Name: evaluating primary blast effects in vitro
Uploaded: 2017-09-18T12:30:00
Duration: 10 min 51 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluating Primary Blast Effects In Vitro at JoVE.com

Vi vill erkänna det ekonomiska stödet för Royal British Legion centrum för Blast skada studier till HA och finansiering från Vetenskapsrådet (M01858X/1) till CAH.

1. cellkultur och provberedning <ol><li>erhålla en lämplig cell fodrar (t.ex. dermal papilla celler). 
	Obs: Det nuvarande protokollet har utformats för vidhäftande celler, med råtta dermal papilla fibroblaster isolerade från vibrissae används som en modell.</li>
	<li>Odla cellerna i en T-75 kolv som innehåller minsta viktigt medium (MEM) α kompletteras med 10% fetalt bovint serum och 1% penicillin streptomycin. Hålla cellerna på standard odlingsbetingelser för 37 ° C och 5% CO 2 i en fuktig miljö tills de når 80% sammanflödet.</li>
	<li>Sug ut mediet och tvätta cellerna två gånger i Dulbecco &#39; s fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Separera celler från kolven genom inkubering i 2 mL av trypsin/EDTA på standard kultur villkor för 5 min. kort Kontrollera att se till att celler har framgångsrikt tagit från kolven med ljus/fas kontrast Mikroskop (med en 10 X-objektiv ).</li>
	<li>Lägga till 4 mL odlingsmedium att neutralisera trypsinization reaktionen. Överföra cellsuspensionen till en 15 mL centrifugrör.</li>
	<li>Centrifug på 200 x g i 4 min till pellet cellerna. Aspirera långsamt supernatanten, noga med att inte rubba pelleten. Resuspendera pelleten i 5 mL medium.</li>
	<li>Överför en 20 µL alikvot av cellsuspensionen till en ren hemocytometer och räkna cellerna med hjälp av ett mikroskop som är utrustat med en 10 X objektiv.</li>
	<li>Förbereda cellerna för explosionen av att placera tre 35 mm rätter i en 90 mm maträtt. Märk dem på lämpligt sätt. Tillsätt 2 mL av medium till varje 35 mm maträtt och utsäde sammanlagt 5 x 10 4 celler per maträtt, distribuera cellerna jämnt runt skålen. Inkubera experimentella proverna övernattning i standard odlingsbetingelser för adekvat cell fastsättning innan stötvågen exponering. 
	Obs: För fluorescerande imaging, celler måste vara seedad på sterilt glas coverslips.</li>
</ol> 2. Shock Tube församling <img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55618/55618fig2.jpg" /> figur 2 : EVOC rigg och Shock Tube montering. (A) bild på EVOC riggen. (B) Schematisk bild av shock tube apparaten. Shock tube dimensioner inkluderar en innerdiameter på 59 mm och en total längd, inklusive EVOC riggen, 4,13 m. Längden på det drivna röret och EVOC rigg summorna 2,71 m. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55618/55618fig2large.jpg" target="_blank"> vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.</a>
<ol><li>Bära stål tå arbetsstövlar och laboratorierock under monteringsprocedurer.</li>
	<li>Infoga fälten två justering genom två bulthålen hittade i horisontalplanet av utlopp fläns. Placera ett nitrilgummi packning ark över slutet på fälten justering så att det sitter mellan utlopp flänsen och ex vivo orgel kultur (EVOC) riggen. 
	Obs: EVOC riggen är en specialdesignad fixtur avsedd att användas med 35 mm petriskålar ( figur 2A).</li>
	<li>Bifoga EVOC riggen till outlet fläns chocken röret genom att skjuta fixturen över justering barer, att säkerställa att den är orienterad korrekt så att avsnittet som håller petriskål ligger vid dess bas.</li>
	<li>Sätt fyra M24 bultar och brickor i de återstående hålen. Placera muttrarna så att de vidrör flänsen.</li>
	<li>Tätt fäst muttrar och skruvar sekventiellt i en diagonalt symmetriska mode samtidigt visuellt kontrollera att EVOC rigg och chocken röret har framgångsrikt anpassat.</li>
	<li>Bifoga en tryckgivare till EVOC rigg och Anslut den till den aktuella källan använder en sensorkabel. Sedan, med en BNC-kabel, Anslut den aktuella källan till oscilloskopet.</li>
	<li>Se till att alla release ventiler och flow kontroller på chocken röret är stängda. Öppna den inbyggda externa tryckluftsledning och manuellt medurs tryckregulator att debitera solenoiden till 2,5 bar</li>
	<li>Öppna säkerhetsventilen på komprimerad gasolflaskan genom att vrida det moturs 180°.</li>
	<li>Vrid långsamt tryckregulator, ligger ovanpå gasolflaskan, medsols för att öka trycket till ca 15 bar 
	Obs: Inställningen poängen med denna regulator bör vara något ovanför den högsta sprack trycket av tjockaste membranet som ska användas i försöket.</li>
	<li>Förbereda membranen genom att skära en 0,125 mm tjock plastfolie i 10 x 10 cm rutor. 
	Obs: Tjockleken på membranet kommer att korrelera med sprängfyllda trycket, förändra peak trycket av stötvågen (dvs. en tjockare membran kommer att resultera i en chockvåg med ett större peak tryck; Tabell 1).</li>
</ol> < tabell fo:keep-together.within-sida = ”1” > <tbody><tr><td>Mylar membran mått (cm)</td> <td>brast tryck (bar)</td> <td>Sensor 3 tryckområde (kPa)</td></tr> <tr><td>10 x 10 x 0.023</td> <td>2 ± 0,2</td> <td>47 ± 7,5</td></tr> <tr><td>10 x 10 x 0,050</td> <td>4 ± 0,2</td> <td>72 ± 7,5</td></tr> <tr><td>10 x 10 x 0,125</td> <td>9,5 ± 0.5</td> <td>127 ± 12,5</td></tr></tbody> < t kan > tabell 1: sprack trycket motsvarande membran tjocklek och Peak tryck.
<ol start="11"> <li>skapa handtag av tejp, fixa dem till toppen och botten av membranet och använda dem för att noggrant placera membranet bredvid små frontytan sätesbjudning kammare. Säkerställa att membranet är raka och korrekt placerade innan du stänger sätesbjudning.</li>
	<li>Säkra detta med fyra M24 bultar och muttrar. Ordentligt fäst muttrar och skruvar sekventiellt i en diagonalt symmetriska mode.</li>
</ol> 3. Beredning av celler bara före chockvåg exponering <ol><li>Förbered en vävnad LAF genom att utföra ultraviolett sterilisering. Ren den med en desinficerande lösning och 70% etanol. Samla alla saker som behövs för hantering celler tidigare till/efter-shock wave exponering och placera dem inom sterila huven. 
	Obs: Detta inkluderar färska medium, självhäftande gas-högpermeabla membran, steril sax, pipetter och pipett tips.</li>
	<li>Överför en 90 mm petriskål som innehåller tre experimentella prover från inkubatorn till sterila huven.</li>
