifisert EVOC rigg å innlemme primært cellekulturer. Sjokkbølger på en rekke press kan genereres og overført over lever celler å gjenskape effekten som oppstår fra eksponering til en eksplosjon. Denne protokollen demonstrerer hvordan å vurdere celle levedyktighet, men langsiktige endringer i individuelle celletyper kan også studeres. Fremover, planlegger vi å vurdere differensial effektene komplekse sjokkbølger kan framprovosere i ulike celletyper, med sikte på å fremme vår forståelse av blast-indusert primære skader.

Med den siste trenden mot bruk av improviserte eksplosive enheter i moderne krigføring og terrorist handlinger på sivile, forstå effektene av eksplosiv hendelser på menneskekroppen er av stor betydning. Skader fra eksponering for blast hendelser kan være dødelige og dødelige, med fysiske prosesser for skade delt inn i fire kategorier. Primære skader resultatet fra direkte eksponering til blast bølgen, som kommuniserer lokalt med kroppen i en kompresjons og senere ekspansive måte, forårsaker avbrudd i membraner og bløtvev1. Sekundær skadene inkluderer stumpe traumer eller penetrative sår forårsaket av påvirkning med lav masse objekter drevet i høy hastighet av blast bølgen. Tertiær skader oppstår når blast bølgen har nok energi til å kaste objekter av høye massen eller enkeltpersoner mot objekter. Til slutt, kvartær eksplosjon skader er definert av andre diverse skader som ikke passer de andre kategoriene, for eksempel flash burns2. Etter eksponering for slike blast hendelser inkluderer primære skader traumatisk brain skader3,4,5, heterotopic forbening6,7, blast lungen skade8, tap av hørsel 9og andre10.
En ofte observert bølgeform fra blast hendelser er Friedlander bølgen, som representerer en gratis-feltet, i motsetning til en lukket-plass, eksplosjon. Bølgeform består av en eksplosjon front som kan defineres som en skarp og rask økning i positivt trykk. Dette er etterfulgt av en eksplosjon vind av luft beveger seg i høy hastighet og en løslate bølge som reduserer trykket til under atmosfæriske nivåer. En delvis vakuum er igjen i regionen i den første eksplosjonen, som resulterer i sakte tilbakestrømming av luft. De positive og negative fasene av wave (figur 1A) resultere i push-pull bevegelsen av blast bølge1. For å belyse mekanismene bak primære eksplosjon skader, er eksperimentelle modeller opprettet for å produsere bølgeformer, for eksempel Friedlander bølge, som celler og vev vil møte når de utsettes for en ekte blast hendelsen. Gjeldende systemene oppført i litteraturen inneholder sjokk rør11,12,13,14,15,16,17, barochambers18,19, ofrene bar20, avansert blast simulatorer21, delt Hopkinson press bar22og gjenopprettingen av alternative blast hendelser i et kontrollert miljø ved hjelp av pentaerythritol tetranitrate23. Til tross for det store utvalget av modeller tilgjengelig påvirke mange variabler skaden fra blast bølger, inkludert pre stress på, og mekaniske egenskaper av, personlige celletyper eller vev under evaluering24. Mens studier av vev eller organer kan belyse vevet deformasjon og brutto morfologiske endringer påført som følge av eksplosjonen hendelser, kan analyse på cellenivå avdekke transcriptional og epigenetic endringer påvirket av sjokk bølge.
Denne metoder artikkelen beskriver en teknikk for å overføre sjokkbølger på en rekke press over levende celler i en monolayer. Dette gir umiddelbar karakterisering av cellen levedyktighet, Klargjørende potensiell skade terskler fra sjokkbølger. Videre levedyktige cellers kan returneres til standard oppdrettsforholdene, og langsiktig biologiske effekter fra hendelsen blast kan vurderes. Protokollen nedenfor beskriver to cellen levedyktighet teknikker som kan brukes på celler i kultur.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55618/55618fig1.jpg"> 
Figur 1: Tilnærming til en Friedlander bølge. (A) en tilnærming av en Friedlander bølge observert på sensoren 3 sjokk røret. (B) representant data som viser forskjellige press profilene observert sensorer 1, 2 og 3 på sjokk røret. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55618/55618fig1large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1124">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td>MEM &#945;, nucleosides</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>22571020</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>Fetal Bovine Serum, certified, US origin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>16000044</td>
			<td>Supplement to create complete growth media.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>Penicillin-Streptomycin&#160;</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15070-063</td>
			<td>Supplement to create complete growth media.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15400-054</td>
			<td>Dilute 1 in 10 before use.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>CytoOne T-75 Flask, TC-Treated, vented</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>CC7682-4875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>TC Dish (PS) 35mm, 8.5 cm2</td>
			<td>Triple Red</td>
			<td>TCD010035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>Petri dish (PS) 90x14.2mm no vent</td>
			<td>VWR UK</td>
			<td>391-0453&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>Gas Permeable Adhesive Plate Seals</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AB-0718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>LIVE/DEAD Cell Imaging Kit (488/570)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>R37601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>Alamarblue cell viability reagent</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13494309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>Virkon tablets</td>
			<td>VWR UK</td>
			<td>115-0020</td>
			<td>Use to create 2% solution as viability control reagent.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>Dumont forceps</td>
			<td>SurgicalTools</td>
			<td>11295-10</td>
			<td>Use to remove coverslips from petri dish.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>Cover glass, square</td>
			<td>VWR UK</td>
			<td>631-0125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>Microscope slides</td>
			<td>VWR UK</td>
			<td>631-1553</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>96 Well plate, solid black</td>
			<td>AppletonWoods</td>
			<td>CC760</td>
			<td>Plate to be used for fluorescence measurements.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>96 Well plate, clear, (PS)</td>
			<td>VWR UK</td>
			<td>734-1799</td>
			<td>Plate to be used for absorbance measurments.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>Leica DMi1 Camera stand outfit</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td>Optical microscope used for cell culture.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>Zeiss PALM MicroBeam Laser Capture Microdisseciton</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Fluorescence microsope used for LIVE/DEAD imaging.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>EnVision Multilabel Reader</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>2104-0010A</td>
			<td>Plate reader to be used for fluorescence/absorbance readings.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td>Mylar Electrical &#38; Chemical Insulating Film, 304mm x 200mm x 0.023mm&#160;</td>
			<td>RS Components</td>
			<td>785-0782</td>
			<td>Use to create shock tube diaphragm.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td>Mylar Electrical &#38; Chemical Insulating Film, 304mm x 200mm x 0.05mm&#160;</td>
			<td>RS Components</td>
			<td>785-0786</td>
			<td>Use to creatw shock tube diaphragm.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td>Mylar Electrical &#38; Chemical Insulating Film, 304mm x 200mm x 0.125mm&#160;</td>
			<td>RS Components</td>
			<td>785-0798</td>
			<td>Use to create shock tube diaphragm.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>Current source power unit</td>
			<td>Dytran Intruments Inc.</td>
			<td>4103C</td>
			<td>Power source for 2300V1 sensor.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>IEPE Pressure Sensor</td>
			<td>Dytran Intruments Inc.</td>
			<td>2300V1</td>
			<td>Pressure sensor located on shock tube.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>Digital Phosphor Oscilloscope</td>
			<td>Tektronix</td>
			<td>DPO 4104B</td>
			<td>Use to gather and save sensor 2300V1 data.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluating primary blast effects in vitro