	<li>Skär ett självhäftande gas-högpermeabla membran blad (se Tabell för material i sex rutor, så att varje är tillräckligt stor för att täcka upp i en petriskål med 35 mm).</li>
	<li>Aspirera på medellång från 35 mm petriskål, placera locket på ena sidan och täck med två självhäftande gas-högpermeabla membran sektioner, säkerställa att det finns en tät förslutning mellan membranet och kanten av skålen.</li>
	<li>Överföra provet till EVOC riggen och säkra den på basen av armaturen så att toppen av skålen är i linje med den inre bas av chocken röret.</li>
</ol> 4. Shock Tube drift <ol><li>bära ear defenders, öga Glasögon, säkerhet stövlar och laboratorierock när tryckförvaring chock rörledningssystemet.</li>
	<li>Medurs flödesreglagevredet på regulatorn, tillåter gas att flöda in i flexibla slangen ansluta tryckluft cylindern till chock röret.</li>
	<li>Längst ned i Kontrollpanelen, Välj antingen den &#34; dubbla sätesbjudning &#34; inlopp för en kortvarig chock wave eller &#34; förare Tube &#34; inlopp för en ökad våg varaktighet.</li>
	<li>Switch på DC-strömkälla och oscilloskop att förvärva vågformsdata. Ställ in oscilloskopet samplingsfrekvensen till 50,0 MS/s, med ett rekord längd 1 m poäng. Ange en rad 50 mV för bränning på 2 bar och 100 mV för över 4 bar</li>
	<li>Aktivera säkerhet lamporna med växeln på väggen mittemot Kontrollpanelen. 
	Obs: Detta säger andra forskare inte att komma in i rummet när chocken röret laddas.</li>
	<li>Slå på strömbrytaren på rutan magnetventil kontroll att stänga solenoiden. 
	Obs: Denna säkerhetsfunktion stängs en ventil som ligger på dubbel sätesbjudning kammaren, vilket möjliggör systemet laddas.</li>
	<li>På Kontrollpanelen, öppna långsamt Flödeskontroll genom att vrida ratten moturs för att gradvis öka trycket i kompressionskammaren. Övervaka trycket med hjälp av kontrollpanelens display.</li>
	<li>När membranet sprack trycket nås, membranet kommer att brista och en &#34; bang &#34; hörs. Stäng snabbt Flödeskontroll genom att vrida vredet. 
	Obs: Stötvågen åker ner röret över cell provet och ut i änden av röret.</li>
	<li>Öppna solenoiden stänger växeln på rutan magnetventil kontroll av och Stäng av säkerhet ljuset (med växeln på väggen mittemot Kontrollpanelen).</li>
	<li>Transfer cell provet till sterila huven, ta bort de självhäftande gas-högpermeabla membran och fyll skålen med 2 mL färsk odlingsmedium. Cellerna kan användas omedelbart för bedömning, enligt beskrivningen i steg 5, eller återvände till inkubatorn för långsiktiga studier.</li>
</ol> 5. Cellviabilitet <ol><li>bedöma cellernas viabilitet efter chockvåg exponering med kombination av en redox indikator analysen och de fluorescerande avbildning av levande och döda celler. 
	Obs: För fluorescerande imaging, celler måste dirigeras till sterilt glas coverslips under avsnitt 1: Cell kultur och prov förberedelse. Dessa kan placeras inom de 35 mm Petriskålarna.</li>
	<li>Överföra 200 µL av redox indikatorn reagens (se Tabell för material) till varje experimentella skålen direkt efter påfyllning dem med 2 mL medium efter chock våg exponering. Inkubera vid standard odlingsbetingelser för 4 h.</li>
	<li>För varje maträtt, överföra (i mörka sterila huva) 2 x 100 µL portioner till antingen en svart eller avmarkera plattan med 96 brunnar, beroende på om fluorescens eller absorbansen ska användas för att bedöma lönsamheten.</li>
	<li>Överför plattan med 96 brunnar till en lämplig Plattläsare försedda med rätt filter och läsa med excitation band 530ex/590em för fluorescens eller 570 nm kombineras med en 600-nm referens för absorbans. Exportera och spara data.</li>
	<li>Analysera data för att identifiera eventuella skillnader mellan stötvåg-exponerade prover och icke-exponerade kontroller, eftersom detta kan indikera en droppe i cellernas viabilitet. 
	Obs: En negativ kontroll bör också ingå i experimentell design. Dessutom interpolering av en standardkurva kan användas för att beräkna cell nummer.</li>
	<li>Aspirera mediet som innehåller redox indikator reagensen. Ersätta det med 2 mL färsk medium och inkubera cellerna på standard odlingsbetingelser för 24 h.</li>
	<li>Upprepa ovanstående steg för att få en andra livskraft tidpunkt.</li>
	<li>För den fluorescerande imaging av levande och döda celler, sug ut mediet och tvätta cellerna två gånger i 1 mL PBS. Överför 100 µL av komplett reagens Funna i bildtagning kit (se Tabell för material) till varje prov och inkubera vid rumstemperatur skyddas från ljus för 15 min.</li>
	<li>Aspirera reagens och tvätta när med 1 mL PBS. Med fin punkt pincett, försiktigt bort täckglaset från 35 mm skålen och placera den nedåt på en glasskiva för mikroskopi.</li>
	<li>Skaffa bilder för varje prov med fluorescerande Mikroskop (10 X objektiv, 0.50 numerisk bländare) försedda med rätt magnetisering och utsläpp filter (ex / em 488 nm/515 nm och 570 nm/602 nm). 
	Obs: Levande celler avger intensiv, uniform, grön fluorescens. Döda eller döende celler med en komprometterad cellulära membran kommer upptag komponenten döda kit, som leder till utsläpp av röd fluorescens, finnas huvudsakligen i regionen kärnkraft i cellen.</li>
	<li>Använda bildanalys programvara antingen manuellt eller automatiskt räkna antalet levande och döda celler från varje bild.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Proud, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physical+basis+of+explosion+and+blast+injury+processes.">The physical basis of explosion and blast injury processes.</a> J R Army Med Corps. 159, 4-9 (2013).</li><li>Born, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blast+Trauma:+The+Fourth+Weapon+of+Mass+Destruction.">Blast Trauma: The Fourth Weapon of Mass Destruction.</a> Scand J of Surg. 94 (4), 279-285 (2005).</li><li>Kocsis, J. D., Tessler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathology+of+blast-related+brain+injury.">Pathology of blast-related brain injury.</a> J Rehabil Res Dev. 46 (6), 667-671 (2009).</li><li>Bass, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+Injuries+from+Blast.">Brain Injuries from Blast.</a> Ann Biomed Eng. 40 (1), 185-202 (2012).</li><li>Cernak, I., Kobeissy, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+Neurotrauma:+Molecular,+Neuropsychological,+and+Rehabilitation+Aspects.">Brain Neurotrauma: Molecular, Neuropsychological, and Rehabilitation Aspects.</a> Frontiers in Neuroengineering. , (2015).</li><li>Alfieri, K. A., Forsberg, J. A., Potter, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blast+injuries+and+heterotopic+ossification.">Blast injuries and heterotopic ossification.</a> Bone Joint Res. 1 (8), 174-179 (2012).</li><li>Potter, B. K., Burns, T. C., Lacap, A. P., Granville, R. R., Gajewski, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterotopic+Ossification+Following+Traumatic+and+Combat-Related+Amputations.+Prevalence,+Risk+Factors,+and+Preliminary+Results+of+Excision.">Heterotopic Ossification Following Traumatic and Combat-Related Amputations. Prevalence, Risk Factors, and Preliminary Results of Excision.</a> J Bone Joint Surg Am. 89 (3), 476-486 (2007).</li><li>Sasser, S. M., Sattin, R. W., Hunt, R. C., Krohmer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blast+Lung+Injury.">Blast Lung Injury.</a> Prehosp Emerg Care. 10 (2), 165-172 (2006).</li><li>Cho, S. -. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+Hearing+Loss+after+Blast+Injury+to+the+Ear.">Mechanisms of Hearing Loss after Blast Injury to the Ear.</a> PLoS ONE. 8 (7), 67618 (2013).</li><li>Bull, M. A., Clasper, J., Mahoney, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Blast Injury Science and Engineering: A Guide for Clinicians and Researchers. , (2016).</li><li>Arun, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+blast+traumatic+brain+injury+using+in-vitro+model+with+shock+tube.">Studies on blast traumatic brain injury using in-vitro model with shock tube.</a> Neuroreport. 22 (8), 379-384 (2011).</li><li>Ahlers, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+the+effects+of+acute+and+repeated+exposure+to+blast+overpressure+in+rodents:+toward+a+greater+understanding+of+blast+and+the+potential+ramifications+for+injury+in+humans+exposed+to+blast.">Assessment of the effects of acute and repeated exposure to blast overpressure in rodents: toward a greater understanding of blast and the potential ramifications for injury in humans exposed to blast.</a> Front Neurol. 3, 32 (2012).</li><li>Polfer, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+a+rat+model+to+investigate+the+formation+of+blast-related+post-traumatic+heterotopic+ossification.">The development of a rat model to investigate the formation of blast-related post-traumatic heterotopic ossification.</a> Bone Joint J. 97 (4), 572-576 (2015).</li><li>Miller, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Blast+Overpressure+on+Neurons+and+Glial+Cells+in+Rat+Organotypic+Hippocampal+Slice+Cultures.">Effects of Blast Overpressure on Neurons and Glial Cells in Rat Organotypic Hippocampal Slice Cultures.</a> Front Neurol. 6, 20 (2015).</li><li>Chandra, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+blast+wave+profiles+in+simulated+air+blasts:+experiment+and+computational+modeling.">Evolution of blast wave profiles in simulated air blasts: experiment and computational modeling.</a> Shock Waves. 22 (5), 403-415 (2012).</li><li>Kuriakose, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tailoring+the+Blast+Exposure+Conditions+in+the+Shock+Tube+for+Generating+Pure,+Primary+Shock+Waves:+The+End+Plate+Facilitates+Elimination+of+Secondary+Loading+of+the+Specimen.">Tailoring the Blast Exposure Conditions in the Shock Tube for Generating Pure, Primary Shock Waves: The End Plate Facilitates Elimination of Secondary Loading of the Specimen.</a> PLoS ONE. 11 (9), 0161597 (2016).</li><li>Reneer, D. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Multi-Mode+Shock+Tube+for+Investigation+of+Blast-Induced+Traumatic+Brain+Injury.">A Multi-Mode Shock Tube for Investigation of Blast-Induced Traumatic Brain Injury.</a> J Neurotrauma. 28 (1), 95-104 (2011).</li><li>VandeVord, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Up-regulation+of+reactivity+and+survival+genes+in+astrocytes+after+exposure+to+short+duration+overpressure.">Up-regulation of reactivity and survival genes in astrocytes after exposure to short duration overpressure.</a> Neurosci Lett. 434 (3), 247-252 (2008).</li><li>Kane, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+gene+expression+in+cultured+microglia+in+response+to+simulated+blast+overpressure:+Possible+role+of+pulse+duration.">Altered gene expression in cultured microglia in response to simulated blast overpressure: Possible role of pulse duration.</a> Neurosci Lett. 522 (1), 47-51 (2012).</li><li>Nienaber, M., Lee, J. S., Feng, R., Lim, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impulsive+pressurization+of+neuronal+cells+for+traumatic+brain+injury+study.">Impulsive pressurization of neuronal cells for traumatic brain injury study.</a> J Vis Exp. (56), (2011).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+Profiling+in+Rat+Hair+Follicles+following+Simulated+Blast+Insult:+A+New+Diagnostic+Tool+for+Traumatic+Brain+Injury.">Transcriptional Profiling in Rat Hair Follicles following Simulated Blast Insult: A New Diagnostic Tool for Traumatic Brain Injury.</a> PLoS ONE. 9 (8), 104518 (2014).</li><li>Bo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+characterization+of+compression-induceddamage+in+live+biological+samples.">Cellular characterization of compression-induceddamage in live biological samples.</a> AIP Conf Proc. 1426 (1), 153-156 (2012).</li><li>Tannous, O., Griffith, C., O'Toole, R. V., Pellegrini, V. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterotopic+ossification+after+extremity+blast+amputation+in+a+Sprague-Dawley+rat+animal+model.">Heterotopic ossification after extremity blast amputation in a Sprague-Dawley rat animal model.</a> J Orthop Trauma. 25 (8), 506-510 (2011).</li><li>Chen, Y. C., Smith, D. H., Meaney, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-Vitro+Approaches+for+Studying+Blast-Induced+Traumatic+Brain+Injury.">In-Vitro Approaches for Studying Blast-Induced Traumatic Brain Injury.</a> J Neurotrauma. 26 (6), 861-876 (2009).</li><li>Nguyen, T. T. N., Wilgeroth, J. M., Proud, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+blast+wave+generation+in+a+shock+tube+for+biological+applications.">Controlling blast wave generation in a shock tube for biological applications.</a> JPCS. 500 (14), 142025 (2014).</li></ol>