Eksponering for blast hendelser kan forårsake alvorlige traumer til vitale organer som lunger, ører og hjerne. Forstå mekanismene bak slike blast-indusert skader er av stor betydning vurderer den siste trenden mot bruk av eksplosiver i moderne krigføring og terrorist-relaterte hendelser. Å fullt ut forstå blast-indusert skade, må vi først kunne replikere slike blast hendelser i et kontrollert miljø benytter en reproduserbar metode. I denne teknikken bruker sjokk tube utstyr, sjokkbølger på en rekke press kan overføres over levende celler dyrket i 2D og markører for cellen levedyktighet kan umiddelbart analyseres ved hjelp av en redoks indikator analysen og fluorescerende avbilding av levende og døde celler. Denne metoden har vist at økende toppen blast overtrykk til 127 kPa kan stimulere en betydelig nedgang i cellen levedyktighet sammenlignet med ubehandlet kontroller. Test prøver er ikke begrenset til tilhenger celler, men kan inkludere celle suspensjoner, hele kroppen og vev prøver, gjennom små endringer til sjokk tube oppsett. Det er vanskelig å replikere eksakte betingelsene vev og celler opplevelse når de utsettes for en ekte blast hendelsen. Teknikker som den som presenteres i denne artikkelen kan hjelpe å definere skade terskler og identifisere transcriptional og epigenetic endringer i celler som oppstår fra sjokkbølgen eksponering.