Författarna har ingen konkurrerande finansiella intressen.

Primära skador från exponering för blast händelser är ännu inte helt klarlagda. Att identifiera och förstå de mekanismer som utlöser blast-inducerade skador, till exempel traumatiska hjärnan skada3,är4 och heterotopisk ossifikation6,7, viktiga första steg för att utveckla effektiva metoder för profylax. För att uppnå detta mål har har ett antal experimentella system utvecklats för att replikera blast händelse exponering11,12,13,14,18,19 . Den teknik som beskrivs använder här shock tube utrustning (figur 2) kan avfyra chockvågor vid en rad påfrestningar på hela kroppen (dvs. gnagare), vävnad eller cellprover. Möjligheten att ladda enskilda celltyper i stället för hela vävnader ger möjlighet att tolka ut olika cellulära svar, eftersom skador kan uppstå samtidigt via en rad mekanismer1,2. Till exempel för att modellera traumatisk kan hjärnskada, bedömning av enskild celltyper, såsom nervceller och astrocyter tillåta för identifiering av cell-specifika skada. Också, hela-orgel svaret kan bedömas med hjälp av hjärnvävnad. Både de enskilda celltyper och vävnadsprover har värde och kan ge olika information. Det är också möjligt att ändra mängden luft som är trycksatt att generera chocken genom att välja dubbel-sätesbjudning eller drivrutin-slang inlopp. Detta styr varaktigheten av stötvågen. En annan möjlighet är att ändra membran material och tjocklek för att förändra de peak tryck25.
En annan faktor att beakta är störningar slutet effekter som kan vara närvarande när provet bostäder ligger nära avfarten till chock röret, som hittade på EVOC riggen beskrivs i det nuvarande systemet. Chandra o.a. tittade på blast våg profiler finns på olika platser på en komprimering-driven signalledares och fann att Friedlander vågformen var bäst representerade på en plats djupt inom shock tube15. Sams o.a. även studerade sekundär lastning av provet och fann att placeringen av en Ändplatta slutet av chocken röret kunde eliminera oönskade reflekterade vågor16. Med tanke på uppgifterna som finns i dessa publikationer15,16, framtida ändringar för att förbättra shock tube systemet beskrivs i denna artikel kan innebära placering av EVOC riggen på en djupare plats inom det drivna röret eller, Alternativt, införandet av en endplate på chocken röret. Begränsningar av den beskrivna metoden kan innehålla relativt låg genomströmning av prover. En användare kan styra chocken röret säkert på en produktion av runt 6-8 prover per timme. För närvarande är systemet utformat kring användningen av enda 35 mm petriskålar. Därför kan större experiment som innehåller flera grupper och biologiska replikat vara svårt att uppnå.
Denna artikel om metoder visar hur livskraften hos vidhäftande dermal papilla celler påverkades av exponering för en enda chockvåg. En kortvarig stötvåg (&#60; 10 ms) av ≤72 kPa påverkade inte lönsamhet jämfört med kontroll (figur 3 och figur 4). Däremot stimuleras en chockvåg 127 kPa en betydande nedgång i lönsamheten på 24 h efter blast, som framgår av både en redox indikator assay (figur 3) och fluorescerande bildanalys (figur 4). Miller et al. rapporterade en liknande minskning i cellernas viabilitet i råtta organotypic Hippocampus slice kulturer när celler utsattes för antingen en 147 kPa eller 278 kPa chockvåg med hjälp av en öppen, helium-driven shock tube14. Däremot VandeVord et al. rapporterade att det fanns ingen effekt på lönsamheten i råtta astrocyter utsätts för en kortvarig övertryck av &#62; 200 kPa, även om en barochamber användes snarare än en shock tube18. Det bör noteras att yttre trycket är beroende av tryckvågor, även om detta skapar komplexa stress vågor i kroppen, vilket gör arten av lastningen mycket beroende av de mekaniska egenskaperna hos de vävnader eller celler. Det krävs ytterligare karakterisering studier av cellulära svar till blast händelser. Dessutom genom att bedöma chockvåg exponering på cellnivå, som visas i denna teknik, kan biologiska svar aktiveras från skadan, såsom störning av signalering vägar eller epigenetiska förändringar, identifieras och utforskas ytterligare.
Avslutningsvis beskriver detta arbete användningen av ett rostfritt stål signalledares och en modifierad EVOC rigg att införliva primära cellkulturer. Chockvågor vid en rad påfrestningar kan genereras och sprids över levande celler replikera de effekter som uppstår från exponering för en tryckvågor. Detta protokoll visar hur man utvärderar cellernas viabilitet, men långsiktiga förändringar av enskilda celltyper kan också studeras. Framöver planerar vi att bedöma de differentiella effekter som komplexa chockvågor kan framkalla i olika celltyper, med syftet att främja förståelsen av blast-inducerad primära skador.