Med metoden beskrevet ovenfor ble celler dyrket i en monolayer utsatt i tre eksemplarer til sjokkbølger generert ved hjelp av et sjokk rør (figur 2B). Markører for cellen levedyktighet ble vurdert. Bruker en redoks indikator analysen, ble det funnet at anvendelse av en 127 kPa sjokkbølge kunne redusere levedyktigheten til dermal papilla celler sammenlignet med kontrollene etter 24 h i kultur (Figur 3). Anvendelsen av en sjokkbølge ≤72 kPa redusere ikke levedyktighet. For å støtte disse observasjonene, brukte en fluorescerende bilde analysen kan fluorescently merking levende eller døde celler med grønn eller rød fluorophores, henholdsvis. Kvantifisering av levende og døde celler fra 13 fluorescerende bilder per biologiske replikere demonstrert en reduksjon i cellen levedyktighet i de utsatt for 127 kPa sjokk bølge sammenlignet med kontrollen (Figur 4). Statistisk analyse ble gjennomført med en enveis ANOVA etterfulgt av Tukeys flere sammenligningen test, med p &#60; 0,05 ansett som statistisk signifikant. Utvalgsstørrelsen per gruppe utgjorde 9 for redoks indikator analysen og 39 for kvantitative fluorescens tenkelig analyse.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55618/55618fig3.jpg"> 
Figur 3 : Redox indikatordata analysen viser gang løpet av celle levedyktighet etter sjokkbølgen eksponering. Betydelig ble færre celler observert etter 24 h i 127-kPa sjokk bølge-eksponerte gruppen sammenlignet med kontrollen ubehandlet. Kontrollen negative som besto av en 30-s behandling med 2% desinfeksjonsmiddel (se tabell for materiale) viste betydelig færre celler både T0 og 24 h sammenlignet med alle andre grupper. Hver stolpe representerer gjennomsnittlig ± 1 standardavviket (SD); biologiske gjentak, N = 3; teknisk replikerer, n = 3. = p &#60; 0,0001. * = p &#60; 0,05. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55618/55618fig3large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55618/55618fig4.jpg"> 
Figur 4 : Fluorescens Imaging. (A) kvantitative data samlet fra fluorescerende bilder av levende og døde celler tatt ved hjelp av fluorescens mikroskop på 24 timer etter sjokkbølgen eksponering. Betydelig færre levedyktig celler ble observert i de 127 kPa (mener = 93.42) sjokk bølge-eksponerte eksempel sammenlignet den 47 kPa (mener = 98.18), 72 kPa (mener = 98.87), og kontroll grupper (mener = 99.10). Noen levedyktig celler ble observert på negative kontrollgruppen etter 24 h (mener = 0). (B) representant fluorescens bilder. Grønt viser live celler, mens røde viser døde celler. Hver boks tomten viser de øvre og nedre kvartiler med Tukey værhår; biologiske gjentak, N = 3; teknisk replikerer, n = 13. = p &#60; 0,0001. Skala bar = 300 µm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55618/55618fig4large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Evaluating Primary Blast Effects In Vitro at JoVE.com

Evaluating Primary Blast Effects In Vitro

Forstå hvordan celler er modulert av eksponering for sjokkbølger kan bidra til å identifisere mekanismene bak skader utløst fra blast hendelser. Denne protokollen bruker spesialbygde sjokk tube utstyr bruke sjokkbølger på en rekke press på cellen monolayers og identifisere påfølgende virkningene på cellen levedyktighet.

Evaluering primære Blast effekter In Vitro

Exposure to blast events can cause severe trauma to vital organs such as the lungs, ears, and brain. Understanding the mechanisms behind such ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Evaluating Primary Blast Effects In Vitro

Microfluidic Device for Recreating a Tumor Microenvironment in Vitro

Microfluidic Device for Recreating a Tumor Microenvironment in Vitro

We have developed a microfluidic device that mimics the delivery and systemic clearance of drugs to heterogeneous three-dimensional tumor tissues in ...

Low Molecular Weight Protein Enrichment on Mesoporous Silica Thin Films for Biomarker Discovery

Lavmolekylært Protein berikelse på mesoporous silika Thin Films for biomarkører

The identification of circulating biomarkers holds great potential for non invasive approaches in early diagnosis and prognosis, as well as for the ...

Harvesting Murine Alveolar Macrophages and Evaluating Cellular Activation Induced by Polyanhydride Nanoparticles

Høsting murint alveolære makrofager og evaluere Cellular Aktivering indusert av Polyanhydride Nanopartikler

Biodegradable nanoparticles have emerged as a  versatile platform for the design and implementation of new intranasal vaccines  against respiratory ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

Øyeirritasjonstest (EIT) for fareidentifikasjon for Eye irriterende kjemikalier som bruker Rekonstruert Menneskelig Hornhinnen lignende Epithelial (RHCE) Tissue Modell

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Microfluidic Flow Chambers Bruke Rekonstituert Blood Model Hemostase og platetransfusjon<em&gt; In Vitro</em

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of ...

Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

anvendelser av<em&gt; I Vivo</em&gt; Functional Testing av Rat tibialis anterior for Vurderer Tissue Konstruert Skeletal Muscle Reparasjon

Despite the regenerative capacity of skeletal muscle, permanent functional and/or cosmetic deficits (e.g., volumetric muscle loss (VML) resulting from ...

A Microfluidic Flow Chamber Model for Platelet Transfusion and Hemostasis Measures Platelet Deposition and Fibrin Formation in Real-time

En mikrofluid Flow Chamber Modell for platetransfusjon og Hemostase Måler blodplateavleiring og fibrindannelse i sanntid

Microfluidic models of hemostasis assess platelet function under conditions of hydrodynamic shear, but in the presence of anticoagulants, this analysis is ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

en<em&gt; In Vitro</em&gt; Organ Culture Modell av Murine mellomvirvelskive

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

Forbedret 3D Hydrogel kulturer av primære gliacellene for In Vitro modellering av Neuroinflammation

In the central nervous system, numerous acute injuries and neurodegenerative disorders, as well as implanted devices or biomaterials engineered to enhance ...

Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart

Lys arks fluorescens mikroskopi å ta 4-dimensjonale bilder av effektene av modulerende skjæring Stress på utvikle sebrafisk hjertet

The hemodynamic forces experienced by the heart influence cardiac development, especially trabeculation, which forms a network of branching outgrowths ...