Med den senaste trenden mot användningen av spränganordningar i modern warfare och terroraktioner mot civila, förstå effekterna av explosiva händelserna på den mänskliga kroppen är av stor betydelse. Skador som erhållits genom exponering för blast händelser kan vara dödliga och dödliga, med de fysikaliska processerna för skador delas in i fyra kategorier. Primära skador resultat från direkt exponering för de tryckvågor, som samverkar lokalt med kroppen i en tryckkraft och därefter expansiva sätt, orsakar störningar av membran och mjukdelar1. Sekundära skador inkluderar trubbigt trauma eller penetrerande sår orsakade av påverkan med låg massa föremål med hög hastighet som drivs av tryckvågor. Tertiär skador uppstå när tryckvågor har tillräcklig energi för att kasta föremål av hög massa eller individer mot föremål. Slutligen definieras Kvartära blast skador av andra Diverse skador som inte passar i andra kategorier, såsom flash burns2. Efter exponering för sådana blast händelser inkluderar primära skador traumatisk hjärnan skada3,4,5, heterotopisk ossifikation6,7, blast lung skada8, förlust av hörsel 9, och andra10.
En vanligt förekommande vågform från blast händelser är den Friedlander våg, som representerar en gratis-fältet, i motsats till ett bifogat-utrymme, explosion. Vågformen består av en blast front som kan definieras som en skarp och snabb ökning av övertryck. Detta följs av en blast vind av luften rör sig med hög hastighet och en release-våg som minskar trycket till under atmosfäriska nivåerna. Ett partiellt vakuum är kvar i regionen i den inledande explosion, vilket resulterar i långsam återflödet av luft. Positiva och negativa faser av vågen (figur 1A) resultera i push-pull rörelsen av blast våg1. För att klarlägga mekanismerna bakom primära blast skador, har experimentella modeller skapats för att producera vågformer, såsom Friedlander vågen, som celler och vävnader kommer att möta när de utsätts för en verklig blast händelse. Nuvarande system som anges i litteraturen inkludera chock rör11,12,13,14,15,16,17, barochambers18,19, Kolsky bar20, avancerade blast simulatorer21, Split Hopkinson tryck bar22och rekreation av alternativa blast händelser i en kontrollerad miljö använder pentaerytritol tetranitrate23. Trots det breda utbudet av modeller tillgängliga påverkar många variabler den skada som erhållits från blast vågor, inklusive före stress tillämpas på, och de mekaniska egenskaperna av typer av enskilda celler eller vävnader enligt utvärdering24. Medan studiet av vävnad eller organ kan belysa vävnad deformation och brutto morfologiska förändringar som uppkommit till följd av blast händelser, kan analys på cellulär nivå avslöja transkriptionell och epigenetiska förändringar som påverkas av stötvågen.
Metoder beskrivs en teknik för att sprida chockvågor vid en rad tryck över levande celler i en enskiktslager. Detta möjliggör omedelbar karakterisering av cellernas viabilitet, belysa potentiella skador tröskelvärden från chockvågor. Dessutom viabla celler kan återlämnas till standard odlingsbetingelser och långsiktiga biologiska effekter från händelsen blast kan bedömas. Protokollet nedan beskriver två cell livskraft tekniker som kan användas på celler i kultur.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55618/55618fig1.jpg"> 
Figur 1: Tillnärmning av en Friedlander våg. (A) en approximation av en Friedlander våg observerades vid sensor 3 på chocken röret. (B) representativa uppgifter visar olika tryck profilerna observerades vid sensorer 1, 2 och 3 på chocken röret. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55618/55618fig1large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1124">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td>MEM &#945;, nucleosides</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>22571020</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>Fetal Bovine Serum, certified, US origin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>16000044</td>
			<td>Supplement to create complete growth media.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>Penicillin-Streptomycin&#160;</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15070-063</td>
			<td>Supplement to create complete growth media.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15400-054</td>
			<td>Dilute 1 in 10 before use.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>CytoOne T-75 Flask, TC-Treated, vented</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>CC7682-4875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>TC Dish (PS) 35mm, 8.5 cm2</td>
			<td>Triple Red</td>
			<td>TCD010035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>Petri dish (PS) 90x14.2mm no vent</td>
			<td>VWR UK</td>
			<td>391-0453&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>Gas Permeable Adhesive Plate Seals</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AB-0718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>LIVE/DEAD Cell Imaging Kit (488/570)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>R37601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>Alamarblue cell viability reagent</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13494309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>Virkon tablets</td>
			<td>VWR UK</td>
			<td>115-0020</td>
			<td>Use to create 2% solution as viability control reagent.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>Dumont forceps</td>
			<td>SurgicalTools</td>
			<td>11295-10</td>
			<td>Use to remove coverslips from petri dish.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>Cover glass, square</td>
			<td>VWR UK</td>
			<td>631-0125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>Microscope slides</td>
			<td>VWR UK</td>
			<td>631-1553</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>96 Well plate, solid black</td>
			<td>AppletonWoods</td>
			<td>CC760</td>
			<td>Plate to be used for fluorescence measurements.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>96 Well plate, clear, (PS)</td>
			<td>VWR UK</td>
			<td>734-1799</td>
			<td>Plate to be used for absorbance measurments.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>Leica DMi1 Camera stand outfit</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td>Optical microscope used for cell culture.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>Zeiss PALM MicroBeam Laser Capture Microdisseciton</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Fluorescence microsope used for LIVE/DEAD imaging.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>EnVision Multilabel Reader</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>2104-0010A</td>
			<td>Plate reader to be used for fluorescence/absorbance readings.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td>Mylar Electrical &#38; Chemical Insulating Film, 304mm x 200mm x 0.023mm&#160;</td>
			<td>RS Components</td>
			<td>785-0782</td>
			<td>Use to create shock tube diaphragm.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td>Mylar Electrical &#38; Chemical Insulating Film, 304mm x 200mm x 0.05mm&#160;</td>
			<td>RS Components</td>
			<td>785-0786</td>
			<td>Use to creatw shock tube diaphragm.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td>Mylar Electrical &#38; Chemical Insulating Film, 304mm x 200mm x 0.125mm&#160;</td>
			<td>RS Components</td>
			<td>785-0798</td>
			<td>Use to create shock tube diaphragm.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>Current source power unit</td>
			<td>Dytran Intruments Inc.</td>
			<td>4103C</td>
			<td>Power source for 2300V1 sensor.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>IEPE Pressure Sensor</td>
			<td>Dytran Intruments Inc.</td>
			<td>2300V1</td>
			<td>Pressure sensor located on shock tube.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>Digital Phosphor Oscilloscope</td>
			<td>Tektronix</td>
			<td>DPO 4104B</td>
			<td>Use to gather and save sensor 2300V1 data.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluating primary blast effects in vitro

Exponering för blast händelser kan orsaka svåra trauman till vitala organ såsom lungor, öronen och hjärnan. Förstå mekanismerna bakom sådana blast-inducerade skador är av stor betydelse med tanke på den senaste trenden med användning av sprängämnen i modern warfare och terrorist-relaterade incidenter. För att fullt förstå blast-inducerad skada, måste vi först kunna replikera sådana blast händelser i en kontrollerad miljö med en reproducerbar metod. Denna teknik använder shock tube utrustning, chockvågor vid en rad påfrestningar kan spridas över levande celler odlas i 2D och markörer för cellviabilitet omedelbart kan analyseras med hjälp en redox indikator analysen och de fluorescerande avbildning av levande och döda celler. Denna metod visade att öka det maximala blast övertrycket till 127 kPa kan stimulera en betydande nedgång i cellernas viabilitet jämfört med obehandlade kontroller. Prover är inte begränsade till vidhäftande celler, men kan inkludera cellsuspensioner, hela kroppen och vävnad prover, genom smärre ändringar till shock tube setup. Det är svårt att replikera de exakta villkor att vävnader och celler upplever när de utsätts för en verklig blast händelse. Tekniker såsom den presenteras i denna artikel kan hjälpa att fastställa skada tröskelvärden och identifiera de transkriptionell och epigenetiska förändringarna i celler som uppstår från chockvåg exponering.

Celler odlade i en enskiktslager använder metoden som beskrivs ovan, och utsattes i tre exemplar till chockvågor genereras med hjälp av en shock tube (figur 2B). Markörer för cellviabilitet bedömdes. Använder en redox indikator assay, konstaterades det att tillämpningen av en 127 kPa chockvåg kunde avsevärt minska lönsamheten för dermal papilla celler jämfört kontroller efter 24 h i kultur (figur 3). Tillämpningen av en chockvåg ≤72 kPa minska inte lönsamheten. För att stödja dessa observationer, användes en fluorescerande bild analys kan fluorescently märkning levande eller döda celler med grön eller röd fluorophores, respektive. Kvantifiering av levande och döda celler från 13 fluorescerande bilder per biologiska replikat uppvisade en minskning i cellernas viabilitet hos dem som utsätts för 127 kPa stötvågen jämfört med kontroll (figur 4). Statistisk analys utfördes med en envägs ANOVA följt av Tukeys flera jämförande test, med p &#60; 0,05 anses statistiskt signifikant. Urvalets storlek per grupp uppgick till 9 för redox indikator analysen och 39 för den kvantitativa fluorescens bildanalys.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55618/55618fig3.jpg"> 
Figur 3 : Redox indikator Assay Data visar tidsförloppet för cellviabilitet efter chockvåg exponering. Signifikant observerades färre celler efter 24 h i 127-kPa stötvåg-exponerade gruppen jämfört med den obehandlade kontrollen. Den negativa kontrollen som bestod av en 30-s behandling med 2% desinfektionsmedel (se tabell av material) visade signifikant färre celler både T0 och 24 h jämfört med alla andra grupper. Varje stapel representerar medelvärde ± 1 standardavvikelsen (SD); biologiska replikat, N = 3; tekniska replikerar, n = 3. = p &#60; 0,0001. * = p &#60; 0,05. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55618/55618fig3large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55618/55618fig4.jpg"> 
Figur 4 : Fluorescens Imaging. (A) kvantitativa data insamlade från fluorescerande bilder av levande och döda celler fångas med fluorescens Mikroskop på 24 h efter chockvåg exponering. Betydligt färre viabla celler observerades i de 127 kPa (menar = 93.42) chock våg-exponerade prov jämfört med den 47 kPa (menar = 98,18), 72 kPa (menar = 98.87), och kontrollerar grupper (menar = 99,10). På den negativa kontrollgruppen observerades ingen viabla celler efter 24 h (menar = 0). (B) representativa fluorescens bilder. Grönt visar levande celler, medan rött visar döda celler. Varje lådagram visar de övre och nedre kvartiler med Tukey polisonger; biologiska replikat, N = 3; tekniska replikerar, n = 13. = p &#60; 0,0001. Skalstapeln = 300 µm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55618/55618fig4large.jpg" target="_blank">vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Evaluating Primary Blast Effects In Vitro at JoVE.com

Evaluating Primary Blast Effects In Vitro

Förstå hur celler moduleras av exponering för chockvågor kan hjälpa till att identifiera mekanismerna bakom skador utlöses från blast händelser. Detta protokoll använder specialbyggda shock tube utrustning ska gälla cell enskiktslager chockvågor vid en rad påfrestningar och identifiera de efterföljande effekterna på cellernas viabilitet.

Utvärderande primära Blast effekter In Vitro

Exposure to blast events can cause severe trauma to vital organs such as the lungs, ears, and brain. Understanding the mechanisms behind such ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Evaluating Primary Blast Effects In Vitro

Microfluidic Device for Recreating a Tumor Microenvironment in Vitro

Microfluidic Device for Recreating a Tumor Microenvironment in Vitro

Mikroflödessystem enhet för att återskapa en tumör mikromiljö<em&gt; In vitro</em

We have developed a microfluidic device that mimics the delivery and systemic clearance of drugs to heterogeneous three-dimensional tumor tissues in ...

Low Molecular Weight Protein Enrichment on Mesoporous Silica Thin Films for Biomarker Discovery

Låg molekylvikt protein Anrikning av mesoporösa kvarts tunna filmer för biomarkörer

The identification of circulating biomarkers holds great potential for non invasive approaches in early diagnosis and prognosis, as well as for the ...

Harvesting Murine Alveolar Macrophages and Evaluating Cellular Activation Induced by Polyanhydride Nanoparticles

Skörd Murina alveolära makrofager och utvärdera cellulär aktivering inducerad av polyanhydrid Nanopartiklar

Biodegradable nanoparticles have emerged as a  versatile platform for the design and implementation of new intranasal vaccines  against respiratory ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

Ögonirritationstest (EIT) för Hazard Identifiering av Eye irriterande kemikalier med hjälp av rekonstruerad Human Cornea liknande Epithelial (RHCE) Tissue Modell

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Mikroflödes Flow Chambers Använda Beredd blod till modell Hemostas och trombocyttransfusion<em&gt; In Vitro</em

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of ...

Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

tillämpningar av<em&gt; In Vivo</em&gt; Provning av Rat tibialis anterior för utvärdering vävnadstekniska skelettmuskulatur Repair

Despite the regenerative capacity of skeletal muscle, permanent functional and/or cosmetic deficits (e.g., volumetric muscle loss (VML) resulting from ...

A Microfluidic Flow Chamber Model for Platelet Transfusion and Hemostasis Measures Platelet Deposition and Fibrin Formation in Real-time

En mikroflödessystem Flow avdelningen modell för Platelet Transfusion och Hemostas Åtgärder blodplättbeläggning och fibrinbildning i realtid

Microfluidic models of hemostasis assess platelet function under conditions of hydrodynamic shear, but in the presence of anticoagulants, this analysis is ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

En<em&gt; In Vitro</em&gt; Organ Kultur Modell av murina mellankotskivan

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

Förbättrad 3D Hydrogel kulturer av primära gliaceller för In Vitro modellering av Neuroinflammation

In the central nervous system, numerous acute injuries and neurodegenerative disorders, as well as implanted devices or biomaterials engineered to enhance ...

Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart

Ljus-ark fluorescensmikroskopi att fånga 4-dimensionella bilder av effekterna av modulerande skjuvspänningen på utveckla zebrafiskar hjärtat

The hemodynamic forces experienced by the heart influence cardiac development, especially trabeculation, which forms a network of branching outgrowths ...